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유리 뉴클레오티드의 변형

유리 뉴클레오티드의 변형



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우리는 RNA가 전사 후 변형될 수 있다는 것을 알고 있습니다(RNA 변형). 따라서 RNA가 분해될 때 이러한 변형이 개별 뉴클레오타이드에 여전히 존재하여 뉴클레오타이드가 다른 RNA를 구성하기 위해 재활용될 때 이러한 변형이 지속되는 것이 가능합니까?


뉴클레오티드

뉴클레오티드는 DNA와 RNA의 빌딩 블록인 유기 분자입니다. 그들은 또한 세포 신호, 대사 및 효소 반응과 관련된 기능을 가지고 있습니다. 뉴클레오티드는 인산기, 탄소 5개 당, 질소 염기의 세 부분으로 구성됩니다. DNA의 네 가지 질소 염기는 아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민입니다. RNA에는 티민 대신 우라실이 들어 있습니다. 사슬 내의 뉴클레오티드는 알려진 모든 생물의 유전 물질을 구성합니다. 그들은 또한 메신저 및 에너지 이동 분자로서 유전 정보 저장 외부의 여러 기능을 수행합니다.

DNA 내의 일련의 3개의 뉴클레오티드는 코돈, 그리고 세포 내의 단백질이 DNA의 나머지 부분에 의해 지정된 시리즈에 특정 단백질을 부착하도록 지시합니다. 특수 코돈은 프로세스를 중지하고 시작할 위치를 기계에 지정하기도 합니다. DNA 번역알려진 바와 같이, DNA의 정보를 단백질의 언어로 변환합니다. 이 아미노산 사슬은 적절하게 접혀서 세포 내에서 많은 기능 중 하나를 제공할 수 있습니다.


RNA 처리의 조절

진핵생물 유전자가 핵에서 전사될 때 1차 전사체(갓 만들어진 RNA 분자)는 아직 전령 RNA로 간주되지 않습니다. 대신 pre-mRNA라고 하는 미성숙한 분자입니다.

pre-mRNA는 핵을 떠나 번역될 수 있는 성숙한 mRNA 분자가 되기 위해 몇 가지 수정을 거쳐야 합니다. 여기에는 스플라이싱, 캡핑 및 폴리 A 테일 추가가 포함되며, 이 모두는 잠재적으로 규제될 수 있습니다. 속도를 높이거나 늦추거나 변경하여 다른 제품을 만들 수 있습니다.

대체 접합

대부분의 pre-mRNA 분자에는 분자에서 제거된 부분이 있습니다. 인트론, 그리고 최종 mRNA를 만들기 위해 연결되거나 함께 연결된 섹션, 엑손. 이 과정을 접합.

의 과정에서 대체 접합, mRNA의 다른 부분은 엑손으로 사용하기 위해 선택될 수 있습니다. 이것은 2개(또는 그 이상)의 mRNA 분자 중 하나가 하나의 pre-mRNA에서 만들어지도록 합니다.

그림 1. OpenStax College, Biology(CC BY 3.0)에 의해 “Eukaryotic Post-transcriptional Gene Regulation,”에서 수정된 이미지.

대체 접합은 무작위 프로세스가 아닙니다. 대신 일반적으로 조절 단백질에 의해 제어됩니다. 단백질은 pre-mRNA의 특정 부위에 결합하고 어떤 엑손을 사용해야 하는지 스플라이싱 인자를 알려줍니다. 다른 세포 유형은 다른 조절 단백질을 발현할 수 있으므로 각 세포 유형에서 다른 엑손 조합을 사용할 수 있어 다른 단백질을 생산할 수 있습니다.


1.4 DNA 변형 효소

  • 제공: Michael Blaber
  • 플로리다 주립대학교 교수(생물의학)

메틸라제

박테리아 제한 변형 시스템에 대한 연구가 다양한 특정 엔도뉴클레아제를 제공한 것처럼 다양한 특정 DNA 메틸라아제도 이용 가능합니다.

  • 메틸라제의 인식 서열은 연관된 엔도뉴클레아제와 동일하다(예를 들어 EcoR1 메틸라제는 서열 "GAATTC"에서 인식하고 메틸화한다).
  • 모든 메틸라아제는 S-아데노실메티오닌(SAM)의 메틸기를 인식 서열의 특정 염기로 이동시키며, SAM은 메틸화 반응의 필수 성분입니다.
  • DNA의 메틸화는 일반적으로 관련된 제한 엔도뉴클레아제로부터 DNA를 보호하는 효과가 있습니다. 그러나 최소한의 특이성을 가진 메틸라아제가 있습니다. 예를 들어, Sss I 메틸라제 시퀀스 5' &hellip CG &hellip 3'에서 시토신 잔기를 메틸화합니다. 이 경우, 메틸화된 DNA는 다양한 제한 엔도뉴클레아제로부터 보호됩니다..
  • 일부 제한 엔도뉴클레아제는 DNA가 ~이다 메틸화(예: Dpn I).
  • 또 다른 제한 엔도뉴클레아제는 둘 다 인식 서열에서 메틸화 및 비메틸화 DNA(예: BamHI).

댐 그리고 DCM 메틸화

  • 에 의해 암호화된 메틸라아제 유전자(dam methylase)는 SAM에서 N으로 메틸기를 전달합니다.6 시퀀스 5' &hellip GATC &hellip 3'에서 아데닌 염기의 위치.
  • 에 의해 암호화되는 메틸라아제 DCM 유전자(dcm methylase)는 C에서 내부 시토신 염기를 메틸화합니다.5 위치, 시퀀스 5' &hellip CCAGG &hellip 3' 및 5' &hellip CCTGG &hellip 3'.
  • 거의 모든 변종 대장균 일반적으로 복제에 사용되는 +DCM+ 유전자형. 여기서 요점은 ~ 아니다 우리는 특히 DNA가 메틸화되기를 원하지만 댐-dcm- 숙주는 박테리아를 돌연변이시키고 올바른 돌연변이를 분리해야 합니다. 그것은 분명히 많은 박테리아 균주에 대해 수행되지 않았습니다. 아마 때문에 그리고 DCM 메틸화는 잠재적인 제한 엔도뉴클레아제의 작은 부분집합에만 영향을 미칩니다.

에서 분리된 DNA 댐+DCM+ 균주 실제로 잘리지 않습니다 이용 가능한 제한 엔도뉴클레아제의 적당한 부분집합에 의해:

인식 순서 제한효소 GATC 지 미 ATC
떼가트카 Bcl I + -
GATC 음보 I + -
ATCGAT 클라 I + -
TCTAGA X바 나 + -
TCGA 탁 I + -
가가 음보 II + -
GGTGA 헉 나 + -

DNA는 이러한 효소에 의해 절단되기 위해 dam-dcm-인 E. coli 균주로부터 준비되어야 할 수 있습니다.

DNA 중합효소

다양한 중합효소가 특성화되었으며 상업적으로 이용 가능합니다. 모든 DNA 중합효소는 두 가지 일반적인 특성을 공유합니다.

  1. 그들은 뉴클레오타이드를 3'-OH 말단 입문서
  2. 초기 폴리뉴클레오타이드에서 뉴클레오타이드의 순서는 다음과 같습니다. 템플릿 지시

그림 1.4.1:DNA 복제

5'->3' 중합효소 활성에 더하여 중합효소는 엑소뉴클레아제 활성을 포함할 수 있습니다. 이 엑소뉴클레아제 활성은 5'->3' 방향 또는 3'->5' 방향으로 진행될 수 있다.

  • 3'->5' 방향의 엑소뉴클레아제 활성은 폴리머라제가 잘못된 뉴클레오티드를 포함하는 경우 오류를 수정하도록 허용합니다(소위 "오류 수정 활동"). 또한 프라이머의 3' 말단을 천천히 분해할 수 있습니다..
  • 5'->3' 방향의 엑소뉴클레아제 활성은 마주칠 수 있는 다른 혼성화된 프라이머를 분해하도록 합니다. 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 없으면 사용 중인 폴리머라제에 따라 차단 프라이머가 물리적으로 대체되거나 대체되지 않을 수 있습니다.

중합효소에 따라 잘못된 혼입 오류율과 중합율이 다릅니다.

대장균 DNA 중합효소 I E. coli DNA 중합효소 I - Klenow 단편 T4 DNA 중합효소 T7 DNA 중합효소 Taq DNA 중합효소 M-MuLV 역전사효소
5'->3' 엑소뉴클레아제 활성 * *
3'->5' 엑소뉴클레아제 활성 * * * *
오류율(x10 -6 ) 9 40 <1 15 285
가닥 변위 *
열 비활성화 * * * *

중합효소의 사용

다양한 중합효소의 다양한 활동으로 인해 다양한 응용이 가능합니다. 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제는 3' 또는 5' 뉴클레오티드 "돌출부"를 갖는 DNA 단편을 생성할 수 있습니다.

  • 5' 돌출부의 경우 5'->3' 중합효소 활성이 이를 채워서 무딘 끝.
  • 3' 돌출부의 경우, 일부 폴리머라제(특히 T4 DNA 폴리머라제)에 존재하는 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 이 말단을 "추적(chew back)"하여 무딘 말단 DNA 단편도 만들 수 있습니다.

그림 1.4.2:중합효소 활성

"별명 번역"

이 방법은 일부 중합효소에 존재하는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는 고도로 방사성 표지된 단일 가닥 DNA 단편을 얻는 데 사용됩니다.대장균 예를 들어, DNA 중합효소 I).

  • 이 방법에서 관심 있는 DNA 이중체는 "닉(nicking)"됩니다(즉, 가닥 중 하나가 절단되어 DNAse I 참조).
  • 그런 다음 DNA pol I이 방사성 표지된 뉴클레오티드와 함께 추가됩니다. 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성은 "닉" 부위에서 5' 말단을 씹어 버리고 폴리머라아제 활성은 방사성 표지된 뉴클레오티드를 포함한다. 생성된 폴리뉴클레오티드는 고도로 방사성 표지되어 관심 DNA 서열에 혼성화됩니다.

그림 1.4.3:별명 번역

  • 열안정성 중합효소는 DNA 이중체가 실제로 "녹고" 분리되는 온도 범위에서 기능을 유지하는 능력이 있습니다. 이를 통해 "중합효소 연쇄반응" 기술(PCR)은 현대 생명공학에 지대한 영향을 미쳤습니다. 이 방법에 대해서는 나중에 논의할 것입니다.
  • 디데옥시 염기의 결합(즉, 리보스 당의 2' 또는 3' 탄소에 히드록실기가 없음)은 중합효소 반응의 종결. 이것은 나중에 더 자세히 논의될 것입니다. 그러나 디데옥시뉴클레오타이드의 통합에 의한 이러한 사슬 종결은 DNA 시퀀싱의 Sanger 방법과 바이러스 복제를 억제하기 위한 치료법의 기초입니다.

뉴클레아제

뉴클레아제 BAL-31

  • 이것은 엑소이중 가닥 DNA의 3' 말단과 5' 말단을 모두 분해하는 뉴클레아제(말단에서 시작하여 안쪽으로 작용). 내부 절단("닉")을 만들지는 않지만 기존의 내부 "닉"(3' 및 5' 말단을 모두 생성)에서 DNA 말단을 분해합니다.
  • 터미널의 열화는 조정되지 않습니다. 즉, 제품이 ~ 아니다 100% blunt-ended(원래 듀플렉스가 blunt-ended일 수 있음에도 불구하고).
  • 이러한 "래그(ragged)" 말단은 적당한 중합효소(예: T4 DNA 중합효소)를 채우고 다시 씹어서 무디게 만들 수 있습니다. 1 단위의 단위 정의는 30 °C에서 10분 동안 이중 가닥 DNA의 각 말단에서 200개의 염기쌍을 제거하는 데 필요한 효소의 양입니다.

그림 1.4.4:뉴클레아제 BAL-31 활성

엑소뉴클레아제 III

  • 이중 DNA의 3' 하이드록실 말단에서 뉴클레오티드의 단계적 제거를 촉매합니다.
  • 효소는 뭉툭한 말단, 5' 돌출부 또는 내부 "닉"이 있는 이중 가닥 DNA에서 3' 하이드록실을 공격합니다.
  • 이중 DNA가 필요하기 때문에 효소 ~하지 않을 것이다 말단이 3' 돌출부인 이중체 DNA의 3' 말단을 소화하십시오.

그림 1.4.5:엑소뉴클레아제 III 활성

녹두 뉴클레아제(녹두 콩나물에서 분리)

  • NS 단일 가닥 특정 DNA 및 RNA 말단에서 단일 가닥 연장을 분해하여 뭉툭한 말단을 남기는 DNA 및 RNA 엔도뉴클레아제.
  • 단일 가닥 확장은 5' 또는 3' 확장이 될 수 있습니다. 둘 다 제거되고 둔한 이중체가 남습니다.

그림 1.4.6:녹두 뉴클레아제 활성

소 췌장의 데옥시리보뉴클레아제 I(DNAase I)

  • 이 효소는 phosphodiester 결합 5'에서 이중 또는 단일 DNA 가닥을 우선적으로 가수분해합니다. 피리미딘 뉴클레오티드
  • Mg 2+ 이온이 있는 경우 DNAse I은 각 가닥을 독립적으로 공격하고 무작위 방식으로 nick을 생성합니다(nick-translation에 유용).
  • Mn2+ 이온 DNAse I의 존재 하에서 거의 동일한 위치에서 DNA의 두 가닥 모두 절단

리가제

  • 리가아제는 형성 병치된 5' 포스페이트와 뉴클레오티드의 3' 히드록실 말단 사이의 포스포디에스테르 결합(ligase에 따라 RNA 또는 DNA일 수 있음).
  • 어떤 의미에서는 제한 엔도뉴클레아제의 반대 개념이지만 국부 서열의 영향을 받지 않는 것으로 보이며, 그 자체로.
  • 리가제 필요 보조 인자로서 rATP 또는 NAD+, 그리고 이것은 제한 엔도뉴클레아제와 대조됩니다.

다음은 다양한 유형의 리가아제와 그 특성입니다.

T4 DNA 리가제

  • 박테리오파지 T4에서 분리.
  • 이중 DNA 또는 RNA의 끝을 연결합니다.
  • 이 효소는 끝이 뭉툭한 말단뿐만 아니라 응집력 있는(상보적) 돌출된 말단(3' 또는 5' 상보적 돌출부)으로 말단을 연결합니다.
  • 이 효소는 또한 이중 가닥 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 이중 가닥의 단일 가닥 닉을 복구합니다. 필요 ATP 보조 인자로.

Taq DNA 리가제

  • 이 리가아제는 상보적인 DNA 가닥에 혼성화된 두 개의 인접한 올리고뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합을 촉매합니다.

그림 1.4.7:Taq DNA 리가제 활성

  • 라이게이션은 올리고뉴클레오티드가 주형 가닥과 완벽하게 혼성화되는 경우에만 효율적입니다.
  • 효소는 비교적 높은 온도(45 - 65 °C)에서 활성입니다. 필요 NAD+ 보조 인자로.

T4 RNA 리가제

  • RNA/RNA 올리고뉴클레오티드, RNA/DNA 올리고뉴클레오티드 또는 DNA/DNA 올리고뉴클레오티드 간의 포스포디에스테르 결합 형성을 촉매합니다.
  • 필요 ATP 보조 인자로.
  • 이 효소는 주형 가닥이 필요하지 않습니다.

T4 RNA 리가제는 RNA/DNA 하이브리드 분자를 구성하는 것을 포함하여 다양한 목적으로 사용될 수 있습니다.

그림 1.4.8:T4 RNA 리가제 활성

DNA 리가제(E. coli)

  • 이중 DNA 사이의 포스포디에스테르 결합을 촉매합니다. 응집력 있는 끝을 포함하는.
  • 그것은 것이다 ~ 아니다 blund end fragments를 효율적으로 결찰합니다.
  • 필요 NAD+ 보조 인자로.

그림 1.4.9:DNA 리가제(E. Coli) 활성

T4 폴리뉴클레오티드 키나제

  • 인산염 그룹의 이동 및 교환을 촉매합니다. NS 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 또는 RNA의 5' 하이드록실 말단에 대한 rATP(아데닌 리보스 삼인산 뉴클레오티드)의 위치, 그리고 뉴클레오사이드 3' 모노포스페이트.
  • 효소는 또한 3' 인산기를 제거합니다.
  • 자동화 합성기에서 얻은 올리고뉴클레오타이드는 5' 인산염 그룹이 없어 다른 폴리뉴클레오타이드에 연결할 수 없습니다..

T4 폴리뉴클레오타이드 키나제는 이러한 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단을 인산화하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1.4.10:T4 폴리뉴클레오티드 키나제 활성


혜택

  • 고순도(>99%) HPLC에 따르면 (그림 1)
  • DNase, RNase 및 qPCR, PCR 및 RT 억제제 없음
  • -20 o C에서 3년 동안 안정
  • 맞춤형 제형 및 상업적 공급 가능


품질 테스트는 분자 생물학 실험에서 dNTP 또는 NTP의 탁월한 성능을 보장하는 데 도움이 됩니다. 평가는 여러 분석 방법을 사용하여 이루어집니다. (표 1 그림 1).

표 1. 정성적 매개변수 및 사양

매개변수테스트사양
물리적 인집중100 + 3mM
모습투명한 무색 용액
pH 값7.3-7.5
-20 o C에서의 안정성36개월
HPLCdNTP> 99% 순도
NTP> 99% 순도
피로인산염< 0.003pmol PPi/pmol dNTP
기능의DNase, RNase 및 nicking 활성 감지할 수 없음
박테리아 DNA(qPCR, 대장균 23S rRNA)감지할 수 없음
인간 DNA 오염(qPCR, 인간 gDNA)감지할 수 없음

그림 1. ≥99% 순수 dNTP의 상대 HPLC 프로필. HPLC 분석은 검출할 수 없는 모노-, 디- 및 테트라포스페이트 형태로 99% 이상의 트리포스페이트 순도를 보여줍니다.


제품 및 주문

[1] 타베르니에 et al. (2011) 유전자 치료제로서의 mRNA: 단백질 발현을 조절하는 방법. 통제된 질병의 저널 150:238.
[2] 카리코 et al. (2011) 치료를 위한 최적의 mRNA 생성: HPLC 정제는 면역 활성화를 제거하고 뉴클레오사이드 변형 단백질 인코딩 mRNA의 번역을 개선합니다. 핵산 해상도 39 (21):9329.
[3] 파스콜로 et al. (2006) 메신저 RNA로 백신 접종. 에: 분자의학에서의 방법 127 (잘츠만). 휴머나 프레스.
[4] 코만 et al. (2011) 생쥐에서 화학적으로 변형된 mRNA 전달 후 치료 단백질 발현. 자연생명공학 29 (2):154.
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[10] 리 et al. (2016) 화학적으로 변형된 메신저 RNA가 단백질 발현에 미치는 영향 Bioconjugate Chem. 27 (3):849.


5. 캡 에피트랜스스크립트 매핑

5.1. m 7 G 및 N미디엄 확장된 mRNA 캡에서

최근 epitranscriptomics에 대한 많은 관심이 내부 사이트(즉, mRNA 캡과 폴리(A) 꼬리 사이)에 위치한 변형된 뉴클레오티드에 초점을 맞추고 있지만 RNA 변형 수준은 내부 사이트에 비해 mRNA 캡에서 상당히 높습니다. m 6 A 외에도 mRNA에는 4개의 다른 풍부한 메틸 변형이 있습니다. 이들은 m 7 G 캡의 N-7 메틸, 두 개의 2′-영형- 첫 번째 및 두 번째 주형 뉴클레오티드에서 발견되는 메틸 변형, 및 N 2′-와 함께 발견되는 6-메틸영형-m 6 A의 메틸미디엄 이는 첫 번째 템플릿 뉴클레오티드에서 찾을 수 있습니다. 함께, 이러한 메틸 마크는 mRNA의 5가지 주요 메틸 변형을 포함합니다.

아직까지 m 7 G cap 또는 2′-의 methyl 변형에 대한 전사체 전체 분석은 보고되지 않았습니다.영형- 첫 번째 및 두 번째 주형 뉴클레오티드에서 메틸 변형. 그럼에도 불구하고 이러한 수정이 규제될 수 있다는 증거가 있습니다. m 7 G의 경우, 구아노신을 메틸화하는 효소는 N7-메틸구아노신인 RNMT는 암에서 조절되며 RNMT의 과발현은 암 발병을 촉진합니다(Cowling 2010a, 2010b). 이는 정상적인 조건에서 일부 mRNA가 m 7 G 캡을 형성하도록 효율적으로 메틸화되지 않고 RNMT의 발현으로 인해 이러한 mRNA가 성숙하여 완전한 기능을 갖춘 m 7 G 캡을 획득할 수 있음을 시사합니다. mRNA 핵 수출에는 m 7 G 캡이 필요하기 때문에(Inesta-Vaquera and Cowling 2017), 메틸화되지 않은 구아노신으로 덮인 mRNA는 핵에 남아 있거나 분해될 수 있습니다.

캡 관련 2′-영형-메틸 변형도 조절될 수 있습니다. 일부 mRNA에는 2′-가 부족할 수 있습니다.영형- 완전히 메틸 변형. 이러한 mRNA는 cap 0이라고 합니다. 다른 mRNA는 2′-만 가질 수 있습니다.영형- 첫 번째 인코딩된 뉴클레오티드에 대한 메틸 변형(�p 1”라고 함). 이 2′-영형-메틸 변형은 CMTR1에 의해 설치되며, 이는 기질로 m 7 G-capped RNA를 필요로 합니다(Bélanger et al. 2010 Inesta-Vaquera and Cowling 2017). CMTR1은 RNA Pol II와 물리적으로 연관되어 있으며(Haline-Vaz et al. 2008), 이는 이 변형이 mRNA에 동시 전사적으로 도입될 수 있음을 시사합니다.

mRNA는 또한 캡 2(Furuichi et al. 1975)라고 하는 2′-히드록실에서 메틸화된 첫 번째 및 두 번째 전사된 뉴클레오티드를 모두 가질 수 있습니다. mRNA는 두 번째 주형 뉴클레오티드만 가질 가능성은 없습니다. 2′-영형-2′-를 도입하는 효소인 CMTR2 때문에 메틸화됨-영형-두 번째 뉴클레오티드의 메틸은 2′-영형- 첫 번째 뉴클레오티드의 메틸(Werner et al. 2011).

2′-의 주요 기능 중 하나영형-메틸화는 이 변형이 항바이러스 방어 경로에 기여할 수 있다는 것입니다. 바이러스 감염은 캡 0 RNA를 캡 1 및 잠재적으로 캡 2 mRNA로 전환시키는 CMTR1의 유도와 관련이 있습니다(Daffis et al. 2010 Züst et al. 2011). 2′-의 존재영형-메틸 변형은 이러한 mRNA가 바이러스 감염에 대한 반응으로 인터페론에 의해 유도되는 IFIT 단백질에 결합하는 것을 방지합니다(Fensterl 및 Sen 2015). IFIT는 확장된 캡 구조에서 표적 mRNA에 결합하고 캡 결합 단백질과의 결합을 위해 경쟁하여 번역을 억제합니다(Habjan et al. 2013 Kimura et al. 2013). 따라서 2′-영형-메틸화는 바이러스 RNA를 향하도록 의도된 항바이러스 반응으로부터 숙주 mRNA를 보호합니다.

그러나 2′-영형- 메틸화는 바이러스 감염이 없는 경우에도 세포에서 감지되며 cap 1과 cap 2의 수준은 세포마다 다른 것으로 보입니다(Furuichi et al. 1975). 따라서 2′-영형- 캡의 메틸화는 바이러스 감염이 없는 경우에도 기능을 가질 수 있습니다. 아직까지는 2′-영형-mRNA 캡과 관련된 메틸 변형은 전사체에서 매핑되지 않았습니다.

5.2. 오전 6시

전사체 전체 수준에서 프로파일링된 유일한 캡 관련 메틸화는 m 6 Am입니다. m 6 Am은 m 6 A 항체를 사용하는 m 6 A miCLIP 프로토콜(위에 설명됨)에서 m 6 A와 동시에 매핑됩니다. m 6 A 항체는 m 6 Am에도 결합하므로(Munns et al. 1979), m 6 A 및 m 6 Am의 두 6-메틸아데닌 함유 뉴클레오티드에 대한 결합을 반영하기 위해 6-메틸아데닌 항체로 더 정확하게 설명됩니다.

miCLIP이 개발되기 전에는 m 6 A와 m 6 Am을 구별할 수 없었습니다. 따라서 5′ UTR에서 발견된 MeRIP-seq 피크는 m 6 A 또는 m 6 Am으로 쉽게 지정할 수 없습니다. 아마도 5′ UTR 내의 MeRIP-seq 피크의 위치는 그것이 전사 시작 뉴클레오티드에서 독점적으로 발견되는 m 6 Am이 아닌 m 6 A를 반영한다는 것을 암시할 수 있습니다. 5′ UTR의 중간에 있는 피크는 분명히 전사 시작 뉴클레오티드에 있지 않습니다. 불행히도 이 추론은 유효하지 않습니다. 많은 전사체에는 대체 전사 시작 부위가 있으며, 그 중 일부는 주석이 달린 전사 시작 부위의 하류일 수 있습니다(Shiraki et al. 2003). 따라서 주석이 달린 5′ UTR 이소폼보다 5′ UTR이 더 짧은 이소폼의 m 6 Am은 다른 mRNA isoform의 전사 시작 부위.

MeRIP-seq에서 RNA 단편은 면역 침전되고 RNA는 역전사되어 cDNA의 첫 번째 가닥을 만듭니다. 다음으로, cDNA의 두 번째 가닥은 RNA에 흠집을 내고 DNA 합성을 위한 프라이머로 자유 말단을 사용하여 만들어집니다. 이 프로토콜에서 RNA의 5′ 끝은 보존되지 않습니다. cDNA의 두 번째 가닥이 닉 위치에 따라 다소 무작위로 시작하기 때문입니다.

m 6 A의 경우, m 6 A가 면역침전된 RNA의 어느 곳에나 있을 수 있기 때문에 5′ 말단의 보존 부족은 중요하지 않습니다. 따라서 m 6 A는 여전히 결과 피크의 중간에 있을 것입니다. 그러나 m 6 Am의 경우 RNA 단편은 다를 것이며 각각의 경우 m 6 Am은 항상 RNA의 5′ 끝에 정확히 있을 것입니다. 따라서 5′ 끝의 손실은 MeRIP-seq가 m 6 Am의 실제 사이트에서 다운스트림에 위치하게 됨을 의미합니다. 피크는 m 6 Am의 실제 사이트에서 하류로 m 6 A 피크처럼 보일 것입니다.

miCLIP은 면역침전된 RNA의 정확한 5′ 말단을 보존하여 이 문제를 극복합니다. m 6 Am을 포함하는 모든 읽기는 동일한 5′ 끝(즉, 전사 시작 뉴클레오티드)을 갖기 때문에 m 6 Am의 위치를 ​​명확하게 구분하는 𠇌liff” 또는 가장자리가 나타납니다. RNA의 5′ 말단을 보존하는 라이브러리 방법은 피크를 m 6 A 또는 m 6 Am에 할당하는 모호성을 줄입니다.

miCLIP을 사용한 m 6 Am의 매핑을 기반으로 m 6 Am에 대한 함수를 식별할 수 있습니다. 우리의 분석은 m 6 Am-포함 mRNA가 다른 뉴클레오티드로 시작하는 mRNA보다 더 긴 mRNA 반감기를 보여준다는 것을 보여주었습니다. m 6 Am의 안정성은 적어도 부분적으로는 디캡핑에 대한 m 6 Am-함유 mRNA의 감소된 감수성에 의해 매개되는 것으로 보입니다. m 6 Am을 함유한 RNA의 생화학적 분석은 Am을 함유한 유사한 RNA와 비교하여 현저히 감소된 효율로 Dcp2 디캡핑 효소에 의해 이들이 캡핑되었음을 보여주었다. 따라서, 단일 N-6 메틸 변형은 RNA가 감소된 디캡핑을 나타내도록 합니다. 특히, m 6 Am mRNA는 또한 RNA 분해를 유도하는 메커니즘의 일부로 디캡핑 단계를 유도하는 microRNA에 대한 감소된 감수성을 나타냅니다. 따라서 m 6 Am은 mRNA를 안정화시키는 역할을 할 수 있습니다.

현재 Am으로부터 m6Am을 형성하는 효소는 생화학적으로 정제되었지만(Keith et al. 1978), 아직 복제되지 않았습니다. 이 효소의 식별은 mRNA에서 이 변형의 기능에 대한 보다 포괄적인 분석을 가능하게 할 것입니다. 또한, m 6 Am의 “readers”는 아직 알려져 있지 않지만, m 6 Am이 매개하는 번역 향상 또는 m 6 Am의 다른 효과의 메커니즘에 기여할 수 있습니다.


유리 뉴클레오티드의 변형 - 생물학

A "리보뉴클레오사이드", A "데옥시리보뉴클레오사이드", A "리보뉴클레오타이드"

뉴클레오티드 유도체 :

탄수화물 대사의 많은 생합성 반응에는 뉴클레오티드 유도체가 필요합니다.

즉, 포도당-1-인산 + ATP ----> ADP-포도당

뉴클레오티드 구조

핵산의 1차 구조:

뉴클레오타이드의 서열 또는 순서는 DNA와 RNA의 1차 구조를 정의합니다. 폴리머의 뉴클레오티드는 하나의 5' 탄소에 있는 산소를 통해 다른 하나의 3' 탄소에 있는 산소에 연결되는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결됩니다. 백본에 있는 산소와 질소 원자는 DNA와 RNA에 "극성"을 부여합니다.

핵산의 2차 구조:

퓨린 염기는 항상 피리미딘 염기 또는 더 구체적으로 구아노신(G)과 사이토신(C) 및 아데닌(A)과 티민(T) 또는 우라실(U)과 쌍을 이룹니다.

G-C 쌍에는 3개의 수소 결합이 있고 A-T 쌍에는 2개의 수소 결합이 있습니다.

DNA: DNA의 2차 구조는 이중 나선을 형성하기 위해 서로 감싸인 두 개의 폴리뉴클레오티드 사슬로 구성됩니다. 나선의 방향은 일반적으로 서로 반대 방향으로 실행되는 두 개의 사슬과 함께 오른손잡이입니다.

각 가닥의 염기 서열은 한 가닥의 모든 염기가 다른 가닥의 모든 염기와 쌍을 이루도록 배열됩니다. 즉, 구아노신의 수는 항상 시토신의 수와 같고 아데닌의 수는 항상 티민의 수와 같습니다. .

이중 나선에는 두 개의 홈이 있습니다. 하나는 메이저이고 다른 하나는 마이너입니다. 단백질과 약물은 홈에 노출된 염기의 작용기와 상호 작용합니다.

DNA의 구조적 형태는 "손잡이"(오른쪽 또는 왼쪽), 나선 회전의 길이, 회전당 염기쌍의 수, 큰 홈과 작은 홈 사이의 크기 차이의 네 가지 측면에서 다를 수 있습니다. DNA의 가장 일반적인 구조적 형태는 B형입니다.

RNA의 2차 구조는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성됩니다. RNA는 상보적인 영역 사이에서 염기쌍이 일어나도록 접힐 수 있습니다. RNA 분자는 종종 단일 및 이중 가닥 영역을 모두 포함합니다. 가닥은 역평행이고 나선 모양을 취합니다. 나선은 A형입니다(위 참조).

t(전달) 및 r(리보솜) RNA의 구조는 다중, 단일 가닥, 스템 루프 구조로 구성됩니다. 줄기는 RNA 내의 상보적 영역의 염기쌍에 의해 형성된 나선으로 구성됩니다. tRNA 및 rRNA의 2차 구조는 생물학적 기능에 중요하며, mRNA도 어느 정도의 2차 구조를 가정하지만 tRNA 및 rRNA와 같은 정도는 아닙니다.

화학적 변형:

DNA와 RNA의 일부 염기는 메틸화를 통해 화학적으로 변형될 수 있습니다. 엑소 및 엔도 뉴클레아제라고 하는 프로테아제와 유사한 효소는 RNA와 DNA를 절단할 수 있습니다. 엑소뉴클레아제는 말단에서 핵산을 절단합니다. 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 DNA의 특정 서열을 인식하고 인식된 서열 내부 또는 근처의 특정 부위에서 절단합니다. 인식되는 서열의 길이는 4개에서 8개까지의 염기쌍입니다. 생성된 단편은 다른 단편과 결합하여 DNA 서열의 새로운 조합을 생성할 수 있습니다.

DNA는 단일 가닥으로 변성되었다가 다시 이중 나선으로 변성될 수 있습니다. 가역적 변성은 복제 및 전사의 생물학적 과정과 서던 블롯팅 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 분자 생물학적 기술에 필수적입니다. DNA를 변성시키는 방법에는 효소적, 화학적 또는 열의 세 가지가 있습니다. 열을 통한 DNA의 변성은 260 nm의 파장으로 설정된 분광 광도계를 사용하여 수행할 수 있습니다. 열이 증가함에 따라 흡수가 증가하여 가닥을 함께 유지하는 수소 결합이 끊어져 염기가 벗겨지고 노출됩니다. 이 효과를 하이퍼크로믹 효과라고 합니다. DNA의 50%가 변성되는 온도를 녹는점 또는 T미디엄. GC 염기쌍은 3개의 수소 결합과 함께 유지되기 때문에(AT는 2개만 있음) GC 염기쌍의 비율이 높을수록 T가 높을수록미디엄 DNA를 녹이는 데 필요합니다.

재생이 일어나려면 두 가닥의 DNA가 서로 접촉하여 염기쌍을 시작해야 합니다. 이러한 일이 발생하면 두 가닥이 전체 길이를 따라 빠르게 재결합됩니다. 복잡성, DNA 농도, 양이온 농도 및 온도와 같은 몇 가지 요소가 재생에 영향을 미칩니다. 나트륨, 칼륨 및 마그네슘과 같은 양이온은 두 DNA 가닥의 음으로 하전된 인산염 백본의 분자간 반발을 감소시킵니다. 온도가 Tm 미만인 경우에만 재생성이 발생하지만 온도가 너무 낮으면 재생률이 감소합니다. 연구에 따르면 대부분의 포유류의 재생산 DNA는 단백질과 효소를 암호화하는 고유한 서열이 약 5%에 불과한 반복적인 서열로 구성되어 있습니다.

혼성화는 서로 다른 소스에서 파생된 핵산의 상보적 가닥 사이에서 발생할 수 있습니다. 형성되는 이중 가닥 핵산은 이형이중체이고 이형이중체의 정도는 두 핵산 공급원 간의 상동성을 나타냅니다. 예를 들어, 인간과 생쥐는 DNA의 매우 작은 부분과 혼합되어 재생성되지만 인간과 침팬지는 98% 이상의 상동성을 나타냅니다. DNA와 RNA는 또한 서로 혼성화하여 이형이중체를 형성할 수 있습니다.


RNA의 구조

모든 세포에는 리보핵산 또는 RNA라는 두 번째 핵산이 있습니다. DNA와 마찬가지로 RNA는 뉴클레오티드의 중합체입니다. RNA의 각 뉴클레오티드는 질소 염기, 5탄당 및 인산염 그룹으로 구성됩니다. RNA의 경우 5탄당은 디옥시리보스가 아니라 리보스입니다. 리보스는 수소 원자만 있는 데옥시리보스와 달리 2' 탄소에 수산기를 가지고 있습니다(그림 9.1.4).

그림 9.1.4: RNA에서 발견되는 리보스와 DNA에서 발견되는 디옥시리보스의 차이점은 리보스가 2' 탄소에 수산기를 가지고 있다는 것입니다.

RNA 뉴클레오타이드는 질소 염기 아데닌, 시토신 및 구아닌을 포함합니다. 그러나 그들은 티민을 포함하지 않고 대신 우라실로 대체되며 &ldquoU&rdquo로 상징됩니다. RNA는 이중 나선이 아닌 단일 나선 분자로 존재합니다. 분자생물학자들은 기능에 따라 여러 종류의 RNA를 명명했습니다. 여기에는 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA) 및 DNA 코드에서 단백질 생성에 관여하는 mdash분자가 포함됩니다.


비바이러스 유전자 치료: 무기 나노플렉스의 설계 및 적용

마리오 비뇰브레 파니조 , . Marzia Marciello , in Nucleic Acid Nanotheranostics , 2019

2 무기 나노플렉스 설계: 일반적인 고려 사항

유전자 전달에 무기 나노입자를 적용하는 것은 다양한 크기와 모양으로 쉽게 준비할 수 있는 나노구조이기 때문에 떠오르는 분야입니다. 또한, 그들은 세망내피 시스템을 피하기 위해 다양한 방식으로 기능화되어 혈액 순환 반감기를 연장하고 운반된 핵산 및/또는 접합체 리간드를 보호하여 표적 세포에 도달할 수 있습니다. 9,11-14 Au NP, SPION, QD 및 CNT는 가장 많이 연구된 무기 NP입니다. 이러한 입자는 더 나은 형질감염 효율, 12,15 미생물 공격을 받지 않음, 10,14 더 큰 저장 안정성, 낮은 제조 비용 및 더 긴 저장 수명과 같은 유기 나노시스템과 관련하여 몇 가지 중요한 이점을 보여줍니다. 14,16,17 또한, 고분자 입자에서는 흔하지 않은 독특한 전기적, 기계적, 광학적, 자기적 특성을 보여줍니다. 18,19 금속 나노입자와 탄소 기반 나노물질의 적용에 있어 몇 가지 눈에 띄는 발전이 각각 표 1과 2에 보고되어 있습니다.

1 번 테이블 . 비바이러스 유전자 치료를 위한 Au NP, QD 및 SPION 적용의 일부 발전 요약

재료구성 및 기능화제안된 중고/주요 발견 사항테스트 모델참조
아우 NP내인성 세포 주기 키나제를 표적으로 하는 siRNA와 접합된 PEI 캡핑된 금 나노입자종양유전자 폴로 유사 키나아제를 하향 조절하기 위해 1. 나노입자 복합체는 40nM의 siRNA를 사용했을 때 60%의 녹다운 및 미미한 세포 독성을 나타냈습니다.MDA-MB-435s 세포노래 2010 43
아우 NPAuNP에 부착된 Thiol 말단 DNA는 기능성 디스트로핀 공여자 DNA와 혼성화됩니다. Cas9 단백질은 친화력에 의해 흡착되었습니다.CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구의 형질감염을 개선하고 돌연변이된 디스트로핀 유전자를 수정합니다. 근아세포의 3.3%가 복구되었습니다.mdx 마우스 모델이 2017 155
QDCdSe/ZnS 코어-쉘 양자점. 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리-ɛ-카프로락톤 및 폴리에틸렌 이민 코팅. GAPDH에 대한 형광 접합 siRNAFRET 기반 이미징 기술에 의한 양자점-나노운반체 복합체로부터의 DNA 분리를 추적하고 증명하기 위해SKOV3 세포엔드레스 2014 60
QDMn:ZnSe 코어. 폴리(알릴아민 염산염) 코팅 및 엽산 수용체 매개 형질감염. 돌연변이된 K-Ras 침묵에 대한 siRNAK-Ras 유전자는 60%에서 침묵되었다. 최대 160 μg mL − 1까지 세포독성이 관찰되지 않음 Panc-1 세포왕 2015 61
스파이온Commercial nanoparticles Polymag complexed with plasmid (pCIKLux) carrying a luciferase reporter geneTo apply an oscillating magnet to improve the magnetofection technique up to 6 times compared with original magnetofection protocolNCI-H292 cellsMcBain 2008 80
SPIONNanocluster containing SPIONs of 5 nm, fluorescent Rhodamine B in a matrix polymer of poly(lactide-co-glycolide) and PEI coating, and conjugated with pDNA containing the GFP reporterTo track the complex by both fluorescence imaging and MRI. 39% of GFP expression and nontoxic effects for 96 hours at a concentration of 200 μg mL -1 Human mesenchymal stem cells (hMSCs)Park 2017 83

AuNP, gold nanoparticle FRET, fluorescence resonance energy transfer GAPDH, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 GFP, green fluorescent protein MRI, molecular resonance imaging PEI, polyethylenimine pDNA, plasmid DNA QD, quantum dot siRNA, short interfering RNA SPION, superparamagnetic iron oxide nanoparticle.

표 2 . Summary of Some Outstanding Progress in the Application of Graphene and GO Nanomaterials for Nonviral Gene Therapy

재료모양FunctionalizationProposed Use/Major FindingsTesting Model참조
Graphene/GONanosheetsPAMAM + OA13-Fold increase in transfection efficiency with respect to grapheneHeLa cells and MG-63 cellsLiu 2014 124
가다NanosheetsPEICodelivery of siRNA and doxorrubicine for anticancer therapyB-cell lymphoma 2 cellsZhang 2011 137
가다NanosheetsPEG + PEINanocarriers with photothermally enhanced intracellular trafficking via NIR for light-controllable gene deliveryHeLa cells and MDA-MB-435s cellsFeng 2013 134
가다NanosheetsPEIDelivery of VEGF-165 gene for acute myocardial infarctionIntramyocardial injection in ratPaul 2014 138
가다QDsPLL + PEGMicroRNAs imaging analysis and gene deliveryHeLa cellsDong 2015 132
가다NanosheetsPL-PEG + CPPsImproved hydrocolloidal stability and siRNA transfection efficiencyMCF-7 cellsImani 2016 136
가다QDsCodelivery of MPG-2H1 chimeric peptide and plasmid DNA for simultaneous gene delivery and trackingHEK 293T cellsGhafary 2017 133

CPP, cell penetrating peptide DNA, deoxyribonucleic acid 가다, graphene oxide NIR, near-infrared light OA, oleic acid PAMAM, polyamidoamine , poly(ethylene glycol) PEI, polyethylenimine PLL, poly( l -lactide) PL-PEG, phospholipid-based poly(ethylene glycol) QDs, quantum dots RNA, ribonucleic acid siRNA, short interfering RNA VEGF, vascular endothelial growth factor.

With the aim of forming a stable complex with the carried therapeutic nucleic acid, the surface of the inorganic NPs needs to be chemically modified. Specifically, surface modifications are performed for different objectives: (1) to allow a stable conjugation of the carried nucleic acid (2) to protect the NPs from opsonization (3) to increase the selective cellular binding and (4) to allow internalization through receptor-mediated endocytosis. 삼

After modification of the NP surface, the therapeutic gene is carried using different strategies. Depending on the type of chemical NP-nucleic acid association, inorganic vectors can be differently categorized as: (1) vectors that form a condensed complex with the nucleic acid, protecting it from nucleases and other blood components (2) nanocarriers that expose specific ligands for target cells (3) nanovectors able to improve the release of the genetic material into the cytosol or nucleus and (4) nanosystems that prolong the release of the therapeutic gene in tissues. 1

Typical chemical modifications /conjugations can be obtained by establishing three main kinds of bonds:

Weak bindings—These are generally represented by electrostatic interactions that lead to the formation of reversible bonds. Normally, they are based on the attraction between positively and negatively charged species and can easily be broken under high salt concentrations. Some examples are ionic bindings, hydrogen bonds, and Van der Waals forces. 20

Weak interactions are preferred for the complexation of the nucleic acid with the NPs because the therapeutic can be easily released into the cell, while also avoiding chemical modifications of it. An interesting example is represented by multiple electrostatic layers on the surface of NPs that can be deposited using a layer-by-layer (LbL) approach. 21

Strong bonds—They are usually characterized by irreversible conjugations. They are resistant to high-force ionic conditions differently from electrostatic interactions. Generally, they are formed between different functional groups (e.g., carboxylic acids, amines, thiols), forming very strong bonds, such as amide, ester, or disulfide bridges. 20

The metal-ligand interaction between Au and thiolated molecules, 22 as well as the binding affinity of protein-ligand (including lock-and-key, induced fit, and conformational selection models) 23,24 are also included in this category of conjugation.

Versatile and quick click chemistry reactions can be used to obtain some reactions that lead to the formation of resistant bonds. These include, for example, cycloadditions (e.g., 1,3-dipolar cycloadditions of alkynes to azides, hetero-Diels-Alder cycloadditions), nucleophilic ring openings consisting of opened strained heterocyclic electrophiles (e.g., aziridines, epoxides, cyclic sulfates), and additions to carbon-carbon multiple bonds (e.g., epoxidations, aziridinations, dihydroxylations, sulfenyl halide additions, nitrosyl halide additions, and certain Michael additions). 25,26

Encapsulation—It leads to the formation of hybrid nanomaterials based on the entrapment of inorganic particles with the therapeutic into a polymer. 27 This polymer can be stimuli-sensitive, so able to release its contents in the presence of specific conditions (typically temperature and pH). 28,29


Nucleotides and Bases

Nucleotide Structure
Courtesy of the National Human Genome Research Institute

뉴클레오티드

A nucleotide is the basic structural unit and building block for DNA. These building blocks are hooked together to form a chain of DNA. A nucleotide is composed of 3 parts:

* five-sided sugar
* phosphate group
* nitrogenous base (nitrogen containing)

Image courtesy of the National Human Genome Research Institution

The sugar and phosphate group make up the backbone of the DNA double helix, while the bases are located in the middle. A chemical bond between the phosphate group of one nucleotide and the sugar of a neighboring nucleotide holds the backbone together. Chemical bonds (hydrogen bonds) between the bases that are across from one another hold the two strands of the double helix together.

There are four types of bases in DNA. They are called:

* Adenine (A)
* Cytosine (C)
* Guanine (G)
* Thymine (T)

Courtesy of the National Human Genome Research Institution

Bases are the part of DNA that stores information and gives DNA the ability to encode 표현형, a person’s visible traits. Adenine and guanine are purine bases. These are structures composed of a 5-sided and 6-sided ring. Cytosine and thymine are pyrimidines which are structures composed of a single six-sided ring. Adenine always binds to thymine, while cytosine and guanine always bind to one another. This relationship is called complementary base paring. These complementary bases are bonded together via hydrogen bonds, which can be easily broken apart when the DNA needs to unzip and duplicate itself.

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