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HIV 착색 - 생물학

HIV 착색 - 생물학


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HIV가 세포를 감염시키는 방법

일반적으로 바이러스는 게놈이 매우 작기 때문에 매우 제한된 수의 자체 단백질을 암호화할 수 있습니다. HIV는 AIDS가 발병할 때까지 이 세포의 수를 천천히 감소시킵니다.

과학자들은 생물학적 과정이 어떻게 작동하는지 이해하기 위해 모델을 사용합니다. 모델은 프로세스와 관련된 구조의 표현을 보여주는 2차원 다이어그램의 형태인 경우가 많습니다. 표현은 물리적으로 정확할 필요는 없으며 실제로는 훨씬 더 복잡할 수 있는 단순화된 이미지인 경우가 많습니다. 모델의 목표는 프로세스의 이해를 안내하는 것입니다. 이 연습에서는 인간 면역 결핍 바이러스가 숙주 세포를 감염시키는 방법의 모델을 분석해야 합니다. 바이러스는 매우 작으며 작동 방식에 대한 우리의 이해는 주로 추론과 전자 현미경을 사용하여 관찰할 수 있는 것에 기반합니다. 이 연습에서 목표는 감염 단계를 이해하는 동시에 바이러스 재생산에 역할을 하는 구조를 식별하는 것임을 고려하십시오.

HIV 감염

HIV(인간 면역결핍 바이러스)는 다른 유기체의 세포막과 유사한 지질막을 가지고 있습니다. 지질막(b)을 연한 녹색으로 칠하십시오. 멤브레인에 부착된 여러 외피 단백질 (a) 숙주 세포에 부착하는 데 사용됩니다. 봉투 단백질(a)을 주황색으로 지정합니다. 막 안에는 다음을 구성하는 단백질의 또 다른 층이 있습니다. 캡슐 (c), 캡슐을 짙은 녹색으로 채색하십시오.

1 단계

HIV는 특정 숙주 수용체에 부착하여 숙주에 들어갑니다. 바이러스에 올바른 잠금이 있는 숙주 세포에서만 작동하는 특정 키가 있는 것과 같습니다. HIV의 경우 잠금 장치는 T Helper 세포 표면에 위치한 CD4 세포 표면 항원입니다. CD4 항원(e)을 진한 자주색으로 지정합니다. CD4 항원은 세포의 세포막에 위치 (X) 진한 파란색으로 표시되어야 합니다. 이때 바이러스와 세포막이 융합되고 비리온 코어가 세포 안으로 들어간다. 코어에는 바이러스 복제에 필수적인 RNA와 여러 관련 단백질이 포함되어 있습니다. 바이러스의 모든 인스턴스를 색칠하십시오. RNA(g) 분홍색.

2 단계

바이러스가 세포와 융합되면 내용물의 포장을 풀고 세포 표면에 외피 단백질을 남깁니다.

이 바이러스는 또한 감염의 마지막 단계에서 바이러스를 조립하는 데 필수적인 프로테아제(d)라는 단백질의 압축을 풉니다. 프로테아제의 모든 인스턴스를 갈색으로 채색합니다. 바이러스에서 발견되는 세 번째 단백질은 인테그라제(integrase)라는 효소입니다. 이 효소는 바이러스 유전 물질이 숙주 DNA에 통합되는 것을 돕습니다. integrase(f)의 모든 인스턴스를 검정색으로 채색합니다.

바이러스 게놈은 RNA의 형태로 되어 있기 때문에 먼저 RNA를 DNA로 변환하는 효소를 사용하여 역전사효소(h). 역전사효소 ◯의 모든 경우를 노란색으로 채색합니다. HIV 바이러스는 역전사효소와 RNA 방법을 사용하기 때문에 레트로바이러스라고 합니다. 단일 가닥 유전 물질은 DNA 바이러스보다 돌연변이를 더 자주 발생시킵니다. 레트로바이러스의 이러한 변화하는 특성으로 인해 백신을 개발하기가 특히 어렵습니다. 따라서 매년 독감 예방 주사를 맞아야 하지만 평생 한 번만 소아마비 백신이 필요한 이유는 무엇입니까?

DNA는 이제 이중 가닥 분자가 되어 세포 핵으로 이동할 준비가 되었습니다. 바이러스 DNA(i)를 빨간색으로 칠하십시오.

3단계

이제 이중 가닥이 된 바이러스 DNA는 핵(바이러스 DNA의 모든 경우를 계속 빨간색으로 채색)과 핵막(Y)을 회색으로 운반합니다. 핵에서는 인테그라제라는 효소 ◆ 숙주 세포의 정상 DNA와 융합합니다. 바이러스 DNA는 잠복 상태로 수년 동안 세포의 DNA 내에서 지속될 수 있으며, 이는 질병을 치료하거나 치료하려는 노력을 더욱 복잡하게 만듭니다. 색칠하다 숙주 세포 DNA(k) 하늘색. 이제 숙주 DNA(파란색)에 바이러스(빨간색)에 속하는 DNA 섹션이 있음이 분명해야 합니다.

숙주의 세포 효소인 RNA 중합효소를 사용하여 바이러스 DNA는 RNA의 두 스플라이스로 다시 전사됩니다. 이것은 복사기처럼 작동합니다. 세포는 바이러스 DNA를 사용하여 수천 개의 바이러스 RNA 사본을 만듭니다. RNA 중합효소(j)를 분홍색으로 채색합니다.

이 가격에는 두 가지 스플라이스가 있습니다. 바이러스 단백질을 만들기 위한 지침이 포함된 짧은 스플라이스(n)와 원래 바이러스 RNA의 복사본인 긴 스플라이스(m)입니다. 모든 경우에 짧은 스플라이스를 녹색으로, 긴 스플라이스를 연한 자주색으로 지정합니다.

4단계

짧은 스플라이싱된 RNA는 리보솜과 골지 장치가 코드를 사용하여 바이러스 단백질을 구성하는 세포질로 수송됩니다. 골지체(q)를 하늘색으로 칠하십시오. 더 긴 스플라이스는 전체 길이의 바이러스 RNA이며 새로운 바이러스의 핵심이 됩니다. 이 모델에서 많은 단백질이 조립되기를 기다리고 있는 것을 볼 수 있습니다. 이 모든 부품이 적절한 색상으로 지정되어 있는지 확인하십시오.

프로테아제라고 하는 또 다른 효소(바이러스 원본과 함께 제공됨)는 단백질을 최종 기능 형태로 조립하는 데 필요합니다.

5단계

골지체에서 조립된 단백질과 긴 가닥의 완성된 바이러스 RNA를 사용하여 성숙한 바이러스는 숙주 세포에서 싹을 틔웁니다. 출아 과정은 종종 숙주 세포를 파괴합니다. 일단 바이러스 감염은 세포의 DNA와 세포 기계를 가로채서 수백만 개의 새로운 바이러스를 생성할 수 있습니다. 대부분의 바이러스 감염에서 면역 체계는 감염된 세포를 식별하고 바이러스의 새로운 복사본을 만들기 전에 파괴하는 법을 배웁니다.

모든 구조가 색상이 지정되었는지 확인하고 "큰 그림"을 이해하기 위해 5단계를 검토하세요.

질문

  1. HIV 감염에서 다음 각각의 역할을 설명하십시오.
    • 프로테아제
    • 역전사 효소
    • CD4 수용체
    • RNA 중합효소
    • 통합하다
    • 리보솜과 골지체
  2. 레트로바이러스란? 레트로바이러스 백신 개발이 더 어려운 이유는 무엇입니까?
  3. 바이러스에는 어떤 단백질이 포장되어 있습니까?
  4. AZT와 같은 약물은 역전사효소의 기능을 억제함으로써 작용합니다. 인테그라제 가닥 전달 억제제(INSTI)는 인테그라제의 작용을 차단하도록 설계된 항레트로바이러스 약물의 한 종류입니다. AZT와 INSTI가 작동하는 방식을 보여주는 모델을 스케치하십시오.
  5. 항바이러스제의 또 다른 부류는 프로테아제 억제제라고 합니다. 이러한 유형의 약물이 어떻게 작용하는지 설명하십시오.
  6. 천연두 및 소아마비와 같은 바이러스는 RNA 대신 DNA를 포함합니다. 즉, HIV 모델의 일부 단계가 더 이상 필요하지 않습니다. 색칠 공부 페이지 뒷면에 DNA 바이러스가 작동하는 방식을 보여주는 모델을 스케치하십시오. 바이러스 감염 및 복제에 여전히 필요한 모든 단백질 또는 구조를 포함합니다. 모델은 물리적으로 정확할 필요는 없으며 기호는 구조를 나타내는 데 사용할 수 있습니다. HIV 모델을 새 디자인의 템플릿으로 사용하는 것도 허용됩니다. 색상은 필요하지 않지만 모델을 이해하기 쉽게 만들 수 있습니다.


현재의 항바이러스 요법은 혈류에서 거의 감지할 수 없는 수준까지 HIV-1을 억제할 수 있습니다. 그러나 이 요법이 중단되면 바이러스의 수가 다시 증가하기 시작하여 계속해서 면역 체계의 방어를 정복할 수 있습니다. 이것은 휴면 또는 '잠재' 상태에 있는 바이러스가 재활성화될 때 발생합니다. 제한된 유전자 발현과 제로 바이러스 복제를 특징으로 하는 잠복 바이러스는 면역 체계에 숨겨져 있으며 재활성화되지 않는 한 항바이러스 약물의 영향을 받지 않습니다.

잠복 HIV-1은 면역 세포의 게놈 내에 통합되어 있으며, 주로 휴지기 CD4 + T 세포와 그보다는 덜하지만 대식세포에 있습니다(Churchill et al., 2016). HIV-1의 잠복성 저장소를 나타내는 세포는 일반적으로 매우 드물고 인접한 감염되지 않은 세포와 분리하기 어렵습니다. 이것은 연구에 사용할 수 있는 세포가 거의 없다는 것을 의미하며, 이는 차례로 바이러스 재활성화 이면의 메커니즘에 대한 우리의 이해를 심각하게 방해했습니다. 이제 eLife에서 Emilie Battivelli를 제1저자로 포함한 Eric Verdin과 동료들은 숨겨진 잠복 바이러스가 있는 세포를 식별하고 분리할 수 있도록 하는 개선된 '이중 색상 바이러스'에 대해 보고합니다(Battivelli et al., 2018).

지난 10년 동안 많은 HIV-1 연구는 약리학적 분자를 사용하여 '쇼크 앤 킬' 접근 방식에서 잠복기를 역전시킴으로써 잠재적인 바이러스 저장소를 제거하는 방법을 모색했습니다(Deeks et al., 2012). 재활성화된 바이러스에서 증가된 유전자 발현 수준은 잠복적으로 감염된 세포의 표면에 바이러스 항원이 나타나도록 해야 합니다. 이것은 차례로 면역 체계가 이러한 세포를 찾아 제거하고 일반적으로 바이러스를 항바이러스 치료에 다시 취약하게 만듭니다(Churchill et al., 2016 Margolis et al., 2016). 그러나 이 쇼크 앤 킬 접근 방식은 제한된 성공을 거두었을 뿐이었습니다. 대부분 잠복 상태에서 바이러스를 완전히 재활성화할 수 없었기 때문입니다.

바이러스를 재활성화하기 위한 보다 효과적인 접근 방식을 개발하려면 먼저 잠복 바이러스를 연구하기 위해 휴면 중인 CD4 + T 세포를 얻을 수 있는 더 나은 방법이 필요합니다. 서로 다른 프로모터의 제어 하에 두 개의 형광 리포터가 있는 소위 이중 색상 바이러스가 이를 도울 수 있습니다(Calvanese et al., 2013 Chavez et al., 2015). 이 리포터 바이러스의 원래 버전(HIVDuoFluoI), 감염된 세포는 빨간색으로 빛나며 감염되지 않은 세포와 명확하게 구별됩니다. 통합 바이러스가 활성화되면 녹색 형광 단백질도 생성되고 세포는 빨간색과 녹색으로 나타납니다. 따라서 잠복 감염 세포(즉, 통합되었지만 비활성 바이러스가 있는 세포)는 순수한 붉은 색으로 쉽게 구별할 수 있습니다.

이 도구가 이론적으로 작동해야 하는 방식이었지만 개선의 여지가 있었습니다. HIV에 사용된 일부 서열DuoFluoI 이 이중 색상 바이러스는 쉽게 재결합할 수 있었습니다. 즉, 이 이중 색상 바이러스는 보고자를 잃는 경향이 있어 안정적으로 추적할 수 없었습니다. Battivelli et al. – 미국, 스웨덴, 브라질 전역의 Gladstone Institutes, UCSF, Buck Institute for Research on Aging 및 기타 연구소에 기반을 두고 있는 이들은 개선된 이중 색상 바이러스를 만들기 위해 일부 시퀀스를 변경하여 이 특정 문제를 극복했습니다. HIV라는 새 버전GKO, HIV-1 특정 프로모터의 제어 하에 다른 녹색 리포터(코돈 전환 eGFP)를 포함합니다. 또한 구성적 프로모터의 제어 하에 적색 형광성 단백질(돌연변이 쿠스비라 오렌지)이 아닌 관련 없는 오렌지색을 갖는다.

HIVGKO Battivelli et al. 재활성화될 수 있는 잠복 바이러스의 통합 부위를 조사하고 해당 부위 주변의 유전 물질이 핵에 어떻게 포장되어 있는지 이해합니다('염색질 컨텍스트'라고도 함). 그런 다음 이 결과를 재활성화할 수 없는 바이러스의 결과와 비교할 수 있습니다. Battivelli et al. 다른 메커니즘을 통해 잠복 저장소를 재활성화하는 것으로 알려진 여러 약물의 효능을 비교하기 위해 연구를 설계했습니다(Barton et al., 2016 Conrad et al., 2017 Mehla et al., 2010).

테스트한 모든 약물은 함께 사용하지 않는 한 제한된 재활성화를 보였습니다. Battivelli et al. 그런 다음 감염된 세포의 세 가지 다른 그룹에서 HIV-1 삽입을 매핑했습니다. 첫 번째 그룹에는 바이러스가 통합된 세포가 포함되어 있었는데, 이 세포는 적극적으로 자체 복제를 생성하거나 생산적으로 감염된 세포를 생성했습니다(그림 1). 두 번째 그룹과 세 번째 그룹은 각각 재활성화되지 않은 세포와 잠복 감염 세포로 재활성화되었습니다. Battivelli et al. 통합 바이러스의 염색질 맥락을 추가로 정의하고 생산적으로 감염된 세포와 재활성화된 잠복 감염 세포 둘 다 내의 바이러스가 주로 전사된 유전자 및 인핸서의 활성 염색질에 상주한다는 것을 발견했습니다(Chen et al., 2017). 그들의 분석은 재활성화되지 않은 잠복기에 감염된 세포에서 발견되는 바이러스가 핵 외피의 내부 표면인 핵 층을 둘러싸고 있는 단백질의 조밀한 그물망과 상호작용하는 큰 게놈 영역 내에서 검출된다는 것을 보여주었습니다(Guelen et al., 2008 Marini et al. ., 2015). 재활성화될 수 있는 일부 억제된 바이러스는 재활성화된 잠복 감염 세포의 동일한 영역에서도 발견되었습니다.

HIV에 감염된 T 세포의 주사 전자 현미경 사진.

인간 면역 결핍 바이러스(HIV 노란색)는 생산적으로 감염된 T 세포(빨간색)의 표면에서 싹을 틔웁니다.

테스트한 모든 약물이 잠복 바이러스의 작은 부분만 부분적으로만 재활성화했다는 사실은 HIV-1의 잠복 저장소가 본질적으로 이질적이라는 것을 의미합니다. 이 발견은 또한 HIV-1의 전사 억제가 숙주 세포의 게놈에서 통합되는 맥락에 의해 영향을 받을 수 있다는 사실을 분명히 지적합니다. 이것은 이러한 맥락이 HIV-1 감염의 운명과 직접적으로 연관될 수 있는 첫 번째 연구이기 때문에 HIV-1이 인간 게놈(특히 T 세포에서)을 통합하여 통합하는 방법에 대해 배워야 할 많은 교훈이 있음이 분명해졌습니다. 그리고 지속하십시오.


NIAID에서 HIV/AIDS 연구가 우선순위인 이유는 무엇입니까?

HIV는 여전히 주요 전 세계 공중 보건 문제입니다. HIV 치료와 예방은 자신의 HIV 상태를 아는 것에서 시작됩니다. HIV 감염자들이 건강하게 장수하고 다른 사람에게 HIV가 전염되는 것을 방지하기 위한 효과적인 치료법이 있습니다. HIV 음성인 사람들을 위한 추가 예방 도구가 있습니다. 기존의 치료 및 예방 방법 외에도 HIV 대유행을 영구적으로 종식시키기 위해서는 안전하고 효과적인 백신이 필요합니다. NIAID는 생의학 HIV/AIDS 연구를 위한 주요 미국 정부 기관으로서 새로운 전염을 예방하고 HIV 관련 사망 및 합병증을 종식시키며 치료법을 찾기 위한 연구를 수행하기 위해 최선을 다하고 있습니다.


HIV의 증상은 무엇입니까?

HIV에는 여러 가지 증상이 있습니다. 모든 사람이 같은 증상을 겪는 것은 아닙니다. 그것은 사람과 그들이 속한 질병의 단계에 달려 있습니다.

다음은 HIV의 3단계와 사람들이 경험할 수 있는 몇 가지 증상입니다.

1단계: 급성 HIV 감염

HIV 감염 후 2~4주 이내에 약 3분의 2가 독감과 유사한 질병에 걸립니다. 이것은 HIV 감염에 대한 신체의 자연스러운 반응입니다.

독감 유사 증상에는 다음이 포함될 수 있습니다.

  • 오한
  • 발진
  • 식은 땀
  • 근육통
  • 목 쓰림
  • 피로
  • 부은 림프절
  • 구강 궤양

이러한 증상은 며칠에서 몇 주까지 지속될 수 있습니다. 그러나 일부 사람들은 이 초기 HIV 단계에서 전혀 증상이 없습니다.

이러한 증상이 있다고 해서 HIV에 감염되었다고 가정하지 마십시오. 다른 질병으로 인한 증상과 유사할 수 있습니다. 그러나 HIV에 노출되었을 수 있다고 생각되면 HIV 검사를 받으십시오.

  • 가까운 HIV 테스트 사이트 찾기—일차 진료 제공자의 사무실, 지역 보건부, 보건소 또는 기타 여러 장소에서 HIV 검사를 받을 수 있습니다. HIV Services Locator를 사용하여 가까운 HIV 테스트 장소를 찾으십시오.
  • 최근 감염에 대한 HIV 검사 요청—대부분의 HIV 검사는 HIV 자체가 아니라 항체(신체가 HIV에 대한 반응으로 만드는 단백질)를 감지합니다. 그러나 감염 후 신체가 생성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있습니다. HIV 감염을 더 빨리 감지할 수 있는 다른 유형의 검사가 있습니다. 최근에 HIV에 노출되었다고 생각되면 의사나 진료소에 알리고 검사를 통해 조기 감염을 감지할 수 있는지 문의하십시오.
  • 당신의 상태를 알고—검사를 받은 후 검사 결과를 확인하십시오. HIV 양성인 경우 가능한 한 빨리 의사의 진찰을 받아 HIV 약으로 치료를 시작하십시오. 그리고 주의하십시오: 감염 초기 단계에 있을 때 HIV를 다른 사람에게 전염시킬 위험이 매우 높습니다. 전염 위험을 줄이기 위한 조치를 취하는 것이 중요합니다. HIV 음성인 경우 음성을 유지하는 데 도움이 되는 노출 전 예방(PrEP)과 같은 예방 도구가 있습니다.

2단계: 임상 대기 시간

이 단계에서 바이러스는 여전히 증식하지만 매우 낮은 수준입니다. 이 단계의 사람들은 아프거나 증상이 없을 수 있습니다. 이 단계는 또한 만성 HIV 감염.

HIV 치료 없이 사람들은 10년 또는 15년 동안 이 단계에 머물 수 있지만 일부는 이 단계를 더 빨리 통과합니다.

처방된 대로 매일 HIV 약을 복용하고 감지할 수 없는 바이러스 양을 얻고 유지하면 건강을 보호할 수 있고 HIV를 성 파트너(들)에게 전염시킬 위험이 없습니다.

그러나 바이러스 부하가 감지될 수 있는 경우 ~ 할 수있다 증상이 없더라도 이 단계에서 HIV를 전염시킵니다. 바이러스 수치를 확인하기 위해 정기적으로 의료 서비스 제공자를 만나는 것이 중요합니다.

3단계: 에이즈

HIV가 있고 HIV 치료를 받고 있지 않은 경우, 결국 바이러스는 신체의 면역 체계를 약화시키고 AIDS로 진행될 것입니다(후천성 면역결핍 증후군). 이것은 HIV 감염의 후기 단계입니다.

AIDS의 증상은 다음과 같습니다.

  • 빠른 체중 감소
  • 반복되는 열 또는 심한 식은땀
  • 극도의 설명할 수 없는 피로
  • 겨드랑이, 사타구니 또는 목의 림프선의 장기간 부종
  • 일주일 이상 지속되는 설사
  • 입, 항문 또는 생식기의 염증
  • 폐렴
  • 피부 위 또는 아래 또는 입, 코 또는 눈꺼풀 안쪽에 빨간색, 갈색, 분홍색 또는 자줏빛 반점
  • 기억 상실, 우울증 및 기타 신경 장애

이러한 각각의 증상은 다른 질병과 관련될 수도 있습니다. HIV 감염 여부를 확실히 알 수 있는 유일한 방법은 검사를 받는 것입니다. HIV 양성인 경우 의료 제공자는 특정 의학적 기준에 따라 HIV가 3단계(AIDS)로 진행되었는지 진단합니다.

HIV 질병의 심각한 증상과 질병의 대부분은 신체의 면역 체계가 손상되었기 때문에 발생하는 기회 감염에서 비롯됩니다. 이러한 증상 중 하나라도 발생하면 의료 서비스 제공자에게 문의하십시오.


면역 체크포인트 분자

만성 바이러스 감염에서 높은 항원 부하가 지속적으로 T 세포를 자극하여 T 세포 고갈이라고 하는 점진적인 기능 상실을 초래합니다(69, 70). 이 기간 동안 T 세포는 면역 체크포인트 분자(IC)로 알려진 일부 억제 수용체의 발현 증가를 보여 활성화 임계값을 증가시켜 면역 반응을 억제합니다. 이러한 IC에는 프로그램된 세포 사멸-1(PD-1), 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4), 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3), T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인(TIGIT), T가 포함됩니다. 세포 면역글로불린 및 뮤신 3(TIM-3), CD160 및 2B4(CD244). Fromentin et al. CD4 + T 세포에서 PD-1, LAG-3 및 TIGIT의 발현이 통합된 HIV DNA를 보유하는 세포의 빈도와 양의 상관관계가 있음을 보여주었습니다(71). 더 중요하게는, 그들은 이러한 마커를 발현하는 세포가 ART 동안 여러 메모리 CD4 + T-세포 서브세트에서 HIV 감염에 대해 풍부하다는 것을 관찰했습니다. 유도성 HIV 프로바이러스의 대부분은 이러한 마커 중 하나 이상을 발현하는 메모리 CD4 + T 세포에서 발견되었습니다(71). 보다 최근에, 동일한 그룹은 CD45RA − , 㬔㬡 + , TIGIT + 표현형(72). 이러한 연구에 따라 Fromentin et al. 최근에 보고된 생체 외 잠복기로부터의 HIV 재활성화는 ART 억제 개인의 CD4 + T 세포에서 PD-1 차단에 의해 향상되지만(73), 다른 그룹은 그러한 효과를 입증할 수 없었습니다(74). 또한, Hurst et al. ART 이전에 측정된 IC의 발현이 ART 중단 후 바이러스 반동까지의 시간을 예측하여 T 세포 고갈 마커가 바이러스 전사 경향이 더 높은 잠복적으로 감염된 세포를 식별할 수 있음을 확인했습니다(75).

Perreau 그룹(76& #x0201378). 특히, Tfh는 제한된 CTL 기능을 갖는 면역학적 특권 부위인 LN B-세포 모낭 내의 배중심에 국한된다(79). 이것은 혈액이나 LN에서 분리된 다른 PD-1 음성 기억 CD4 + T 세포 집단과 비교하여 PD-1 + /Tfh 세포가 복제 가능한 HIV가 풍부한 이유를 설명할 수 있습니다(77). 그러나 다수의 항레트로바이러스 약물의 세포내 농도는 말초혈액에 비해 림프절에서 감소된 것으로 나타났으며(80�), 림프절에서 감염성 바이러스가 지속되는 또 다른 가능한 이유를 제공합니다. 흥미롭게도 McGary et al. CTLA-4 + PD-1 − 메모리 CD4 + T 세포가 ART 처리된 붉은털 원숭이에서 SIV 지속성에 유의하게 기여한다고 보고했습니다(83). CTLA-4 + PD-1 − 메모리 CD4 + T 세포는 주로 Treg로 구성된 부분집합으로 여러 조직에서 SIV DNA가 풍부하고 복제 가능한 감염성 바이러스를 포함하는 것으로 나타났습니다. PD-1 + /Tfh 세포와 대조적으로, SIV-풍부 CTLA-4 + PD-1 − Treg 세포는 LN B-세포 여포 외부에 국한되어 있습니다. 또한, ART에서 HIV에 감염된 개체에서 HIV DNA를 보유하는 CTLA-4 + PD-1 − 기억 CD4 + T 세포도 B 세포 여포 외부에 지속되어 장기간 잠복 바이러스 저장소에 기여했습니다(83).

고갈을 지시하는 매개변수에 대한 더 나은 정의는 기능적으로 열등한 반응을 방지하거나 이를 ȁ활성화”하는 방법의 개발을 촉진하는 것입니다(84). IC 억제제는 현재 악성 종양 치료에 이미 사용되고 있습니다. 이 치료법은 HIV 특이적 CD8 + T 세포 이펙터 기능을 강화하고 잠복기에서 HIV 발현을 재활성화하는 두 가지 방식으로 HIV 감염에 효과가 있습니다(85, 86). 그러나 IC 차단제의 사용을 조사한 증례 보고와 임상 시험에서는 상반된 결과가 나왔습니다(87, 88). 독성도 중요한 관심사로 나타납니다(89).


항체는 HIV에 감염된 세포를 죽이기 위해 어떻게 진화합니까?

HIV에 대한 효과적인 항체 반응은 자연 감염 동안과 백신 접종 후 모두 드뭅니다. 결과적으로, 많은 연구 그룹은 생산을 자극할 백신을 설계하기 위해 드물지만 강력한 항체를 식별하고 특성화하는 데 노력을 집중했습니다. HIV에 대한 강력한 항체의 한 유형은 항체 의존성 세포 세포 독성(ADCC)을 유발할 수 있는 항체입니다. 이 항체는 세포 표면의 병원체 유래 항원에 결합하여 면역 세포가 이를 인식하고 감염된 세포를 죽이는 마커 및 가교 역할을 합니다. 그 중요성에도 불구하고 HIV-특이적 ADCC 항체를 생성하는 발달 경로는 여전히 파악하기 어렵습니다.

항체 계통을 추론하기 위해 컴퓨터 방법과 결합된 종단 항체 시퀀싱 데이터를 사용하여 Fred Hutch의 Overbaugh(인간 생물학) 및 Matsen(공중 보건 과학) 연구소의 연구원들은 자연 HIV 동안 발생한 6개의 ADCC HIV-1-특이적 항체의 진화를 재구성했습니다. 전염병. 최근 저널에 발표된 연구 이라이프, 박사후 연구원인 Dr. Laura Doepker와 연구 기술자 Sonja Danon이 주도했습니다. Danon은 HIV 백신 디자인에 대한 이 연구의 기여를 반영하여 다음과 같이 말했습니다. HIV. 이것은 그들의 발달에 대한 기초적인 이해가 백신 환경에서 어떤 돌연변이를 이끌어내는 데 도움이 될 것인지를 밝혀주기 때문에 중요합니다.”

Laura Doepker 박사가 제공한 이미지.

ADCC 기능을 가진 6개의 단일클론 항체는 HIV-1 감염의 위험 요인과 자연사를 조사한 1993년 공개 코호트 연구에 등록된 케냐 여성에게서 이전에 분리되었습니다. 성숙한 ADCC 항체를 발생시키는 가능한 발달 경로를 재구성하기 시작하기 위해 연구자들은 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 이전 시대부터 다양한 시점에서 수집된 세로 혈액 샘플에서 항체 가변 영역(VR) 유전자 서열을 얻었습니다. - 감염 후 4년까지 감염. 이 데이터와 사용할 수 없는 VR 영역에 대한 일부 계산 추론을 사용하여 연구자는 사용 가능한 시점에서 두 계통의 항체를 재구성하고 ADCC 기능을 테스트했습니다. 감염 후 462일까지 ADCC 기능은 두 계보에서 모두 개발되었습니다.

다음으로, 이 그룹은 HIV 특이성과 ADCC 기능을 부여하는 계통 중간체를 특성화하려고 했습니다. 항체 진화 연구의 특징인 희소 데이터를 처리하도록 특별히 설계된 접근 방식인 베이지안 계통 발생 혈통 추론이라는 계산 방법론을 사용하여 중간체의 재구성을 수행했습니다. 이 방법으로 과학자들은 높은 통계적 신뢰도로 연대순으로 조상 중간체를 식별했습니다. 계산적으로 추론된 혈통 중 일부는 세로 샘플에서 얻은 NGS 시퀀스와 밀접하게 일치하여 계산 혈통 재구성 방법을 검증했습니다.

항체는 상보성 결정 영역(CDR)과 프레임워크 영역(FWR)으로 세분화된 VR을 포함하는 경쇄와 중쇄로 구성됩니다. 추론된 중간체가 해결되면 연구자는 추론된 중쇄 및 경쇄의 가능한 모든 조합(시간순으로 일치)으로 항체를 구축하여 항체 기능에 기여하는 사슬당 돌연변이를 결정했습니다. 그들은 먼저 중간 중간체를 테스트했고 ADCC 기능이 이미 존재한다면 중간 중간체에 집중했습니다. 또는 ADCC 기능이 중간에 존재하지 않는 경우, 그들은 항원 결합 친화도 및 ADCC 기능을 평가하기 위해 post-middle 유추 중간체에 집중하였다.

모든 계통에 걸쳐 항원 결합 및 ADCC 기능의 획득은 종종 CDR의 돌연변이를 필요로 했습니다. 흥미롭게도 ADCC 효능의 향상에는 FWR에서 대체가 필요했습니다. Doepker 박사는 이 발견의 의미를 설명했습니다. 항체는 이 영역을 쉽게 돌연변이시키지 않지만, 우리 연구는 HIV 감염 후 수년 동안 수집된 샘플에 초점을 맞추었기 때문에 이러한 항체 계통은 만성 감염 조건에서 그렇게 할 시간이 있었습니다. 급성 및 만성 감염 조건에서 항체 프레임워크 영역의 돌연변이가 얼마나 빨리 발생할 수 있는지 매우 궁금합니다. 더욱이, 항체에서 돌연변이 비율을 변경하는 방법은 아직 아무도 모릅니다(예: 프레임워크 영역에서). 항체 프레임워크 영역 돌연변이를 의도적으로 자극하는 것은 백신 연구에서 미개척 분야이지만 성공적인 HIV 백신을 위한 중요한 길이 될 수 있습니다.”

Danon은 결합 친화도와 ADCC 기능의 상관 관계에 관한 연구의 또 다른 흥미로운 발견을 강조했습니다. 예를 들어, 유사한 항원 결합 친화도를 갖는 동일한 계통의 두 항체에도 불구하고 하나는 ADCC를 매개할 수 있지만 다른 하나는 그렇지 않습니다. 또 다른 예에서, 2개의 항체 계통은 크게 다른 결합 능력을 가졌지만 동등한 수준의 ADCC 활성을 이끌어냈습니다. 이는 ADCC 효능에 영향을 미치는 다른 요인이 작용하고 있음을 시사하며 이러한 요인이 무엇인지 더 자세히 이해하는 데 매우 관심이 있습니다.”

이 작업은 교육 보조금 및 교수진 학자 보조금 및 Howard Hughes Medical Institute의 교수 학자 보조금을 포함한 NIH의 보조금으로 지원되었습니다.

Fred Hutch/UW Cancer Consortium 회원 Julie Overbaugh와 Erick Matsen이 이 연구에 기여했습니다.


HIV의 진화적 과거와 미래에 대한 이해

프레드 허치(Fred Hutch)의 진화생물학자들은 HIV가 인간을 감염시킬 수 있기 전에 어떻게 진화했는지, 그리고 바이러스보다 한 발 앞서기 위해 HIV가 앞으로 어떻게 변할지 연구하고 있습니다. iStock 스톡 사진

편집자 주: Fred Hutch는 암 연구 센터로 가장 잘 알려져 있지만 HIV 연구의 허브이기도 합니다. 이것은 분자 수준에서 HIV를 조사하는 것부터 치료법을 찾는 것, 세계에서 가장 큰 HIV 백신 임상 시험 네트워크를 운영하는 것까지 광범위한 작업을 세계 AIDS의 날로 이끄는 시리즈 중 하나입니다.

우리는 모두 과거에 의해 형성됩니다. 우리 바이러스도 마찬가지라는 것이 밝혀졌습니다.

약 100년이 된 HIV는 인간 바이러스 현장에 비교적 최근에 등장했습니다. 그러나 그 뿌리는 훨씬 더 멀리 뻗어 있습니다. 바이러스가 어디에서 왔는지 이해하면 바이러스가 어디로 가고 있는지, 어떻게 막을 수 있는지 이해하는 데 도움이 될 수 있다고 진화 생물학자들은 말합니다.

프레드 허친슨 암 연구 센터의 바이러스학자인 마이클 에머만 박사는 HIV의 "조상은 수백만 년 전으로 거슬러 올라간다"고 말했습니다.

Emerman은 HIV가 생겨나게 된 진화적 사건을 연구하는 연구팀을 이끌고 있습니다. HIV가 인간 바이러스이기 이전에 HIV의 전신은 감염된 다른 영장류의 면역 체계에 의해 형성되었습니다. 인간이 HIV에 감염되기 전에 우리의 면역 체계와 방어 단백질은 다른 오래된 바이러스에 의해 형성되었습니다.

에머만은 그 역사의 양면을 이해하는 것이 바이러스와 그것이 인간에게 왜 위험한지를 이해하는 데 중요하다고 말했습니다.

HIV의 고대 과거

HIV는 약 천만 년 전의 SIV 또는 원숭이 면역결핍 바이러스로 알려진 원숭이 바이러스에서 발생했습니다. 최소 40종 이상의 아프리카 원숭이가 고유한 버전의 SIV를 가지고 있으며 대부분의 경우 동물과 바이러스는 오랜 세월에 걸쳐 함께 적응했기 때문에 평화롭게 함께 존재합니다. SIV는 HIV가 우리에게 미치는 것보다 원숭이 숙주에게 훨씬 덜 위험합니다.

천년에서 20,000년 전 사이의 보다 최근의 진화론적 과거의 언젠가 아프리카 침팬지가 SIV에 감염된 원숭이를 먹고 SIVcpz로 알려진 원숭이 바이러스의 슈퍼 균주에 감염되었습니다. 재정렬. 이 새로운 유전자 조합으로 인해 원숭이 바이러스는 침팬지의 면역 체계에 적응할 수 있었습니다.

그 후 약 100년 전 중앙아프리카에서 SIVcpz가 침팬지에서 인간으로 옮겨갔고 몇 가지만 더 추가하면 현재 우리가 HIV로 알고 있는 바이러스로 변형되었습니다.

진화 바이러스학자 마이클 에머만(Michael Emerman) 박사가 프레드 허치(Fred Hutch)에서 열린 HIV 치료를 위한 세포 및 유전자 치료에 관한 2017 컨퍼런스 개막식에서 연설하고 있습니다. Robert Hood / Fred Hutch News Service의 사진

오늘의 HIV

과학자들이 당시 AIDS 대유행의 원인으로 HIV를 발견한 지 30년 이상이 지났지만 여전히 바이러스에 대해 이해하지 못하는 것이 많습니다. Emerman과 그의 연구팀은 HIV가 인간 면역 체계에 적응하도록 진화한 방법을 연구하지만, 대부분의 연구는 바이러스에 대해 방어하거나 방어하지 못하는 단백질을 생성하는 인간 및 기타 영장류 유전자에 초점을 맞추고 있습니다.

그의 실험실 팀은 HIV에 대해 방어적으로 작용할 수 있는 모든 인간 단백질을 찾기 위해 체계적인 사냥을 수행하고 있습니다. 이러한 단백질 중 많은 부분이 알려져 있지만 Emerman은 과학자들이 이미 발견한 단백질에 대해 더 많은 것을 발견하고 더 이해해야 할 것이 있다고 생각합니다. 그의 팀은 또한 사람들 사이에서 이러한 항바이러스 단백질의 변이를 이해하기 위해 노력하고 있습니다. 한 사람이 본질적으로 HIV와 싸울 수 있는 능력을 향상시킬 수 있는 것은 무엇입니까? 이러한 작업은 우리의 면역 체계 치료 접근 방식의 격차를 막아야 한다는 점을 지적함으로써 HIV 치료 연구에 정보를 제공할 수 있다고 Emerman은 말했습니다.

“우리는 [HIV]가 인간에게 어떻게 적응했는지 배웁니다. 우리는 인간이 모두 평등하지 않은 이유를 배웠습니다. 그렇다면 인구의 사람들 사이의 유전자 차이는 무엇입니까?” 그는 말했다. "우리는 인간에게서 어떤 요소가 빠져 있는지 배웠습니다. 그렇다면 다른 영장류가 가지고 있는 인간 타고난 면역 체계의 구멍은 무엇입니까?"

프레드 허치(Fred Hutch) 진화 생물학자인 하미트 말릭(Harmit Malik) 박사와 함께 Emerman은 우리보다 HIV에 대해 더 강력한 단백질을 만들기 위해 기존 항바이러스 단백질을 최적화하여 실험실에서 설계된 단백질인 "초제한 인자"를 개발하는 작업도 하고 있습니다. 이미 있습니다.

HIV의 미래

Emerman의 Fred Hutch 동료이자 진화 생물학자인 Dr. Jesse Bloom은 HIV를 더 잘 이해하기 위해 실험실 조작에 대해 다른 방식을 취하고 있습니다. Hutch 바이러스 학자 Julie Overbaugh 박사와 박사 과정 학생 Hugh Haddox 및 Adam Dingens와 함께 Bloom은 바이러스의 진화적 미래를 예측하는 데 도움이 되는 돌연변이 HIV 라이브러리를 만들고 있습니다.

그의 Fred Hutch 연구실에서 일하는 바이러스학자 Dr. Jesse Bloom. 프레드 허치 파일

최근 2건의 연구에서 연구팀은 HIV에 유전적 돌연변이를 만들어 단백질의 20가지 다른 구성 요소인 각 단일 아미노산을 Env로 알려진 바이러스 단백질의 다른 가능한 모든 아미노산으로 변경했습니다. 연구원들은 돌연변이 라이브러리를 사용하여 실험실에서 인간 세포를 감염시키는 HIV의 능력에 다양한 돌연변이가 어떻게 영향을 미치는지 묻고 있습니다.

지금까지 그들은 광범위 중화 항체로 알려진 일종의 면역 단백질이 바이러스 단백질에 부착되는 Env 영역의 돌연변이가 세포를 감염시키는 바이러스의 능력을 약화시키는 것을 발견했습니다. 이는 HIV 감염을 예방하기 위해 항체를 광범위하게 중화할 수 있는 가능성을 탐구하는 Hutch를 포함한 HIV 백신 연구원들에게 좋은 소식입니다.

이 연구 분야에서 그들의 목표는 특히 HIV 백신이 있는 경우 HIV가 미래에 취할 수 있는 진화적 경로를 예측하는 것입니다. 연구자들이 바이러스가 특정 유형의 면역 단백질에서 돌연변이를 일으킬 가능성이 있는지 여부를 예측할 수 있다면 바이러스보다 한 발 앞서 나가기 위해 더 나은 백신을 설계할 수 있을 것입니다.


HIV/AIDS 연구

프레드 허치(Fred Hutch) 과학자, 생물통계학자, 역학자들은 HIV의 진화 역사를 연구하고 전염병의 경과를 추적합니다. We analyze the results of experimental vaccines and microbicides to prevent the disease. In addition to the design and oversight of HIV vaccine clinical trials at HVTN, our researchers study mechanisms of natural protection found in a small subset of people who can suppress the virus without medication. We also search for broadly neutralizing antibodies, rare proteins that could work against multiple strains of HIV. We are testing new vaccines designed to get immune cells to produce such antibodies reliably — the holy grail of HIV vaccine research. We continue to study new technologies with the goal of curing HIV in people who are already infected.


결과

Time course of Gag-Pol processing and virion maturation

We built a full model of PR catalyzed Gag- and Gag-Pol processing based on mass action Michaelis-Menten reaction kinetics (Materials and Methods). Based on published data on the architecture of the immature HIV-1 particle [22], we set initial concentrations to correspond to 2,280 molecules of Gag (corresponding to 3.619 mM) and 120 molecules of Gag-Pol (corresponding to 0.195 mM) within the confined space of a spherical virus particle with a radius of 63 nm [22] as the starting point for our simulations. By parameterizing all cleavage reactions according to 시험관 내 empirical estimates (Table 1), our model generated a detailed predicted time course for the cleavage process (Figure 2 major intermediates are shown in Figure S1). The timing of virion maturation (virion maturation time, VMT dashed red line in all panels of Figure 2) was estimated based on two criteria for maturation: i) the presence of a sufficient number of liberated CA molecules to form a mature conical capsid (one “capsid unit” corresponding to 1,500 CA monomers [31]), and ii) the concentration of the late processing intermediate CA.SP1 falling below a critical level. Processing at this site is required for mature capsid formation [26], [32]–[34]. A CA.SP1 concentration below 5% of the total initial Gag content is needed to fully alleviate the trans-dominant inhibition effect of this fragment on HIV-1 infectivity [35], and we used this threshold as a criterion for attaining VMT. The time needed for the assembly of the mature cone shaped capsid was not considered in our definition of the VMT, which implies that our estimates for VMT can be regarded as lower bounds however, assembly is likely to be fast compared with the preceding steps of proteolytic processing (see Discussion). Using the default parameters, our model predicted morphological maturation to occur ∼30 min after the start of the process, which is thought to be initiated at the formation of the virion. While there are no reliable data on the timing of virion maturation 생체 내, the fact that morphological maturation intermediates have not been detected by electron microscopy indicates that the process is comparatively fast. Our result is roughly consistent with the current assumption that maturation occurs during or shortly after budding [36], taken together with fluorescence imaging results indicating that most HIV-1 virions are released from the cell within 30 min after formation [37], apparently with a ∼15 min delay after the assembly of the Gag shell beneath the cell membrane [23].

Initial concentrations of Gag and Gag-Pol were set to reflect the quantities within a single virion cleavage rates were parameterized according to 시험관 내 estimates (Table 1). (A) Virus maturation time (VMT) as defined by the molecular species known to govern virion maturation: Morphological maturation (indicated by dashed red line in all panels) is triggered by the decay of the CA.SP1 fragment (blue line threshold of trans-dominant inhibition of particle maturation indicated by dashed horizontal line) and is not limited by the availability of liberated CA molecules (green line threshold of one capsid unit corresponding to 1,500 CA molecules per particle is indicated by solid horizontal line). (B) Generation of catalytically active intermediate dimeric forms containing PR. Full-length Gag-Pol (red line) dimerizes rapidly and N-terminal auto-cleavage gives rise to enzymatically active intermediate dimeric forms (black, blue and green lines). (C) Decay of Gag substrate (black line) and accumulation of final Gag cleavage products. (D) Accumulation of final Pol cleavage products. (E) Enzyme concentrations and related metrics. The ratio PRdPR/Etot indicates the relative contribution of mature PR dimers to the proteolytic activity. The ratio Etot/Stot of the total concentration of active enzyme forms and the total concentration of uncleaved cleavage sites stays below one throughout the simulated time course, which justifies the use of Michaelis-Menten kinetics. 이자형tot – total proteolytic activity Stot – all uncleaved cleavage sites IEF – all active intermediate enzyme (PR) forms RT: p51/p66 heterodimer. All other dimers are indicated in the form M1dM2, where M1,2 are the monomers.

Total proteolytic activity (Figure 2E, green line) peaks around 39 min, and declines afterwards due to the internal cleavage of PR monomers. Remarkably, the combined catalytic activity of all intermediate enzyme forms exceeds that of the fully cleaved PR homodimer until ∼35 min after the start of the process (Figure 2E, blue line indicates the relative contribution of mature PR dimers to the proteolytic activity). Up to the time of VMT (dashed red line), intermediate enzyme forms are predicted to have catalyzed ∼80% of all cleavage reactions. Functional p66/p51 heterodimers of reverse transcriptase (RT) also decline after a peak due to the cleavage of the p66 subunit into p51 and p15 fragments however, this decay is arrested as PR activity is lost (this might occur even faster 생체 내: see Discussion). Finally, we have verified that the total concentration of uncleaved cleavage sites greatly exceeds the total concentration of active enzyme forms throughout the simulated cleavage process (Figure 2E), which justifies the use of Michaelis-Menten kinetics (assuming quasi steady state for the enzyme–substrate complexes).

We also plot the time course of the overall processing of individual cleavage sites in Figure 3A: the figure shows what fraction of a given cleavage site is yet uncleaved (the total concentration of all molecular species that contain the uncleaved site, divided by the initial concentration). The order of cleavage can be defined for fixed thresholds of processing: Figure 3B depicts the order obtained for 50% and 95% processing Figure 3C presents a schematic representation of the order of cleavage events based on 50% processivity. The order of events in our simulations is roughly consistent with the order of events observed 시험관 내 [11], [38], with two exceptions: the removal of the spacer peptide from CA and the cleavage at the N-terminus of PR (p6 pol /PR) occur much faster in the simulations than 시험관 내. These discrepancies arise from the relatively faster rates of cleavage observed during the processing of oligopeptides, which were used to parameterize the model. However, slowing down the processing of the CA/SP1 site to reproduce the results of 시험관 내 processing of full-length Gag (as in [39]) results in VMT>2 hours (see Discussion) we therefore used the parameter set derived from oligopeptide cleavage (Table 1) in the subsequent analyses.

(A) The fraction of a given cleavage site that is yet uncleaved (the total concentration of all molecular species that contain the uncleaved site, divided by the initial concentration of Gag or Gag-Pol, respectively). (B) The order of cleavage defined by the time points when a fixed threshold of processing (50% and 95%), indicated by horizontal lines, has been reached. (C) Schematic representation of the proposed order of processing events in HIV-1 Gag and Gag-Pol, respectively. The size of the arrowheads indicates different rates of cleavage, with large arrowheads representing faster cleavage. The order of processing for Gag is based on the times needed to attain 50% processing in the model, as in (B). Note that the sizes of arrowheads are not drawn to scale.

We thus conclude that our model is able to capture most known characteristics of the cleavage process, and proceed to analyze further properties of the system, for which little or no empirical data exist yet.

Rates of Gag-Pol auto-cleavage and CA/SP1 cleavage set the time scale for virion maturation

We next investigated the sensitivity of the maturation time to the parameters of the model. These analyses provide insight into the sensitivity of the results to the uncertainty of the parameters, and also predict the response of the system to possible interventions that affect individual steps of the process. We first varied one parameter at a time (see Table 1 for the list of all 33 parameters) in the range of 0.1 to 10 times its default value, while fixing all other parameters at their default values (Figure 4A). Within the studied range, varying most parameters had hardly any effect on the virus maturation time, with the exception of two critical parameters, which emerged as dominant factors: the rate constant of auto-cleavage by the full length Gag-Pol dimers, and the catalytic rate constant of heteromolecular cleavage at the CA/SP1 cleavage site. The dependence of VMT on both dominant parameters was very similar: at the lower (slower) end of the studied range, VMT is very sensitive to small changes in these parameters, while at the higher (faster) end, further increase in either rate constant yields diminishing reductions in VMT. We also tested the effect of initial Gag content of the virus. Since HIV-1 particles are not homogeneous, but have been shown to vary with respect to diameter [40] and completeness of the spherical Gag shell [22], [25], this parameter will vary among individual virions [41]. Varying initial conditions from 1,600 to 3,500 molecules of total Gag content (while keeping the Gag∶Pol ratio of 20∶1 constant) had negligible effect on the time course of virion maturation (variation in VMT was ≤1 second).

(A) The effect of varying each parameter individually along a geometric series between 0.1 to 10 times its default value, while fixing all other parameters at their default values. Color symbols depict VMT as a function of the parameters with the strongest effects (케이고양이 of CA/SP1: red rate constant of Gag-Pol auto-cleavage: blue 케이미디엄 of NC/SP2: green 케이미디엄 (yellow) and 케이고양이 (brown) of p6 pol /PR 케이NS of Gag-Pol: purple) the effect of variation in all other parameters is illustrated by black symbols, which are overlaid on the horizontal line positioned at default VMT, indicating no discernible effect. (B–C) Multivariate exploration of the parameter space. All parameters were drawn randomly from lognormal distributions parameterized such that 95% of the values fell in the range of 0.1 to 10 times the default value of the parameters, or 0.01 to 100 times the default for the parameters with no direct empirical estimates. Default parameter values are indicated by solid vertical lines, the limits of the 95% range by dashed vertical lines. The catalytic rate constant of CA/SP1 cleavage (B) had a strong impact on VMT the rate constant of Gag-Pol auto-cleavage had very similar effect. None of the other parameters had any discernible effect on VMT: (C) shows a representative example with VMT plotted against the catalytic rate constant of NC/SP2 cleavage. Results from 10,000 simulations are shown default VMT is indicated by solid horizontal line parameters were plotted on a log scale in all three panels, with a dimension of s −1 in B–C.

We next performed a multivariate exploration of the parameter space. Parameters were drawn randomly from lognormal distributions parameterized such that 95% of the values fell in the range of 0.1 to 10 times the default value of the parameters for the few parameters with no direct empirical estimates (the association and dissociation rate constants of full-length Gag-Pol and partially cleaved PR enzyme forms, and the 케이미디엄 values for the NC/TFP and TFP/p6 pol cleavage sites), we allowed a range with plus/minus two orders of magnitude around the default value. We performed 10,000 simulation runs with independently generated random parameter sets, of which 8,937 achieved virion maturation by 120 min. Median VMT (when censoring uncompleted runs at VMT = 121 min) was 38.5 min (IQR: 22.4–66.6 min) the distribution of VMT was non-normal (Kolmogorov-Smirnov test, p<10 −10 Figure S2). Maturation was triggered by the loss of CA.SP1 inhibition in 7,141 (80%) of the cases where maturation occurred, and we verified that the criterion for the Michaelis-Menten approximation (Stot>Etot) was fulfilled for nearly all (>99%) parameter sets. The dominance of the catalytic rate constants of initial auto-cleavage and CA/SP1 cleavage was confirmed in this analysis. Of the 33 parameters, only four had a significant effect on VMT (Spearman rank correlation test p<0.0015 after Bonferroni correction): this included both dominant rate constants, which also displayed considerable correlation strength (Spearman's Rho of −0.58 and −0.45 for the CA/SP1 catalytic rate constant and for the rate constant of Gag-Pol auto-cleavage, respectively). The catalytic rate constant of the NC/SP2 cleavage and the association rate constant of active (N-terminally free) partially cleaved PR forms also affected the VMT according to this analysis, but displayed only very weak correlation (Spearman's Rho around −0.03). Only the two dominant rate constants had discernible impact on the distribution of plotted VMT values (Figures 4B and C show the influence of a dominant rate constant and of a representative “neutral” rate constant, respectively).

We thus conclude that the time-limiting steps in virion maturation (with current maturation criteria) are the initial auto-cleavage of full-length Gag-Pol and the processing of the CA/SP1 cleavage site.

Compensation and interactions between the dominant rate constants

Given the comparable magnitude of the impact of both dominant parameters on VMT, any effect (mutation or drug) involving one of the rate constants might be compensated by a change in the other. We investigated the potential for such compensation and for interactions (synergy [29], [30] or antagonism) between the rate constants. Figure 5 shows isoclines of VMT (isoboles [30]) with the rate constant of Gag-Pol auto-cleavage plotted against the CA/SP1 catalytic rate constant, with all other parameters fixed at their defaults. All points of an isocline yielded a fixed VMT (analogous to isoboles of combined drug doses of equal activity [30]). The isoclines are hyperbola-like functions with both vertical and horizontal asymptotes. This shape of the functions implies that for any given VMT, there is a minimum value for both parameters needed to achieve maturation within that given time the vertical asymptotes indicate the minimum rates for CA/SP1 cleavage, the horizontal asymptotes indicate the minimal rate constants for Gag-Pol auto-cleavage. Close to the asymptotes, the corresponding slow rate becomes rate limiting, and very small changes in the limiting rate constant can only be compensated by large changes in the other parameter to maintain VMT. The default (empirical) parameter setting happens to fall in the regime where both parameters have comparable effect. This result indicates that small decreases in either rate constant (by drug or mutational effect) can be compensated by increases in the other parameter however, compensation becomes increasingly difficult and eventually impossible as the affected rate parameter approaches its critical (asymptotic) value.

The isoclines are drawn in the plane of the two rate parameters with the strongest effect on VMT. Generic hyperbola-like functions of the form y = a+b/(x−c) d could be fitted to the data. For VMT = 15 min: a = 10 −4 , b = 5×10 −4 , c = 0.058, d = 0.69 for VMT = 30 min: a = 10 −4 , b = 10 −4 , c = 0.027, d = 0.79 for VMT = 45 min: a = 9×10 −5 , b = 2×10 −5 , c = 0.017, d = 0.93 dimensions for parameters a–c and for both axes of the figure are s −1 . The perpendicular lines indicate the default values of both parameters.

Even where compensation is possible in terms of VMT, the time course of Gag-Pol processing cannot be forced to return to the original behaviour. When a change in one of the dominant parameters is compensated by a change in the other to yield the same VMT, the time course of the process remains different from that obtained with the default parameters (Figure S3). “Complete” compensation of the time course would be possible only between parameters that have very similar local sensitivity functions [42] however, the local sensitivity functions of the two dominant rate constants have different shapes (Figure S4). While some of the other parameters have similar sensitivity functions (for example, the sensitivity function of the Gag-Pol dissociation rate constant has similar shape to that of the catalytic rate constant of Gag-Pol auto-cleavage), the small magnitude of the effect of these on VMT precludes any meaningful compensation of changes in either of the dominant rate constants.

We next investigated the potential interactions between the effects of the two dominant parameters when both are changed. In particular, we tested whether combined changes are characterized by either of two simple types of interaction: additive or multiplicative effects. We used the following simple definitions for the two types of interaction: using the notations VMTdef, VMTNS, VMTNS and VMTAB to denote VMT obtained with the default parameters, with one, the other, or both of the parameters changed to a defined extent, we denote the absolute changes in VMT due to changes in each parameter with d1 = VMTNS-VMTdef 그리고 디2 = VMTNS-VMTdef, and the fold changes with f1 = VMTNS/VMTdef and f2 = VMTNS/VMTdef. The expected VMT when both parameters are changed is then VMTAB = VMTdef+d1+d2 under the additive model, and VMTAB = VMTdef*f1*f2 under the multiplicative model. We use the comparison with these two simple reference cases to illustrate the nature of the interaction depending on the direction of intervention and possible compensatory effects. We varied both parameters along a geometric series ranging from 0.16 to 6.25 times the default value, both separately and in all possible combinations. We used the results from the univariate series to predict the effect of combined changes assuming both additive and multiplicative effects, and tested the deviation of the simulations with combined changes from both predictions (Figure 6). We found that the additive model fits qualitatively better when both parameters are changed in the same direction (both increased or both decreased Figure 6A), while the multiplicative model fits better when one parameter is increased and the other decreased (Figure 6B). Two scenarios might be most relevant biologically. First, compensatory mutations in one parameter might restore VMT in the presence of drugs or mutations that decrease the other parameter. In this case, one parameter is decreased and the other increased, which results in multiplicative interactions, consistent with the shape of the VMT isoclines (Figure 5). This implies that a given fold increase in one of the parameters can be compensated by a similar factor of decrease in the other parameter to restore the default VMT. Second, combinations of drugs might target both rates in concert, which corresponds to a decrease in both parameters. For this scenario, our results predict additive effects: the increase in VMT induced by such a combination can be approximated by the sum of the increases induced by monotherapy with the individual drugs. Synergistic drug effects are not expected.

Simulations were run with a geometric series of 20 values ranging from 0.16 to 6.25 times the default for both parameters, and with all 400 combinations of the variants. Under the additive model, predictions of combined effects were obtained by adding up absolute changes in VMT observed when changing each of the parameters separately predictions under the multiplicative model were obtained by multiplying the relative (fold change) individual effects. Deviations (in minutes) from both predictions are plotted with color-coding the dimensions of both parameters were s −1 . The additive model performs better (smaller deviation) when both parameters are increased or both are decreased the multiplicative model performs better when one parameter is increased and the other decreased.

Protease inhibitor effect depends critically on inhibitor concentration and binding affinity

The modelling framework also allowed us to characterize the effect of PIs. As a test case, we selected darunavir, which is a potent inhibitor of HIV-1 PR [43], [44]. Figure 7A depicts the dependence of virion maturation time on the concentration of darunavir (red symbols) in the model. The response is very steep: VMT rises from the default value to infinity within about an order of magnitude range (∼0.01–0.1 mM) of the drug concentration, which is consistent with the steep dose response curves observed for PIs [27]. However, the PI concentration, where maturation is lost in the model is several orders of magnitude higher than the IC50 estimated for darunavir in infected cells 시험관 내 [44], which calls for an explanation (see below). The vertical asymptote where maturation fails to occur is very close (at ∼0.12 mM) to the possible maximal concentration of PR dimers (at ∼0.095 mM half of the initial Gag-Pol content), which implies that the majority of the enzyme needs to be blocked by the highly efficient inhibitor, if slower maturation still produces viable virions. This situation corresponds to the “critical subset” model of drug action [45], [46], which applies when enzyme function is insensitive to the drug concentration as long as a critical subset of enzyme molecules is unbound, but is lost quickly in the regime where the increasing drug concentration saturates the critical subset. Approximating the critical subset with the concentration of PR dimers that remain free in the presence of varied concentrations of the drug, the size of the subset is predicted to be around 30 PR dimers, if VMT = 60 min is required for viability, or around 15 dimers, if VMT>100 min is still tolerated (Figure S5). This result also predicts that the critical drug concentration needed to block virion maturation depends approximately linearly on the initial Gag-Pol content, and mutations affecting Gag-Pol frameshift will therefore have limited potential to compensate for the effect of PR inhibitors [47]. Figure 7B confirms this prediction.

(A) The dependence of VMT on the concentration of PI that binds to mature PR (red symbols) and on the concentration of a hypothetical PI that binds to full-length Gag-Pol dimers and inhibits auto-cleavage (blue symbols). The binding rate constants of both PIs were parameterized with data estimated for the PR binding of darunavir. A hyperbola-like function of the form y = a+b/(c−x) d could be fitted to the simulated VMT data, with a = 28.4 min, b = 8.75 min×mM, c = −0.91 mM, d = 1.53 for the inhibitor of PR, and with a = 29.4 min, b = 2.70 min×mM, c = −0.97 mM, d = 1.51 for the inhibitor of auto-cleavage. The vertical line indicates the theoretical maximum concentration of PR dimers at half of the initial concentration of Gag-Pol the horizontal line indicates VMT in the absence of drug. (B) The effect of Gag-Pol content on critical drug concentration. Red dots indicate the theoretical maximum concentration of functional PR enzymes (half of Pol) at varied initial Gag-Pol content black dots indicate the darunavir concentration required to delay virus maturation to VMT = 100 min in the model. (C) The dependence of VMT on the dissociation rate constant 케이NS of an inhibitor of PR (red) and of an inhibitor of Gag-Pol (blue). The inhibitor of auto-cleavage requires greater binding affinity (lower log(kNS)) to take effect. The vertical line indicates the estimated dissociation rate constant of darunavir. The horizontal line indicates VMT in the absence of drug drug concentration was set to the possible maximal enzyme concentration (half of initial Gag-Pol) at 0.095 mM. (D) Isoclines of VMT = 30, in the plane of darunavir concentration against fold increase in the two catalytic parameters with the strongest effect on VMT. The same function as in (A) could be fitted with a = 0.57, b = 0.68 mM, c = −1.36 mM, d = 1.10 for the catalytic rate constant of CA/SP1 cleavage, and with a = 0.70, b = 0.66 mM, c = −1.18 mM, d = 0.94 for the catalytic rate constant of auto-cleavage. Vertical asymptotes (positioned by c values) show the limits on the compensation of drug effect by increased catalytic rates. In all panels, parameters were set as in Table 1 unless otherwise stated.

While the shape of the dose response curve was consistent with the observations, there was a strong quantitative discrepancy between the model predictions and the empirical dose response observed 시험관 내. In the simulations, inhibition occurs where drug concentration is in the range of the maximal PR concentration (corresponding to half of the initial Pol content), which is in the ∼0.1 mM range. 대조적으로, 시험관 내 experiments estimated an IC50 (half maximal inhibitory concentration) for darunavir in the nanomolar range [44], which implies a four to five orders of magnitude discrepancy between the estimates. The critical drug concentration in the model depends only on the assumption that a single drug molecule binds to and blocks a single PR dimer, and on the estimated Pol content (∼120 molecules) of a single virion. For a nanomolar drug concentration to take effect, a single molecule of drug should be able to block 10 4 –10 5 PR dimers in fact, a nanomolar concentration would imply that the average drug content of individual virions would be well below a single drug molecule per virion (which would correspond to a “concentration” of ∼1590 nM). That is, most virions would contain no drug molecules, unless there is drug enrichment. This result is independent of the details of the model, and the discrepancy highlights an important additional process, which has been overlooked previously. We propose that at low (nanomolar) drug concentrations in the medium, the critical drug concentration within the virion can be generated by diffusion and (near) irreversible binding to PR, which together result in the accumulation of drug from the surrounding medium to a form bound to PR in the virion. Darunavir has relatively high membrane permeability [48] and can even accumulate within cells [49], [50]. Assuming a drug concentration of 5 nM in the medium, and free diffusion of darunavir to the nascent virion, we calculate that the critical concentration (∼0.1 mM a 2×10 4 fold enrichment) required to block maturation can accumulate and bind PR in as little as a few minutes (Materials and methods). The rate limiting step is the association of the drug to PR, rather than diffusion to the virion, and the concentration of unbound PR is approximately halved per minute. Assuming that the critical subset comprises 1/2, 1/4, 1/8 of the total PR pool, it would thus take about 1, 2 or 3 minutes to accumulate the critical drug concentration needed to inhibit maturation. This simplistic calculation provides a lower boundary for the length of time when Gag-Pol processing is susceptible to the drug effect [51]. Note, however, that the beginning of the susceptible period might precede the budding of the virions, if the PR embedded in Gag-Pol can already be targeted by the PI within the cell. More realistic estimates for diffusion (that take into account possible barriers or the extensive binding of darunavir to proteins [48]) might in the future provide additional insight on the time window of susceptibility to PIs during the viral life cycle.

The model can also be used to predict the dependence of the drug effect on the binding affinity (parameterized by the dissociation rate constant) of the drug (Figure 7C). We found that the response to changes in the dissociation rate constant is similarly critical (steep) as to the concentration of the drug. Furthermore, the critical binding affinity required for the inhibition of maturation is several orders of magnitude lower than the estimated binding affinity of darunavir (and other potent drugs), which indicates that potent PIs operate with a broad “safety margin”. This is consistent with the observation that for darunavir a nearly 1000-fold decrease in binding affinity did not translate into a weaker antiviral activity [43], and might contribute to the relatively high genetic barrier of the drug. Implementing a hypothetical inhibitor that binds to full-length Gag-Pol to block the initial auto-cleavage produced dose response curves of very similar shapes however, such inhibitors require much stronger binding affinity (close to that of darunavir) to take effect on VMT (Figure 7C: blue symbols), have weaker effect at the same fixed affinity and concentration (Figure 7A: blue symbols), and imply a smaller critical subset of unbound target molecules (Figure S5). This difference probably arises because unbound Gag-Pol molecules that undergo auto-cleavage generate active PR forms that can no longer be targeted by an (exclusive) inhibitor of Gag-Pol in contrast, unbound PR remains a target for PIs until the cleavage of its internal cleavage site, upon which protease activity is lost.

We also tested the potential of the catalytic rate constants to compensate the effect of PIs (for example, by compensatory mutations in the cleavage sites [52], [53]). Figure 7D shows the compensation plots (isoclines of VMT = 30 min) of both dominant catalytic rates against the concentration of darunavir, demonstrating a limited potential for compensation. The vertical asymptote of the isocline for the CA/SP1 catalytic rate constant (at 10 −1.36 ≈0.0436 mM) indicates that even an “infinite” catalytic rate could only compensate a drug dose of about 36% of the critical concentration (0.12 mM) that inhibits maturation completely, and 생체 내 drug levels with current dosing are likely to exceed the critical concentration considerably. The prediction of limited compensatory potential is in apparent contradiction with some empirical data that show clear compensation by substrate mutations in tissue culture and selection of such mutations 생체 내 [52], [53]) see the Discussion for a possible explanation.

Initial inoculum of mature PR cannot substantially accelerate virion maturation

Finally, we investigated whether a small initial inoculum of mature PR would be able to accelerate virion maturation. Such an inoculum could potentially be derived either from the infecting virion or from Gag-Pol processing within the cell before virion assembly and budding. Figure S6 illustrates that a small initial inoculum has only a modest effect on the time to virion maturation for example the addition of PR corresponding to 10% of Gag-Pol content reduces VMT from 30 min to about 25 min. A greater initial concentration of PR is unlikely at the beginning of the maturation process, given that premature proteolysis prior to confining the components in an assembling virion abolishes particle formation [54], which suggests that the bulk of proteolysis of virion associated proteins only occurs in the assembled virion (at or shortly after the time of budding). We therefore conclude that an initial inoculum of PR is unlikely to contribute substantially to proteolytic activity during maturation. The time scale of virion maturation therefore depends on Gag-Pol auto-cleavage within the virion, as has been assumed in our model. This result is also consistent with the observation that N-terminal cleavage follows first-order kinetics in protein concentration [8], [9], which implies that the dominant mechanism is intramolecular, rather than heteromolecular cleavage.


ORIGINS OF HIV-2

Since its first discovery, HIV-2 has remained largely restricted to West Africa, with its highest prevalence rates recorded in Guinea-Bissau and Senegal (de Silva et al. 2008). However, overall prevalence rates are declining, and in most West African countries HIV-2 is increasingly being replaced by HIV-1 (van der Loeff et al. 2006 Hamel et al. 2007). Viral loads tend to be lower in HIV-2 than HIV-1 infected individuals, which may explain the lower transmission rates of HIV-2 and the near complete absence of mother-to-infant transmissions (Popper et al. 2000 Berry et al. 2002). In fact, most individuals infected with HIV-2 do not progress to AIDS, although those who do, show clinical symptoms indistinguishable from HIV-1 (Rowland-Jones and Whittle 2007). Thus, it is clear that the natural history of HIV-2 infection differs considerably from that of HIV-1, which is not surprising given that HIV-2 is derived from a very different primate lentivirus.

A sooty mangabey origin of HIV-2 was first proposed in 1989 (Hirsch et al. 1989) and subsequently confirmed by demonstrating that humans in West Africa harbored HIV-2 strains that resembled locally circulating SIVsmm infections (Gao et al. 1992 Chen et al. 1996). SIVsmm was found to be highly prevalent, both in captivity and in the wild, and to be nonpathogenic in its natural host (Silvestri 2005). In a wild-living sooty mangabey community, SIVsmm was primarily found in higher-ranking females, suggesting that virus infection had no appreciable negative effect on reproductive behavior or success (Santiago et al. 2005). Finally, the fact that sooty mangabeys are frequently hunted as agricultural pests in many areas of West Africa provided plausible routes of transmission.

Since its first isolation, at least eight distinct lineages of HIV-2 have been identified, each of which appears to represent an independent host transfer ( Fig.ਅ ). By analogy with HIV-1, these lineages have been termed groups A–H, although only groups A and B have spread within humans to an appreciable degree. Group A has been found throughout western Africa (Damond et al. 2001 Peeters et al. 2003), whereas group B predominates in Cote d’Ivoire (Pieniazek et al. 1999 Ishikawa et al. 2001). All other HIV-2 “groups” were initially identified only in single individuals, suggesting that they represent incidental infection with very limited or no secondary spread. Of these, groups C, G, and H have been linked to SIVsmm strains from Cote d’Ivoire, group D is most closely related to an SIVsmm strain from Liberia, and groups E and F resemble SIVsmm strains from Sierra Leone (Gao et al. 1992 Chen et al. 1996, 1997 Santiago et al. 2005). Because of their sporadic nature, groups C–H have been assumed to represent �-end” transmissions. However, a second divergent HIV-2 strain has recently been placed in group F ( Fig.ਅ ). This virus was identified in an immigrant in New Jersey, who came from the same geographic area in Sierra Leone where this lineage was first discovered (Smith et al. 2008). Unlike the original index case, the newly identified group F infection was associated with reduced CD4 T cell counts and high viral loads (Smith et al. 2008). It is presently unknown whether group F has been spreading cryptically in humans, or whether the two group F viruses represents independent transmissions from sooty mangabeys.



코멘트:

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