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내 젤의 해상도가 낮은 이유는 무엇입니까?

내 젤의 해상도가 낮은 이유는 무엇입니까?



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이 사이트를 bio에 새로운 사용자가 여기에 있습니다. 각 웰에 20uL의 DNA와 1X 추적 염료를 포함하는 DNA 샘플을 사용하여 이 젤(0.9% 아가로스, 60V에서 시작하여 ~30-45분에 걸쳐 105V로 실행)을 실행했습니다. 이 젤의 해상도가 왜 그렇게 나쁜지 모르겠습니다. 내 연구실 기술자가 말한 것처럼 DNAse 활동에서 비롯된 것이라고 가정합니다. 나는 절차에 관한 모든 것을 올바르게 했다고 확신합니다. 샘플이 준비되고 젤이 실행되기 일주일 전에 -20C에서 저장되었다는 것 외에 내가 제공할 수 있는 다른 정보가 무엇인지 잘 모르겠습니다. 아래는 젤 사진입니다.


기술이 DNA 샘플을 참조하고 있지만 사다리는 또한 달리기 기술을 개선할 여지가 있음을 나타냅니다. 일주일 동안 -20C에서 냉동실에 들어가는 좋은 품질이라고 가정하면 DNA의 품질에 영향을 미치지 않아야 합니다. EDTA를 저장 버퍼에 추가하여 DNAase 활동을 완화할 수 있습니다. 그러면 용액에서 금속 이온이 제거됩니다. 나중에 금속 이온(예: PCR)이 필요한 반응을 수행하는 경우 이를 고려하십시오.

DNA

DNA 샘플에 먼저 초점을 맞춥니다. 몇 가지 확인해야 할 사항이 있습니다.

얼마나 로드 했습니까? 20uL라고 말씀하신거 봤는데 농도가 얼마였나요? 샘플로 사용되는 ng의 양을 아는 것이 더 중요합니다. 다양한 스테인은 감지할 수 있는 농도가 다릅니다(EtBr, SYBR 등). 적절한 양의 DNA를 로딩하고 있는지 확인하기 위해 사용 중인 스테인의 특성을 확인하겠습니다.

PCR 제품인가요? 그렇다면 PCR을 몇 주기로 실행했습니까? 샘플이 너무 많은 주기 동안 실행된 경우 PCR에서 유사한 결과를 보았습니다. 비특정 제품은 이후 주기에서 생산되기 시작하여 특정 제품의 품질 저하를 야기합니다. 또한 귀하의 프라이머, 연장 시간 및 사용 중인 중합효소를 다시 확인하겠습니다. 말씀하신 5.8kb와 6.8kb 크기의 확장은 더 어렵지만 불가능한 것은 아닙니다.

이것들은 제한 다이제스트입니까? 소화되지 않은 플라스미드 또는 기타 소스를 보여주는 컨트롤 웰이 있습니까? 결과에서 깨끗한 밴드를 기대하려면 소스에 먼저 깨끗한 밴드가 있어야 합니다. 소스가 깨끗하고 밝고 다이제스트가 위의 샘플과 같으면 다이제스트 버퍼와 효소를 확인하십시오.

전기영동

아가로스 젤의 품질을 향상시킬 수 있는 몇 가지 사항이 있습니다. Thermofisher는 팁과 요령에 대한 가이드를 제공합니다. 다음은 내 경험에서 유용하다고 생각한 것들입니다.

  1. 젤 캐스팅과 실행 사이의 시간입니다. 일반적인 관행은 젤을 만들어 사용할 준비가 될 때까지 TBE/TAE 완충액에 보관하는 것입니다. 내 경험에 따르면 젤의 품질은 시간이 지남에 따라 저하되어 확산 밴드를 생성합니다. 최상의 결과는 갓 부어서 캐스트 젤로 얻을 수 있습니다.

  2. 로딩 기술. 샘플을 우물에 조심스럽게 로드하여 주변 버퍼와 섞이지 않고 바닥에 최대한 가깝게 정착하는 것이 중요합니다. 최상의 결과는 피펫 팁이 웰의 바닥에 닿도록 하고 샘플을 놓을 때 천천히 당겨서 샘플이 자체적으로 웰에 가라앉지 않도록 함으로써 얻을 수 있습니다.

  3. 로딩 직후 실행, 실행 직후 이미지. 확산은 샘플이 우물에 오래 머무를수록 좋은 단단한 밴드가 나빠지게 합니다.

  4. 전압, 타이밍 및 아가로스 농도. 이러한 권리를 얻으려면 연습이 필요합니다. 젤을 가능한 한 빨리 실행하려고 할 것입니다. 젤에 더 많은 시간이 있을수록 더 많은 확산이 발생합니다. 그러나 전압이 너무 높으면 젤이 녹을 위험이 있습니다. 원하는 DNA의 크기를 목표로 하기 위해 아가로스의 농도를 변경합니다. 나는 이전에 0.5%에서 1.5% 사이를 사용했습니다.

  5. 젤을 유지하거나 후염색합니까? 나는 샘플이 젤에 앉아 확산이 일어나도록 하는 시간을 줄이기 때문에 잘 작동하는 얼룩에 대해 사전 염색을 선호합니다.

  6. 나는 당신의 사다리와 제공된 표준에 대한 링크를 보고 있는데 어느 밴드가 어느 밴드인지 말하기가 어렵습니다. 3.0kb 조각이 가장 밝게 눈에 띄어야 하지만 젤의 아래쪽 밴드가 가장 밝습니다. 3.0kb 밴드인가요? 아마도. 위의 밴드 수를 세어 확인하기 어렵습니다. 그렇지 않은 경우 샘플이 젤 끝까지 실행되지 않은 것으로 표시될 수 있으며 이는 0.5kb 밴드가 됩니다. 0.5kb 대역이면 사다리 강도가 예상 강도와 일치하지 않습니다. 당신이보고있는 크기를 알 수 있도록 사다리를 다시 확인하십시오.


흐릿한 밴드 . - (2012년 7월 7일 )

안녕하십니까,
저는 한동안 SDS Pages를 실행해 왔습니다. 최근에 나는 DNA 친화성 크로마토그래피 실험을 하고 있었고 16% 겔에서 용출을 실행하고 있었습니다. 저의 특별한 관심은 더 작은 단백질(약 10 - 20 kDa)을 식별하는 것입니다. 이유는 모르겠지만 젤에 있는 더 작은 단백질이 흐릿한 밴드로 나타나므로(첨부 파일 참조) 추가 MALDI 분석에 문제가 됩니다.

낮은 밴드를 압축하는 방법을 아는 사람이 있습니까? 10% 젤을 실행하고 실행을 더 일찍 중지하는 것이 의미가 있습니까? 실제로 왜 이런 일이 발생합니까?

미리 감사드립니다.
건배, 다니엘
' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4036" target="_blank">

elution buffer의 salt 함량을 확인하겠습니다. 소금을 조금 낮추기 위해 더 낮은 소금 완충액에 대해 투석을 시도할 수 있습니다.

안녕하세요,
예 .. 이미 전에 이 문제 에 대해 생각 했습니다 . 문제는 DNA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 용출 버퍼의 염 농도를 높여야 한다는 것입니다. 투석이 옵션이 될 수 있지만 더 쉬운 방법을 선호합니다.

첨부된 이미지의 경우(왼쪽에서 오른쪽으로) 100mM NaCl에서 1M NaCl로.
보시다시피 관심 있는 밴드는 100mM ~ 500mM NaCl입니다(가장 강한 밴드는 약 350, 500mM).. 실제로 저는 이 염 농도가 실행을 방해하지 않을 것이라고 가정했습니다.

. 용출을 집중시키는 방법에 대한 제안이 있으십니까? 어떤 의미에서 용출액이 40-50ul 정도 밖에 없는데 어떻게 투석을 하시겠습니까 .

특히 로그 실행 후에 버퍼의 전압과 온도를 조사해야 할 수도 있습니다. 또한 새로운 APS와 B-mercaptoethanol을 사용하여 변경해야 할 수도 있습니다. 그런 것들이 옳지 않을 때 나는 흐릿한 밴드를 가지고 있었습니다.

Adrian K는 2012년 7월 8일 일요일 05:24:08에 다음과 같이 말했습니다.

특히 로그 실행 후에 버퍼의 전압과 온도를 조사해야 할 수도 있습니다. 또한 새로운 APS와 B-mercaptoethanol을 사용하여 변경해야 할 수도 있습니다. 그런 것들이 옳지 않을 때 나는 흐릿한 밴드를 가지고 있었습니다.

저는 혈청 샘플을 실행할 때 3kDa amicon 필터를 사용하는 것을 좋아합니다. 이 필터는 귀하의 애플리케이션에 잘 맞을 것입니다. 저는 50 uL에서 400 uL 사이의 샘플에 이러한 필터를 사용했습니다.

그리고 올려주신 사진으로 봐서는 잘 모르겠지만 스태킹젤 쓰시나요? 이는 확실히 해상도를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.

proteaMatt 월 7월 9일 12:41:36 2012 말했다:

저는 혈청 샘플을 실행할 때 3kDa amicon 필터를 사용하는 것을 좋아합니다. 이 필터는 귀하의 애플리케이션에 잘 맞을 것입니다. 나는 50 uL에서 400 uL 사이의 샘플에 이러한 필터를 사용했습니다.

그리고 올려주신 사진으로 봐서는 잘 모르겠지만 스태킹젤 쓰시나요? 그것은 확실히 해상도를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.

안녕하세요, 답변해주셔서 감사합니다! 필터에 대한 아이디어가 훌륭해 보입니다. 너무 비싸지 않기를 바랍니다. . 그리고 예, 스태킹 젤이 있지만 염색을 시작하기 전에 제거하십시오.

점적 투석으로 염을 제거할 수 있습니다.

낮은 mw 단백질 및 펩티드의 분해능은 tris-glycine-sds 겔을 사용하여 높은 아크릴아미드 백분율을 사용하더라도 종종 좋지 않습니다. 10% tris-tricine-sds 젤(shagger 및 von jagow)을 사용하여 관심 있는 단백질의 탁월한 분해능을 얻을 수 있습니다.

2012년 7월 9일 월요일 16:30:18에 mdfenko가 말했습니다.

점적 투석으로 염을 제거할 수 있습니다.

낮은 mw 단백질 및 펩티드의 분해능은 tris-glycine-sds 겔을 사용하여 높은 아크릴아미드 백분율을 사용하더라도 종종 좋지 않습니다. 10% tris-tricine-sds 젤(shagger 및 von jagow)을 사용하여 관심 있는 단백질의 탁월한 분해능을 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 답변 감사합니다. 내일 시도해 볼 수 있습니다. .. 젤과 버퍼를 준비하는 데 사용할 수 있는 프로토콜이 있습니까? 모든 시스템에서 해당 젤을 실행할 수 있습니까? 이 진술을 찾은 이후 :

Tris-Tricine-SDS(TTS) 실행 버퍼는 음극(상부 저장소) 버퍼입니다.

조금 혼란스럽네요.. 상부 저수지는 무슨 뜻인가요? 이를 위해 특별한 시스템이 필요합니까 .. 양극 버퍼도 필요합니까?

편집: 그래서 상단 저수지는 유리판 사이의 어셈블리 부분이고 하단 저수지는 전체 탱크라고 생각합니다.


현미경은 확대하여 더 자세히 보여줍니다.

현미경의 작동 방식에 대해 이야기할 때 우리는 흔히 현미경이 사물을 더 크게 보이게 한다고 말합니다. 즉, 확대합니다. 우리는 현미경으로 보는 것을 같은 방식으로 설명합니다. 예를 들어, 우리가 보고 있는 죽은 파리가 200배 확대되었다고 말할 수 있습니다. 이것은 우리가 보고 있는 것을 이해하는 데 도움이 됩니다. 그것은 또한 우리의 사진이나 그림을 보는 다른 사람들이 그들이 보고 있는 것을 이해하는 데 도움이 됩니다. 이것이 과학 저널에 게재되는 모든 현미경 사진에 배율을 표시해야 하는 이유입니다.

그러나 일을 더 크게 만드는 것은 이야기의 일부일 뿐입니다. 현미경이 우리가 이미 볼 수 있는 것을 더 크게 만드는 것 외에는 아무 것도 하지 않았다면 별로 쓸모가 없었을 것입니다! 대신, 현미경은 우리가 볼 수 있는 세부 사항의 양을 늘립니다. 우리가 볼 수 있는 세부 수준의 또 다른 단어는 '해상도'입니다.

무언가를 확대하는 것과 보이는 세부 사항을 높이는 것의 차이점을 이해하려면 하라케케의 이 디지털 사진을 보십시오.


PCR 산물: 클론 또는 직접 시퀀싱?

7-8개의 클론을 사용하여 직접 시퀀싱을 통해 복제된 제품으로 해당 정보를 캡처하는 경우 이러한 이형 접합성은 일반적으로 주변 피크의 약 1/2인 겹치는 두 개의 피크로 표시됩니다. 그럼에도 불구하고 때때로 복제 없이 데이터를 얻을 수 없습니다. 자세한 내용은 이 웹사이트의 "기타 정보 '금광'?"을 참조하십시오.

NS) 단일 제품: 샘플이 아가로스 젤에서 깨끗한 단일 밴드로 실행될 때 정제된 PCR 산물(상업용 컬럼, 표준 에탄올 침전 또는 ExoSap)의 직접 시퀀싱을 시도합니다(일반적으로 단편 크기에 따라 0.8 - 3.0%).

NS) 다중 대역: 시료가 agarose gel에서 다른 band들 사이에 깨끗한 band로 실행될 때 gel-purified PCR product를 직접 sequencing해 보십시오.

씨) '단일 기반' 지역: 시퀀스에 순수한 폴리-'단일염기' 영역(>8-10개 염기)이 포함되어 있다는 것을 알고 있는 경우 제품을 복제하거나 양방향으로 직접 시퀀싱을 시도합니다. (Original PCR 중 strand-slippage로 인해 pure-base region 이후에는 sequence data를 읽을 수 없게 됩니다.)

NS) 플라스미드와 함께하세요: 정제된 플라스미드 DNA를 사용하여 순수한 폴리 "단일 염기" 영역의 스트레치(예: 전체 PCR 산물을 재생성하기 위해 두 읽기에서 contig를 생성할 수 있기 때문에 순방향 및 역방향 모두에서 깨끗한 읽기를 얻을 수 있습니다.

    프라이머-이량체: 일반적으로 프라이머-이량체는

70-bp를 기본 읽기라고 하며 실제 피크를 가릴 수 있습니다. 더 긴 읽기가 관련된 경우 UDT(정리 후) 수준이 매우 높은 샘플은 나중에 시퀀스에서 추가 UDT 피크를 갖습니다(

첫째, 대부분의 동일한 크기의 단편은 기본적으로 겔에서 띠로 함께 이동하지만 샘플의 모든 크기의 단편은 실제로 겔 레인 전체에 존재합니다. 따라서 최상의 상황에서도 겔 정제된 제품은 완전히 순수하지 않을 것입니다(불순물이 '최상의' 경우에 실제로 문제가 되지 않을지라도). 그러나 여기서 밴드 분리가 좋지 않으면 상황이 훨씬 더 악화되고 겔 정제된 샘플에서도 비표적 템플릿의 수준이 높을 가능성이 있습니다. 낮은 품질의 읽기로 이어집니다.

PCR 프라이머 적정: 매우 간단한 접근 방식은 일련의 희석된 프라이머를 사용하여 일련의 테스트 반응을 실행하는 것입니다. 이 프라이머 적정 접근 방식은 프라이머가 단순히 이량체화를 촉진하는 매우 열악한 디자인이 아닌 한 프라이머-이량체를 제거할 가능성이 높습니다(프라이머가 서로 접촉할 가능성을 최소화함으로써). 또한 프라이머가 단순히 비표적과 일치하고 표적과 일치하지 않는 한 비표적 프라이밍을 최소화하거나 제거합니다. 따라서 프라이머 농도가 떨어지면 표적 밴드가 더욱 약해지지만 프라이머-이량체 또는 비특이적 제품에 대해 발생하는 것보다 덜 빠르게 수행됩니다.

이상적으로는 어떤 시점에서 타겟 밴드(

겔 웰에 3-5 ul)가 뚜렷하게 보일 것이며(매우 밝지는 않음) 프라이머-이량체 또는 기타 비특이적 제품이 보이지 않을 것입니다. 이 경우 해당 PCR 산물을 정제한 후 원래 PCR 산물의 3-5 ul에 해당하는 양을 사용하여 DNA sequencing을 수행합니다.

  • 잔류 프라이머: 세척된 PCR 제품에도 원래 반응의 잔류 프라이머가 포함될 수 있으므로 잔류 프라이머를 상쇄하는 데 도움이 됩니다. 10-20 uM(vs. 2-5 uM)에서 1 ul의 시퀀싱 프라이머를 사용하십시오.
  • 큰염색: 정상 수준의 BigDye(예: 10ul 반응에서 0.5ul)는 매우 짧은 템플릿으로 두 가지 문제를 일으킬 수 있습니다.
    >> 첫째, 매우 짧은 템플릿은 긴 제품만큼 염료 종결자를 소비하지 않습니다. 따라서 완료된 반응을 세척할 때 UDT가 너무 많이 남아 있기 때문에 UDT를 충분히 제거하기 어려울 수 있습니다.
    >> 둘째, 표적이 매우 짧은 경우, 중합효소가 추가 템플릿으로 빠르게 이동할 수 있기 때문에 표준 양의 BigDye가 과도한 신호 강도를 생성할 수 있습니다. 과도한 신호는 베이스콜링에 문제를 일으킬 수 있습니다.
    >> 솔직히 말해서, BigDye가 0.1ul만 있어도 다음보다 짧은 제품에 대해 허용 가능한 신호 강도를 생성할 수 있습니다.

게놈 DNA를 직접 시퀀싱할 수 있습니까?

4kb 벡터 템플릿, 낮지만 허용 가능한 신호를 안정적으로 생성하는 최소 입력은 다음과 같습니다.

20-25ng. 그리고 더 강한 신호에는 최소한 50-100ng의 DNA가 필요합니다. 따라서 유기체의 게놈이 단지 25배(즉, 100kb)인 경우 시퀀싱에 충분한 사본을 갖기 위해서는 최소한 500ng의 DNA가 필요합니다. 그러나 Mycoplasma의 게놈조차도 1000kb를 초과하여 약 5ug의 DNA 입력이 필요합니다. 5 ug의 DNA가 존재하는 경우 시퀀싱 반응이 기능할 가능성은 거의 없습니다. 다른 많은 유기체에 필요한 밀리그램의 DNA 입력은 말할 것도 없습니다.

더 나은 복제 결과를 얻는 방법은 무엇입니까?

다음과 같은 경우 '샘플 대 샘플' 및 '실험 대 실험' 일관성이 모두 향상됩니다.

NS) 변동 최소화: 박테리아 성장 기간과 처리량을 일정하게 유지합니다.
NS) 성장 시간 최소화: 더 나은 품질의 DNA와 더 나은 시퀀싱 결과를 제공합니다.

37 o C에서 하룻밤 성장(즉,

14시간 ) 너무 많은 세포로 배양물을 생산할 수 있어 상업용 정제 컬럼의 용량을 '압도'할 수 있습니다. 또한, 모든 게놈 DNA가 손상되지 않고 세포벽에 접합된 후기 대수기/초기 정지기에 있는 세포가 생성됩니다.

대조적으로, 30 o C에서 하룻밤 성장 또는 37 o C(즉, 5 - 8시간)에서 제한된 성장은 37 o C에서 표준 야간 성장보다 miniprep에서 더 나은 품질의 DNA를 생성하는 경향이 있습니다. 마지막으로, 다음과 같은 경우 시퀀싱 결과가 더 나은 경우가 많습니다. miniprep 크기 컬럼이 아닌 'midi' prep로 정제합니다.

다중 신호를 피하는 방법은 무엇입니까?

가장 일반적으로 시퀀스 데이터의 여러 신호는 시퀀싱 반응에서 여러 템플릿의 존재로 인해 발생합니다(때로는 시퀀싱 프라이머가 템플릿에서 둘 이상의 적절한 위치를 찾을 수 있음). PCR 정지 후 저레벨 신호의 원인은 무엇입니까?도 참조하십시오. 또 다른 가능성을 위해.

NS) 복제된 DNA: 동일한 셀 내에 여러 개의 벡터 복사본(다른 삽입물 포함)이 있거나 깨끗한 단일 콜로니를 선택하지 못했습니다. 삽입물의 크기가 다른 경우 표준 PCR로 복제된 DNA를 테스트하여 두 가지 문제를 모두 피할 수 있습니다.

깨끗한 콜로니 선택의 기회는 콜로니가 눈에 보일 정도로 충분히 클 때 콜로니를 선택하여 여전히 잘 분리되어 있을 때 향상됩니다. 또한, 저배율 범위에서 콜로니를 조사하면 하나의 명백한 콜로니가 실제로 두 개의 인접한 셀에 의해 생성된 경우를 알 수 있습니다(콜로니 모양은 원형이 아닌 '아령 벨'과 유사함). 콜로니를 조기에 선택하면 위성 콜로니(즉, 삽입물에서 항생제 내성 유전자가 없는 콜로니)가 '실제' 콜로니 옆에서 성장할 충분한 시간이 없었습니다. 일반적으로 항생제는 단순히 박테리아에 의한 성장을 방지하므로 항생제 내성 콜로니가 항생제를 중화시키는 화합물이 스며나기 시작하면 위성 콜로니의 박테리아가 자라기 시작하고 삽입물이 또한 DNA가 추출될 때 수확됩니다. 벡터 프라이머로 시퀀싱을 수행하는 경우 삽입 프라이머로 수행하면 이중 신호가 발생하며 신호가 예상보다 약할 수 있습니다.

NS) PCR 제품: 일반적으로 반응에 여러 PCR 산물이 존재한다는 것은 간단한 agarose gel 실험에서 알 수 있습니다. 이 경우 최소한 DNA gel-purification이 필요합니다. 그러나 때로는 하나의 깨끗한 밴드가 실제로 여러 PCR 산물로 구성되는 경우도 있습니다(시퀀싱을 통해 발견할 수 있음). 먼저 DNA를 복제해야 합니다.

씨) 프라이머 문제: 프라이머가 5'-말단에서 분해되었거나 "n-1"(또는 그 이상) nts(프라이머 합성 방식으로 인해 프라이머의 5'-말단에서 nts가 생략됨)로 제조된 경우, DNA 시퀀서에서 '프레임 이동'될 템플릿을 생성합니다.

Sequencing을 위해 PCR product를 세척하는 것은 필수인가요?

시퀀싱 반응을 중단시킬 수 있는 잠재적인 오염 물질을 제거하는 것 외에도 PCR 제품을 세척하는 목적은 원래 프라이머 및 기타 PCR 시약을 제거하는 것입니다. 이상적으로 세척된 템플릿은 낮은 TE 완충액(예: TVLE, 10mM Tris, 0.05mM EDTA pH 8)에 재현탁해야 합니다. 또는 뉴클레아제가 없는 물 및 mdash에 재현탁할 수 있지만 문제는 프라이머 재현탁 완충액 선택에 나와 있습니다. ? 템플릿에도 적용됩니다.

그럼에도 불구하고 PCR 산물의 정제는 강력히 권장되지만 필수는 아닐 수도 있습니다. 예를 들어, PCR product가 충분히 희석되면 PCR product를 먼저 세척하지 않고도 sequencing에 성공할 수 있습니다. 원래 PCR 프라이머가 시퀀싱된 제품의 눈에 띄는 수준을 생성하지 않을 정도로 희석하는 것이 특히 중요합니다. 그렇지 않으면 원래 프라이머가 신호에 노이즈를 도입할 것입니다. 필요한 희석 수준을 결정하는 것은 경험적 과정입니다. PCR 제품을 희석하는 것 외에도 키트(예: ExoSAP-IT&trade)를 사용하여 원래 PCR 시약을 제거할 수 있습니다. 두 접근 방식 모두 Genomics Facility에 제출된 샘플에 성공적으로 사용되었지만 적절한 주의를 기울여 사용해야 합니다.

시퀀싱을 위해 DNA 템플릿을 세척하는 방법은 무엇입니까?

NS) PCR 제품: 강력한 반응을 가정하면 표준 에탄올 침전(저렴한 방법)이 종종 잔류 프라이머 및 프라이머-이량체를 제거하는 데 탁월한 작업을 수행하지만 아세트산 나트륨을 사용하지 마십시오. (정방향 및 역방향 프라이머가 모두 존재하기 때문에) 시퀀싱 반응에서 다중 신호를 생성하기에 충분히 높은 농도에서 소비되지 않은 프라이머를 공동 침전시킬 가능성이 높기 때문입니다. 더 나은 옵션은 Templates_EtOH-EDTA_Preciptation.docx(96웰 플레이트용) 또는 Sequencing-Templates EtOH-EDTA Preciptation.docx(1.5ml 튜브용)에 설명된 대로 70-150mM EDTA(Genomics Facility에서 사용 가능)를 사용하는 것입니다. .

그러나 일부 프라이머는 이러한 프라이머에 대한 표준 EtOH-EDTA 프로토콜에 의한 제거에 특히 내성이 있습니다. Genomics Facility는 프라이머 및 프라이머-이량체를 다음 수준으로 효과적으로 제거하는 '독점' 수정 EtOH-EDTA 프로토콜을 개발했습니다. 시퀀싱 반응에 눈에 띄는 결과는 없습니다. 이 '독점' 방법을 활용하려면 Genomics Facility에 적절한 온라인 제출을 하십시오.

NS) 플라스미드: 상용 컬럼은 시퀀싱에 가장 적합한 템플릿을 제공합니다. 수제 기술을 사용하는 경우 웹 사이트의 "Plasmid Prep"문서를 참조하십시오.

씨) DNA Clean & Concentrator-5 키트 (배급: Genesee Scientific [Zymo Research 제품]): 컬럼 기술을 선호하는 사람들을 위해 DNA 샘플을 잘 세척하고 매우 작은 부피(>6µl)에서 용출을 허용하는 우수한 제품입니다. 평소와 같이, 우리는 다운스트림 애플리케이션을 방해하지 않으면서 pH 문제 또는 사소한 DNAse 오염 문제를 피하기 위해 TVLE(프라이머 재현탁 완충액 선택 참조)에서 용리하는 것이 좋습니다. Zymo는 50 bp ~ 10 kb 범위의 DNA에 대해 회수율이 70-95%라고 명시하고 있으므로 컬럼은 대부분의 프라이머를 제거해야 합니다(일반적으로

18-25 bp oligos) 및 mdash 그러나 경우에 따라 충분한 프라이머 제거를 위해 Select-a-Size Columns(D4080)를 대신 사용해야 할 수도 있습니다. 특히 프라이머-이합체가 문제인 경우. 실험실용 컬럼을 구입하거나 Genomics Facility에서 처리된 샘플을 사용할 수 있습니다.

NS) 상업 칼럼에 대한 참고 사항: 첫째, 컬럼을 이용하여 primer와 primer-dimer를 제거하는 경우에는 제품 사양을 잘 읽어 주십시오. 일부 키트는 염기서열 분석에 문제를 일으키기에 충분한 양의 프라이머를 보유합니다. 둘째, 많은 프로토콜은 세척 에탄올을 추가한 후 5분 회전으로 끝납니다. 그러나 컬럼 아래의 에탄올 증기압은 일부 에탄올이 필터에서 회전하는 것을 방지합니다. 따라서 세척 에탄올(1분)을 스핀아웃하고 Kimwipe에 에탄올 및 오점 수집 튜브를 버리고 최종 스핀(5분)으로 마무리합니다.

시퀀싱 반응에 얼마나 많은 DNA를 사용할 것인가?

가장 흔한 시퀀싱 오류는 너무 많은 DNA(부피 또는 양)를 사용하는 것입니다.

(1) 용량: 부피가 클수록 혼합물에 '반응 죽이는' 오염 물질이 포함될 가능성이 높아집니다.

(2) 수량: 과도한 초기 템플릿은 두 가지 시너지 효과를 가져서 시퀀스 읽기 길이를 크게 줄일 수 있습니다. 더 긴 조각의 주입.

가장 일반적으로 연구자는 표준 분광 광도계를 사용하여 DNA 샘플의 농도를 결정합니다. 그들이 정말로 성실하다면 Nanodrop과 같은 특수 분광 광도계를 사용할 것입니다. 그러나 이러한 장비에는 이러한 작업에 상당한 제한이 있으며(분광 광도계가 "나쁜" 이유 및 대신 수행할 작업 참조) 더 나은 대안이 있다는 점(아래 참조)을 인식하는 것이 중요합니다.

어떤 경우든 프로토콜이 시퀀싱을 위한 적절한 농도의 DNA를 일관되게 생성하지 않는 한, 시퀀싱 전에 DNA 템플릿을 적절하게 정량화하는 단계를 수행하여 시간과 비용을 절약할 수 있습니다. 궁극적으로 DNA 농도 추정치를 사용하여 최적의 DNA 질량을 사용하기 위해 시퀀싱 반응에 추가할 템플릿의 수(µl)를 결정합니다.

  • 분광 광도계가 "나쁜" 이유 및 대신 수행할 작업에 설명된 대로 최소한 일부 플라스미드 샘플을 아가로스 겔에서 실행하는 것이 좋습니다.
  • 그렇지 않으면 일반적으로 정제된 템플릿의 무작위 샘플에서 A260/A280 판독을 수행하고 그에 따라 DNA를 희석하는 것으로 충분합니다. 그럼에도 불구하고 판독값이 비교적 일관되지 않은 경우 모든 템플릿을 처리한 다음 향후 샘플에 대해 더 나은 복제 결과를 얻는 방법을 참조하십시오. 변형 수율의 발생을 최소화합니다.
  • 마지막으로 샘플이 고농축되지 않은 경우 소량의 분광 광도계에서 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. Nanodrops는 이와 관련하여 특히 유용할 수 있으며 오염 염의 존재에 대한 몇 가지 단서를 제공할 것입니다(Nanodrop Tips.pdf에서 논의된 바와 같이 흡광도 그래프에서). Nanodrop Nucleic Acid Guide.pdf도 참조하십시오.

NS) 옵션 A . 저렴한: 유효한 A260 판독을 위해 충분한 PCR 산물을 정제하고(오류 판독 제외), 깨끗한 2% 젤에 연속 희석 참조 사진을 1ng까지 만듭니다. ethidium bromide의 경우 1ng 레인은 가시적인 밴드를 나타내지 않지만 3-5ng의 DNA에서는 매우 희미한 밴드가 나타납니다. 제품을 참조 사진과 비교하여 필요한 희석액을 추정하십시오.

ii) 옵션 B. 비싸다: dsDNA에 삽입되는 염료에 의존하는 기기를 사용하여 세척된 PCR 산물을 정량합니다. 예를 들어, Agilent Bioanalyzer(농도, 크기 분포 및 샘플 무결성) 또는 Qubit(농도만)를 사용할 수 있습니다. 두 플랫폼 모두 서로 다른 애플리케이션을 위한 여러 다른 키트를 가지고 있으며 둘 다 장단점이 있습니다. 불행히도 많은 샘플을 정확하게 정량해야 하는 경우 두 옵션 모두 비용이 많이 듭니다.

iii) 옵션 C. 저렴: 깨끗한 2% 젤(ethidium bromide로 염색)에 1μl 및 3μl의 시료(정제 또는 원시)를 실행합니다. 예를 들어 각 템플릿의 5μl를 20μl의 로딩 염료(TVLE로 20%로 희석)와 혼합합니다. ) 그런 다음 각 샘플에 대해 인접한 웰에서 5 대 15 μl를 전기영동합니다. 원시(즉, 정제되지 않은) PCR 제품을 실행하는 경우 결과를 사용하여 컬럼에서 DNA를 용출하기 위한 부피를 결정합니다(또는 에탄올 침전을 수행하는 경우 재현탁용).

기준: 1µl 밴드가 거의 보이지 않고 3µl 밴드가 희미한 경우(그러나 뚜렷한) 시퀀싱 반응에 1-3μl의 DNA를 사용합니다. 대조적으로, 3 µl 밴드만 보이는 경우 >3 µl 템플릿을 사용하거나 1 µl 밴드가 밝은 경우 템플릿의 희석을 사용합니다.

이 Weak-Strong PCR products.jpg 예에서 모든 템플릿은 시퀀싱 반응에서 1-3μl와 함께 사용하기에 적합할 수 있습니다. 그러나 'A'는 너무 밝아지기 직전입니다 'B'는 완벽합니다 'C'는 다소 약해집니다 'D'는 매우 약합니다(특히 1kb 제품의 경우

500-bp 제품의 2배에 해당하는 사본 수) 및 최소 6ul를 사용해야 하며,

'E'에 대한 450bp 제품은 다음과 같은 경우 훨씬 더 나을 것입니다.

6 μl의 템플릿이 사용되었습니다. 사진에서 밴드 사이즈는 Biorad EZ Load 100 bp Molecular Ruler(#1708352)를 기준으로 합니다.

대조적으로, 이 Strong PCR products.jpg 예에서는 1-3μl의 DNA를 사용하는 시퀀싱 반응이 모든 샘플에 적합할 것입니다. 그러나 'A'와 같은 샘플은 1-3µl을 사용하기에 완벽하지만 'B'와 같은 샘플은 너무 밝기 때문에 사용을 고려할 수 있습니다.

이러한 샘플의 경우 3μl가 아닌 1μl입니다. 사진에서 밴드 사이즈는 Biorad EZ Load 100 bp Molecular Ruler(#1708352)를 기준으로 합니다.

분광 광도계가 "나쁨"인 이유는 무엇이며 대신 어떻게 해야 합니까?

괜찮아. 따라서 "Bad"는 극적인 과장입니다. 그러나 DNA와 관련하여 표준 분광 광도계에는 몇 가지 중요한 제한 사항이 있습니다.

  1. PCR 제품 및 플라스미드: 샘플이 젤에 과부하되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 여러 제품(거의 같은 크기)이 지나치게 넓고 밝은 밴드로 가려질 수 있습니다.
  2. PCR 제품: 적절한 농도의 젤에서 직접 실행할 수 있습니다(단편 크기 기준).
  3. 플라스미드: 이상적으로는 코일형 및 슈퍼코일형을 제거하기 위해 먼저 선형화해야 합니다.
    • 제한 효소를 사용하여 벡터를 한 번(하나의 긴 단편 생성) 또는 두 번(벡터에서 삽입물을 해제하기 위해) 절단할 수 있습니다. 두 방법 모두 장점이 있습니다.
    • 플라스미드를 선형화하면 더 나은 시퀀싱 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 물론 제한 부위는 원하는 판독값 내에 있거나 원하는 판독값과 프라이머 부위 사이에 있을 수 없습니다!

260/230 및 260/280 OD 비율을 해석하는 방법은 무엇입니까?

Nanodrop을 사용하여 DNA를 정량해야 합니까?

220-300 nM, Nanodrop은 기본적으로 무료로 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 자세한 내용은 Nanodrop에서 판독값을 심하게 왜곡할 수 있는 다양한 요인에 대해 알고 있어야 합니다. Nanodrop Tips.pdf 및 Nanodrop Nucleic Acid Guide.pdf를 참조하십시오.

핵산에 대한 Nanodrop 가이드?

Nanodrop 핵산 가이드.pdf는 Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c, 8000 및 1000 분광광도계와 관련된 핵산 측정 지원 정보를 제공합니다. 자세한 장비 및 소프트웨어 기능 관련 정보는 모델별 사용 설명서를 참조하십시오.

특허 받은 NanoDrop™ 샘플 보유 시스템은 표면 장력을 사용하여 두 광섬유 사이에 0.5μL ~ 2μL 샘플을 제자리에 고정합니다. 이 기술을 사용하는 NanoDrop 분광 광도계는 표준 1cm 큐벳을 사용하여 측정한 샘플보다 50~200배 더 농축된 샘플을 측정할 수 있습니다.

단백질에 대한 Nanodrop 가이드?

Nanodrop Protein Guide.pdf는 Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c, 8000 및 1000 분광광도계와 관련된 직접 A280 분석법에 대한 몇 가지 기본적인 단백질 측정 지원 정보를 제공하기 위한 것입니다. 자세한 장비 및 소프트웨어 기능 관련 정보는 모델별 사용 설명서를 참조하십시오.

특허 받은 NanoDrop™ 샘플 보유 시스템은 표면 장력을 사용하여 두 광섬유 사이에 0.5μL ~ 2μL 샘플을 제자리에 고정합니다. 이 기술을 사용하는 NanoDrop 분광 광도계는 표준 1cm 큐벳을 사용하여 측정한 샘플보다 50~200배 더 농축된 샘플을 측정할 수 있습니다. Protein A280 방법은 Trp, Tyr 잔기 또는 Cys-Cys 이황화 결합을 포함하고 280 nm에서 흡광도를 나타내는 정제된 단백질에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 표준 곡선을 생성할 필요가 없으며 소프트웨어 시작 시 단백질 샘플 정량을 위해 준비되어 있습니다. BCA, Pierce 660 nm, Bradford 및 Lowry와 같은 비색 분석에는 표준 곡선이 필요하며 특성화되지 않은 단백질 용액 및 세포 용해물에 더 일반적으로 사용됩니다.


이미지 3

웰 50, 51, 52, 53, 54 및 55의 DNA가 분해됩니다. 웰(59)은 DNA 농도가 매우 높아서 웰 밖으로 나오지 못한다. 56, 59, 60, 61, 62 웰에서 빗이 제대로 제거되지 않았습니다. DNA 샘플은 RNA뿐만 아니라 단백질(59~62)로 심하게 오염되어 있습니다.


내용물

2차원 전기영동은 1차원에서 전기영동으로 시작한 다음 분자를 1차원에서 수직으로 분리하여 2차원에서 전기영동도를 생성합니다. 1차원 전기영동에서 분자는 등전점에 따라 선형으로 분리됩니다. 두 번째 차원에서 분자는 분자 질량에 따라 첫 번째 전기영동도에서 90도로 분리됩니다. 두 분자가 두 가지 다른 특성에서 유사할 가능성이 낮기 때문에 분자는 1차원 전기영동보다 2차원 전기영동에서 더 효과적으로 분리됩니다.

The two dimensions that proteins are separated into using this technique can be isoelectric point, protein complex mass in the native state, or protein mass.

Separation of the proteins by isoelectric point is called isoelectric focusing (IEF). Thereby, a pH gradient is applied to a gel and an electric potential is applied across the gel, making one end more positive than the other. At all pH values other than their isoelectric point, proteins will be charged. If they are positively charged, they will be pulled towards the more negative end of the gel and if they are negatively charged they will be pulled to the more positive end of the gel. The proteins applied in the first dimension will move along the gel and will accumulate at their isoelectric point that is, the point at which the overall charge on the protein is 0 (a neutral charge).

For the analysis of the functioning of proteins in a cell, the knowledge of their cooperation is essential. Most often proteins act together in complexes to be fully functional. The analysis of this sub organelle organisation of the cell requires techniques conserving the native state of the protein complexes. In native polyacrylamide gel electrophoresis (native PAGE), proteins remain in their native state and are separated in the electric field following their mass and the mass of their complexes respectively. To obtain a separation by size and not by net charge, as in IEF, an additional charge is transferred to the proteins by the use of Coomassie Brilliant Blue or lithium dodecyl sulfate. After completion of the first dimension the complexes are destroyed by applying the denaturing SDS-PAGE in the second dimension, where the proteins of which the complexes are composed of are separated by their mass.

Before separating the proteins by mass, they are treated with sodium dodecyl sulfate (SDS) along with other reagents (SDS-PAGE in 1-D). This denatures the proteins (that is, it unfolds them into long, straight molecules) and binds a number of SDS molecules roughly proportional to the protein's length. Because a protein's length (when unfolded) is roughly proportional to its mass, this is equivalent to saying that it attaches a number of SDS molecules roughly proportional to the protein's mass. Since the SDS molecules are negatively charged, the result of this is that all of the proteins will have approximately the same mass-to-charge ratio as each other. In addition, proteins will not migrate when they have no charge (a result of the isoelectric focusing step) therefore the coating of the protein in SDS (negatively charged) allows migration of the proteins in the second dimension (SDS-PAGE, it is not compatible for use in the first dimension as it is charged and a nonionic or zwitterionic detergent needs to be used). In the second dimension, an electric potential is again applied, but at a 90 degree angle from the first field. The proteins will be attracted to the more positive side of the gel (because SDS is negatively charged) proportionally to their mass-to-charge ratio. As previously explained, this ratio will be nearly the same for all proteins. The proteins' progress will be slowed by frictional forces. The gel therefore acts like a molecular sieve when the current is applied, separating the proteins on the basis of their molecular weight with larger proteins being retained higher in the gel and smaller proteins being able to pass through the sieve and reach lower regions of the gel.

The result of this is a gel with proteins spread out on its surface. These proteins can then be detected by a variety of means, but the most commonly used stains are silver and Coomassie Brilliant Blue staining. In the former case, a silver colloid is applied to the gel. The silver binds to cysteine groups within the protein. The silver is darkened by exposure to ultra-violet light. The amount of silver can be related to the darkness, and therefore the amount of protein at a given location on the gel. This measurement can only give approximate amounts, but is adequate for most purposes. Silver staining is 100x more sensitive than Coomassie Brilliant Blue with a 40-fold range of linearity. [삼]

Molecules other than proteins can be separated by 2D electrophoresis. In supercoiling assays, coiled DNA is separated in the first dimension and denatured by a DNA intercalator (such as ethidium bromide or the less carcinogenic chloroquine) in the second. This is comparable to the combination of native PAGE /SDS-PAGE in protein separation.

IPG-DALT Edit

A common technique is to use an Immobilized pH gradient (IPG) in the first dimension. This technique is referred to as IPG-DALT. The sample is first separated onto IPG gel (which is commercially available) then the gel is cut into slices for each sample which is then equilibrated in SDS-mercaptoethanol and applied to an SDS-PAGE gel for resolution in the second dimension. Typically IPG-DALT is not used for quantification of proteins due to the loss of low molecular weight components during the transfer to the SDS-PAGE gel. [4]


  • Magnification is the ability to make small objects seem larger, such as making a microscopic organism visible.
  • Resolution is the ability to distinguish two objects from each other.
  • Light microscopy has limits to both its resolution and its magnification.
  • airy disks: In optics, the Airy disk (or Airy disc) and Airy pattern are descriptions of the best-focused spot of light that a perfect lens with a circular aperture can make, limited by the diffraction of light.
  • diffraction: the breaking up of an electromagnetic wave as it passes a geometric structure (e.g., a slit), followed by reconstruction of the wave by interference

Magnification is the process of enlarging something only in appearance, not in physical size. This enlargement is quantified by a calculated number also called &ldquomagnification. &rdquo The term magnification is often confused with the term &ldquoresolution,&rdquo which describes the ability of an imaging system to show detail in the object that is being imaged. While high magnification without high resolution may make very small microbes visible, it will not allow the observer to distinguish~ 사이 microbes or sub-cellular parts of a microbe. In reality, therefore, microbiologists depend more on resolution, as they want to be able to determine differences between microbes or parts of microbes. However, to be able to distinguish between two objects under a microscope, a viewer must first magnify to a point at which resolution becomes relevant.

Resolution depends on the distance between two distinguishable radiating points. A microscopic imaging system may have many individual components, including a lens and recording and display components. Each of these contributes to the optical resolution of the system, as will the environment in which the imaging is performed. Real optical systems are complex, and practical difficulties often increase the distance between distinguishable point sources.

At very high magnifications with transmitted light, point objects are seen as fuzzy discs surrounded by diffraction rings. These are called Airy disks. The resolving power of a microscope is taken as the ability to distinguish between two closely spaced Airy disks (or, in other words, the ability of the microscope to distinctly reveal adjacent structural detail). It is this effect of diffraction that limits a microscope&rsquos ability to resolve fine details. The extent and magnitude of the diffraction patterns are affected by the wavelength of light (&lambda), the refractive materials used to manufacture the objective lens, and the numerical aperture (NA) of the objective lens. There is therefore a finite limit beyond which it is impossible to resolve separate points in the objective field. This is known as the diffraction limit.


Estimate apparent molecular mass for unknowns

Relative mobility should be calculated for each band of interest and the standard curve used to estimate apparent molecular mass. Because the relationship between mass and Rf is logarithmic, one should interpolate the standard curve data rather than use a trendline that may miss some of the data points. It is especially important to avoid extrapolating the standard curve, since even the logarithmic relationship begins to break down in the top 20% or so of a gel. One can report the mass of an unknown to exceed that of the highest mass standard, but cannot estimate a molecular mass for an unknown with Rf smaller than that of any of the standards. For example, if the Rf for the myosin standard (205 kDa) was 0.18 and the Rf for unknown 1 was 0.15, one reports that unknown 1 had apparent molecular mass > 205 kDa.

Consider resolution in the appropriate region of a gel and thickness of the band of interest when determining significant figures with which to report a mass estimate. For example, suppose the distance between 97,000 and 116,000 kDa standards is 0.5 cm and a band between them is 1 mm thick. You have resolution to the nearest 4,000 Daltons. An estimate of, say, 110 kDa should probably be written as 110 ± 4 kDa.


STING condensates on ER limit IFN response

STING is a key player in the IFN response to cytosolic DNA, and its multimerization is commonly associated with activation of the pathway. A new study now shows that STING forms ‘puzzle’-like condensates to limit the IFN response and constrain antiviral immune activation.

Formation of higher-order assemblies including liquid and gel condensates has recently emerged as a major mechanism of signal transduction in innate immunity 1 . Indeed, activation of pathways through multimerization of sensor and adaptor proteins is known for Toll-like receptor signalling 2 , inflammasome activation 3 , retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) 4 and cyclic GMP–AMP synthase (cGAS) 5 nucleic acid detection, as well as many others. However, the question as to whether and how a multimerization principle may also be involved to inhibit immune pathways has not been fully addressed. In this issue of 자연세포생물학, Yu et al. report that excess 2′,3′-cyclic GMP–AMP (2′,3′-cGAMP) induces STING to phase separate on the endoplasmic reticulum (ER) in a puzzle-like structure, thereby preventing STING overactivation 6 .


Restriction Digestion/Gel Electrophoresis Assignment 1

What we're going to do now is give you some experimental results and let you interpret them, so let's jump right in. You have performed Restriction Digestion and Agarose Gel Electrophoresis on a plasmid you purified, using 3 different Restriction Enzymes, and the gel is shown below. Unfortunately, you forgot to label your tubes or keep good records, and the only things you can remember about the experiment are that your standards are in Lane 5 and your uncut control is in Lane 1, and that you loaded roughly the same amount of total DNA in your sample lanes (1-4). Hey, at least you remembered that much!

2. How many times did the enzyme used in Lane 2 digest the plasmid? Does the data seem reasonable? What is the likely number of base pairs this enzyme recognizes?

3. When DNA appears as a messy, continuous band as it does at the bottom of Lane 3, rather than independent, discreet bands, the effect is known as smearing. What are some likely explanations for the smearing detected in Lane 3? You should be able to come up with at least two.

4. How many times did the enzyme used in Lane 4 digest the plasmid? Does the data seem reasonable?

Answers to Questions

2. How many times did the enzyme used in Lane 2 digest the plasmid? Does the data seem reasonable? What is the likely number of base pairs this enzyme recognizes?    The enzyme digests the plasmid in two places. It is important to think about the state of the DNA before digestion. The DNA used in this experiment was a plasmid, and plasmids are circular. If you cut a circle once, you get one linear fragment. You must cut it a second time to get 2 linear fragments like in Lane 2. The data does seem reasonable because if you add up the approximate sizes of the resulting fragments (roughly 4 kb and 2.5 kb), you get the original size of 6.5 kb. Lastly, it is likely that the enzyme used recognizes a sequence of 6 bases. 6-cutters, if you'll recall, cut an average of once every 4,096 bases. This is just an average, however, so in this case where we have a piece of DNA 6,500 bp long, cutting twice is very reasonable.

3. What are some likely explanations for the smearing detected in Lane 3?    In general terms, smearing is when you have many bands together close enough in size that you cannot distinguish between adjacent bands (i.e., no resolution). With beginning molecular biologists, the most likely reason for the smearing is contamination by some stray nuclease that degraded the DNA into dozens, hundreds, or even thousands of little pieces. Another beginning mistake is to use the wrong buffer, wrong temperature, or wrong conditions. Any or all of these could make the enzyme behave badly, including cutting away at your DNA at multiple, random sites. However, as you do more and more experiments like this, personal error becomes less of a concern and you need to start thinking in terms of the science. If this experiment was performed without significant error, the likely explanation is that a 4-base cutter was used. Cutting an average of once every 256 bases in a 6.5 kb plasmid yields roughly 25 fragments, all smaller than the original. It is unlikely that one could see 25 individual fragments of such a small size, and the smearing pattern is probably what would be detected.

4. How many times did the enzyme used in Lane 4 digest the plasmid? Does the data seem reasonable?    If you said twice, you are correct, but let's see if you were correct for the right reasons. In question 2, it was pointed out that to get two fragments from a circular piece of DNA, you need two cuts. So far so good. It was also mentioned that the total size of the resulting DNA fragments must add up to the original size. Uh oh--they don't, do they? Looking at the gel you see one band approximately 6.5 kb and one large band at roughly 3 kb. Does 6.5 + 3 = 6.5? Not in this class.

Science doesn't lie, it's just sometimes hard to interpret. So break it down. Is there anything significant about 6.5 kb? Yes, it's the size of the original plasmid. This, plus the fact that there is a band in the uncut control (Lane 1) which migrates to the same position, should suggest to you that not all of your DNA was digested (a common occurrence). This leaves the band around 3 kb. Could that band be 3.2 or 3.3 kb instead of 3.0? 용이하게. Unless we plot a standard curve, we're just approximating anyway. Is there anything significant about 3.3 kb? Yes, it's about half of our original sample. If the enzyme cut the plasmid into two roughly equal sized pieces, those pieces would run about the same, and would likely be indistinguishable on a gel. This is further supported by the information about this experiment which states that roughly equal amounts of DNA were loaded into Lanes 1-4. Notice how much darker the 3 kb band in Lane 4 is than the bands in Lane 2. There is twice as much DNA in that band than there is in either of the bands in Lane 2, and the data supports this conclusion.