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8.3: 전기영동 - 생물학

8.3: 전기영동 - 생물학


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전기영동은 겔 매트릭스에 인가된 전기장을 사용하여 DNA, RNA 및 단백질과 같은 큰 분자를 전하와 크기로 분리합니다. 크기별로 분자를 분리할 수 있는 겔 매트릭스의 웰에 샘플을 로드하고 겔 전체에 전기장을 가합니다. 이 필드는 음으로 하전된 분자가 양극 쪽으로 이동하도록 합니다. 젤 매트릭스 자체는 체로 작용하여 가장 작은 분자는 빠르게 통과하고 긴 분자는 느리게 이동합니다.

DNA와 RNA의 경우 인산염 백본에 균일한 음전하를 띠기 때문에 이러한 방식으로 분자를 크기별로 분류하는 것은 간단합니다. 전하가 다양한 단백질의 경우 핵산을 모방하도록 영리한 트릭을 사용해야 합니다. 아래의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 참조하십시오. 젤의 종류에 따라 기공 크기가 다릅니다. 그물이 더 미세하거나 거친 체처럼 일부 젤은 더 작은 분자를 더 잘 분리하는 반면 다른 젤은 더 큰 분자를 더 잘 분리합니다. 겔 전기영동은 예비 기술(즉, 단백질 또는 핵산을 정제할 때)로 사용될 수 있지만 대부분 분석 도구로 사용됩니다.

아가로스 겔 전기영동

아가로스 겔 전기영동은 주로 크기별로 핵산을 분리하는 데 사용되는 기술입니다. Agarose는 해조류에서 얻은 다당류입니다(그림 8.11). 끓는 완충액에 녹이고 트레이에 부을 수 있습니다. 트레이는 식으면서(그림 8.12) 슬래브를 형성합니다. 아가로스 젤을 빗으로 제자리에 부어 젤이 응고된 후 DNA 또는 RNA 샘플을 넣을 웰을 만듭니다. 젤을 버퍼에 담그고 슬래브에 전류를 가합니다. 이중 가닥 DNA는 분자의 서열 구성과 무관한 균일한 음전하를 가지고 있습니다. 따라서 DNA 조각이 전기장에 놓이면 음극(-)에서 양극(+)으로 이동합니다. 이동 속도는 각 DNA 분자가 체질 겔을 통해 이동하거나 흔들리는 능력에 직접적으로 의존합니다. 아가로스 매트릭스는 거대분자가 통과할 수 있는 구멍을 제공합니다. 가장 큰 거대 분자는 젤을 탐색하는 데 가장 어려운 시간을 보내는 반면 가장 작은 거대 분자는 젤을 가장 빨리 통과합니다.


그림 8.11 - 아가로스 다당류의 구조. 위키피디아

전기영동은 전류를 힘으로 사용하여 매트릭스를 통해 분자를 구동하기 때문에 분리되는 분자는 충전되어야 합니다. DNA와 RNA의 크기 대 전하 비율은 이러한 핵산의 모든 크기에 대해 일정하기 때문에 분자는 단순히 크기에 따라 분류됩니다. 가장 작은 것은 가장 빨리 움직이고 가장 큰 것은 가장 느리게 움직입니다.

주어진 크기의 모든 조각은 젤에서 동일한 거리로 이동하여 젤에서 소위 "밴드"를 형성합니다. 겔에 있는 DNA 조각의 시각화는 ethidium bromide와 같은 염료를 추가하여 가능합니다. 이 염료는 자외선 아래에서 볼 때 염기와 형광 사이에 삽입됩니다(그림 8.13). 알려진 크기의 참조 DNA를 샘플과 함께 실행하면 샘플에서 DNA 조각의 크기를 결정할 수 있습니다. 관례에 따라 DNA 단편은 분자량(단백질과 달리)으로 기술되지 않고 염기쌍(bp) 또는 킬로베이스(kb)의 길이로 기술된다는 점에 유의하는 것이 유용합니다.


그림 8.13 - ethidium bromide 염색으로 시각화된 DNA 밴드. 위키피디아

폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)

DNA 및 RNA와 마찬가지로 단백질은 큰 거대 분자이지만 핵산과 달리 단백질은 반드시 음전하를 띠는 것은 아닙니다. 각 단백질의 전하는 고유한 아미노산 서열에 따라 다릅니다. 따라서 혼합물의 단백질이 반드시 모두 양극으로 이동하는 것은 아닙니다.

또한 이중 가닥 DNA는 막대 모양이지만 대부분의 단백질은 구형(접혀 있음)입니다. 또한, 단백질은 핵산보다 상당히 작기 때문에 아가로스 겔 매트릭스의 개구부가 너무 커서 효과적으로 분리할 수 없습니다. 결과적으로, 변경되지 않은(네이티브) 단백질은 아가로스 겔에서 전기영동에 대한 좋은 전망이 아닙니다. 전기영동을 이용하여 단백질을 질량으로 분리하려면 몇 가지 변형을 가해야 합니다.

겔 매트릭스

먼저 아크릴아미드 단위를 중합 및 가교하여 만든 매트릭스를 사용합니다. 단량체 아크릴아미드(그림 8.14)가 중합되고 중합체가 N,N'-Methylene-bisacrylamide(그림 8.15)를 사용하여 가교되어 메쉬와 같은 구조를 만듭니다. 반응에서 아크릴아미드의 비율을 변경하여 매트릭스/메쉬의 개구부 크기를 쉽게 조정할 수 있습니다. 높은 비율의 아크릴아미드는 더 작은 구멍을 제공하고 더 작은 분자를 분리하는 데 더 효과적인 반면, 더 낮은 비율의 아크릴아미드는 더 큰 분자의 혼합물을 분리할 때 사용됩니다. (참고: 폴리아크릴아미드 겔은 또한 작은 핵산 단편을 분리하는 데 사용되며, 일부 아크릴아미드 겔은 하나의 뉴클레오티드로 길이가 다른 DNA 조각을 분리할 수 있습니다.)


그림 8.15 - N,N'-Methylenebisacrylamide - 아크릴아미드 가교제 위키피디아

SDS에 의한 전하 변경

두 번째 고려 사항은 단백질이 음전하를 띤 DNA 막대와 같이 기질에 "제시"하도록 물리적으로 변경되어야 한다는 것입니다. 이것은 단백질을 음이온성 세제인 SDS(나트륨 도데실 설페이트)로 처리함으로써 달성됩니다. SDS는 단백질을 변성시켜 막대 모양을 취하고 SDS 분자는 단백질을 코팅하여 외부 표면에 음전하가 부하되어 단백질의 원래 전하를 가리고 단백질의 전하를 질량에 더 비례하게 만듭니다. DNA의 중추처럼.

단백질에는 일반적으로 세제에서 완전히 펼쳐지는 것을 방지하는 이황화 결합이 있기 때문에 샘플을 머캅토에탄올로 끓여 이황화 결합을 끊고 단백질이 SDS에서 가능한 한 막대 모양이 되도록 합니다. 머캅토에탄올(및 디티오트레이톨)과 같은 시약은 다른 분자의 이황화 결합을 감소시키면서 산화되는 설프히드릴 함유 시약입니다(그림 8.16 참조).

스태킹 젤

세 번째 고려 사항은 샘플이 주요 폴리아크릴아미드 젤(분해 젤이라고 함)에 들어가기 전에 단단한 밴드로 샘플을 압축하는 방법을 제공하기 위해 폴리아크릴아미드 젤 상단에 "스태킹 젤"을 사용할 수 있다는 것입니다. 아가로스 겔 전기영동의 DNA 조각이 크기에 따라 분류되는 것처럼(가장 큰 것은 가장 느리게 움직이고 가장 작은 것은 가장 빠르게 움직입니다), 단백질은 크기에 반비례하는 속도로 겔 매트릭스를 통해 이동합니다. 전기영동이 완료되면 단백질은 Coomassie Brilliant Blue(그림 8.17) 또는 질산은과 같은 단백질에 결합하는 화합물로 염색하여 시각화할 수 있습니다.

그림 8.17 - 두 개의 SDS-PAGE 젤 - 단백질은 파란색 밴드입니다(Coomassie Blue로 염색됨). 위키피디아

비변성 겔 전기영동

위에서 설명한 SDS_PAGE 기술은 단백질의 전기 영동 분리에 사용되는 가장 일반적인 방법입니다. 그러나 어떤 상황에서는 단백질이 SDS가 없는 소위 "네이티브" 젤에서 분해될 수 있습니다. 이러한 조건에서 겔을 통한 단백질의 이동은 질량뿐만 아니라 겔 pH에서의 전하에 의해서도 영향을 받습니다. 다른 분자와 복합된 단백질은 단일 개체로 이동할 수 있으므로 관심 있는 단백질의 결합 파트너를 분리할 수 있습니다.

등전점 초점

단백질은 전하와 결과적으로 pI 값(전하가 0인 pH)이 상당히 다양합니다. 이것은 혼합물에서 단백질을 분리하는 데 이용될 수 있습니다. 등전점 집속으로 단백질을 분리하려면 아크릴아미드 겔 매트릭스를 포함하는 튜브에서 pH 구배를 설정해야 합니다. 겔의 기공 크기를 크게 조절하여 크기에 따른 체질 효과를 감소시킨다. 분리할 분자를 pH 구배를 포함하는 겔에 적용하고 전기장을 적용합니다. 이러한 조건에서 단백질은 전하에 따라 움직입니다.

예를 들어 양전하를 띤 분자는 음극 쪽으로 이동하지만 pH 구배를 통과하기 때문에 이를 통과할 때 전하가 0인 영역에 도달하고 그 지점에서 이동을 멈춥니다. 그들은 그 지점에서 양극이나 음극 모두에 끌리지 않으므로 pI에 "집중"됩니다(그림 8.18). 등전점 초점을 사용하면 pI 값이 0.01 단위만큼 차이가 나는 단백질을 분리할 수 있습니다.

2D 겔 전기영동

SDS-PAGE와 등전점 포커싱은 모두 강력한 기술이지만 이 둘의 영리한 조합은 세포/조직의 모든 단백질을 동시에 연구하는 과학인 단백질체학의 강력한 도구입니다. 2차원 겔 전기영동에서는 먼저 관심 세포에서 용해물을 준비합니다. 용해물의 단백질은 먼저 등전점 초점을 통해 pI에 의해 분리된 다음 SDS-PAGE에 의해 크기별로 분리됩니다.

단백질 혼합물은 먼저 튜브나 스트립에 적용됩니다(그림 8.19, 단계 1). 여기서 등전점 초점은 pI 값으로 단백질을 분리하기 위해 수행됩니다(단계 2). 다음으로, 그림과 같이 pI로 분리된 단백질을 포함하는 gel을 옆으로 뒤집어 SDS-PAGE용 polyacrylamide slab의 상부에 도포하여 크기에 따라 분리한다(Step 3). 등전점 집속 매트릭스의 단백질은 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동되고 크기에 따라 분리됩니다. 이 분석의 산물은 그림 8.20과 같이 2D 겔입니다. 2D 겔 전기영동의 장점은 세포의 거의 모든 단백질이 분리되어 젤에 고유한 크기와 파이. 그림에서 왼쪽 위의 반점은 큰 양전하를 띤 단백질에 해당하는 반면 오른쪽 아래의 반점은 작은 음전하를 띤 단백질입니다. 2D 겔의 모든 지점은 고처리량 질량 분석기를 사용하여 용출 및 식별할 수 있습니다. 이것은 다른 조직 사이 또는 동일한 조직의 대조군과 처리된 샘플 사이의 단백질 프로파일을 비교할 때 특히 강력합니다.


그림 8.20 - 2차원 겔 전기영동 분리 결과. 위키피디아

단백질 프로필 비교

비암성 조직의 단백질과 같은 유형의 암성 조직의 단백질을 2차원 겔로 비교하면 발현 수준이 서로 다른 단백질을 빠르게 식별할 수 있습니다. 이와 같은 정보는 치료법을 설계하거나 암이 발병하는 메커니즘을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.


전기영동 작동 원리

전기 영동에는 입자가 얼마나 빨리 그리고 어떤 방향으로 움직일 수 있는지를 제어하는 ​​두 가지 주요 요소가 있습니다. 첫째, 샘플에 대한 요금이 중요합니다. 음전하를 띠는 종은 전기장의 양극에 끌리는 반면 양전하를 띤 종은 음극으로 끌립니다. 자기장이 충분히 강하면 중성 종은 이온화될 수 있습니다. 그렇지 않으면 영향을 받지 않는 경향이 있습니다.

다른 요인은 입자 크기입니다. 작은 이온과 분자는 젤이나 액체를 통해 큰 것보다 훨씬 빠르게 이동할 수 있습니다.

하전 입자는 전기장에서 반대 전하에 끌리지만 분자가 움직이는 방식에 영향을 미치는 다른 힘이 있습니다. 마찰 및 정전기 지연력은 유체 또는 젤을 통한 입자의 진행을 느리게 합니다. 겔 전기영동의 경우 겔의 농도를 조절하여 겔 매트릭스의 기공 크기를 결정할 수 있으며, 이는 이동성에 영향을 줍니다. 환경의 pH를 제어하는 ​​액체 완충액도 존재합니다.

분자가 액체나 겔을 통해 당겨지면 매체가 가열됩니다. 이것은 분자를 변성시킬 뿐만 아니라 이동 속도에 영향을 줄 수 있습니다. 전압은 분자를 분리하는 데 필요한 시간을 최소화하는 동시에 우수한 분리를 유지하고 화학종을 손상시키지 않도록 제어됩니다. 때때로 전기영동은 열을 보상하기 위해 냉장고에서 수행됩니다.


겔 전기영동이 수행되는 방법

각 단계에 대한 이유를 더 명확하게 하기 위해 진행하면서 겔 전기영동의 기본 개념 중 일부를 검토할 것입니다.

이 기술은 단백질, DNA, RNA와 같은 큰 분자를 분리하고 분석하는 실험실 방법입니다. 임상 화학자들은 이것을 전하와 크기에 따라 단백질을 분리하는 데 사용하고 분자 생물학자는 길이에 따라 DNA와 RNA 조각 샘플을 분리하는 데 사용합니다.

DNA 전기영동과 단백질 전기영동 모두 동일한 장비와 방식으로 수행할 수 있습니다. 수평 겔 전기 영동은 현미경으로 볼 때 메쉬와 같은 구조를 갖는 아가로스 겔을 사용합니다. 수직 전기 영동은 폴리 아크릴 아미드 젤을 사용합니다. 폴리아크릴아미드 젤은 더 묽은 점도로 전기영동 과정을 더 쉽게 볼 수 있습니다. 이 기술은 전기장에 노출될 때 하전된 분자의 움직임을 기반으로 합니다. 이 움직임은 겔 시트를 가로질러 발생하거나, 다른 말로 하면 겔 매체에서 발생합니다. 그러나 전기는 DNA나 단백질과 어떤 관련이 있습니까?

DNA는 음전하를 띤다. 이것은 인산염 그룹의 존재 때문입니다. DNA 나선은 아데노신(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T)의 네 가지 염기로만 구성되지 않습니다. 그것의 백본에는 수십억 개의 인산염 그룹이 포함되어 있으며 각각은 작은 음전하를 띠고 있습니다. 인산염 그룹의 존재는 DNA에 나선형 모양을 부여합니다.

RNA 나선과 다른 종류의 단백질에도 인산기가 있습니다. 단백질은 일반적으로 음전하를 띠고 있습니다. 더 작은 단백질은 더 작은 전하를 가지며 더 큰 단백질은 더 큰 전하를 갖습니다.
아가로스 젤을 준비하는 것은 매우 간단합니다.

Agarose 젤은 수평 주조 트레이에서 준비됩니다. 트레이에는 시트용 몰드를 형성하기 위해 두 개의 열린 끝을 덮는 테이프 또는 제거 가능한 고무 범퍼가 필요합니다. 주조 트레이에는 전기 영동 빗을 위한 들여쓰기가 있습니다. 빗은 모든 크기와 색상으로 제공되며 한쪽에 이가 있거나 양면이 있을 수 있습니다. 이 치아는 삽입할 샘플을 위한 우물을 만드는 것입니다.

해조류에서 추출한 아가로스는 분말 형태로 시작됩니다. 분말은 pH 특정 전기영동 완충액으로 용해됩니다. 사용할 버퍼는 DNA 또는 단백질 샘플을 사용할지 여부에 따라 결정됩니다. agarose와 전기영동 완충액을 함께 끓이기만 하면 agarose가 용해됩니다. 그런 다음 Jell-O 몰드를 붓는 것처럼 아가로스 용액을 주조 트레이에 조심스럽게 붓습니다. 아가로스가 여전히 김이 나는 액체인 동안 빗을 주조 트레이가 움푹 들어간 아가로스 안으로 밀어 넣습니다. 그런 다음 아가로즈는 냉각되고 응고되어야 합니다. 젤이 준비되면 젤오 같은 단단한 농도로 단단해집니다. 매우 조심스럽게 빗을 제거하여 우물을 드러낸 다음 테이프나 범퍼를 제거하여 단단한 아가로즈 재료의 양쪽 끝이 노출되도록 합니다. 전통적인 전기 영동 챔버에는 재료가 앉을 수 있는 공간이 있는 음극과 양극이 있습니다. 전극은 제거 상단에 연결되고 전원 공급 장치에 연결됩니다.

아가로즈가 제자리에 있는 주조 트레이를 전기 영동 챔버에 놓습니다. 웰이 겔의 한쪽 끝에 가까우면 웰을 음극에 더 가깝게 놓습니다. 동일한 pH별 전기영동 버퍼를 사용하여 버퍼가 젤 상단을 덮을 때까지 챔버에 버퍼를 붓습니다.

마이크로 파이펫터를 사용하여 각 웰에 하나의 준비된 샘플을 조심스럽게 삽입합니다. 많은 경우 샘플이 투명하므로 스테인드 마커 또는 염료가 전용 웰에 로드됩니다. 모든 샘플이 로드되면 챔버 덮개를 교체하고 전원 공급 장치를 켜서 전기 영동 실행을 시작합니다.

전원 공급 장치는 다른 전압으로 설정할 수 있습니다. 전기 영동 실행을 주시하는 것이 중요합니다. 너무 높은 전류(또는 전압)는 젤을 녹일 수 있습니다.
스테인드 마커가 젤 가장자리에서 약 1센티미터 떨어져 있으면 전원 공급 장치를 끄고 챔버의 뚜껑을 제거합니다.

물질을 현미경으로 보면 그물코 같은 구조를 볼 수 있습니다. 재료의 기공 크기는 전체적으로 거의 일정합니다. 크기가 다른 조각이 재료를 가로질러 전하에 노출되면 작은 조각은 기공을 더 빨리 빠져나가고 더 큰 조각은 기공을 통해 이동하는 데 더 오래 걸립니다.

이 시점에서 샘플은 처음부터 명확했기 때문에 보기 어려울 수 있습니다. 샘플을 보이게 하는 데 사용할 수 있는 다양한 얼룩이 있으며, 이는 DNA 또는 단백질 샘플이 사용되었는지 여부에 따라 다릅니다. 얼룩은 샘플에 결합하여 라이트 박스나 자외선 아래에서 볼 수 있도록 합니다. DNA 샘플의 경우 Methylene blue 또는 Ethidium Bromide가 좋은 선택입니다. 단백질은 일반적으로 Coomassie Blue 또는 발색 버퍼를 사용합니다. DNA와 단백질은 전기영동에 동일한 과정을 사용하므로 염색에도 동일한 과정을 사용합니다.

젤을 염색하려면 선택한 얼룩에 몇 분 동안 담그기만 하면 됩니다. 그런 다음 물에 담가 헹굽니다. Methylene Blue, Coomassie Blue 또는 color development buffer로 염색한 젤을 라이트 박스에 직접 올려놓고 육안으로 볼 수 있습니다. 샘플은 청자색입니다. Ethidium Bromide로 염색된 젤을 보려면 자외선과 호박색 자외선 차단 안경이 필요합니다.

젤에 있는 조각 또는 샘플의 크기를 결정하는 방법은 무엇입니까? 알려진 밴드 크기 또는 전용 마커 웰에 로드된 염료 크기와 간단히 비교하십시오. DNA의 경우 특정 크기의 밴드가 있는 DNA 사다리가 사용됩니다. 단백질의 경우 여러 단백질 또는 알려진 분자량 또는 전하의 염료를 사용하여 사다리 효과를 생성합니다.

그런 다음 용출을 사용하여 나중에 추가로 사용하기 위해 재료에서 샘플 조각을 얻을 수 있습니다. 용출 과정은 아주 간단하게 젤에서 조각을 잘라내고 원심분리기의 스트레이너를 통해 강제로 밀어 아가로스를 제거하지만 모든 것을 모공 안에 유지하는 것입니다. 이 과정이 끝나면 전기영동 완충액에 용해된 DNA 또는 단백질 용액이 남습니다. 용출은 DNA의 개별 단편이 게놈 시퀀싱과 같은 추가 다운스트림 처리에 사용될 수 있는 방식으로 수행됩니다.


8.3: 전기영동 - 생물학

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전기 영동의 원리는 무엇입니까?

전기영동의 원리는 전기장이 존재할 때 하전 입자가 반대 전하 영역으로 이동한다는 것입니다. 입자가 화학 결합에서 균일하지 않은 전하 분포를 가질 때 전위에 맞춰 정렬됩니다.

전극은 전류가 통과할 수 있도록 전기장을 생성하는 모든 전도성 물질입니다. 전극의 양극을 양극, 음극을 음극이라고 합니다. 음전하를 띤 입자가 전기장을 따라 이동할 때 양극 쪽으로 이동하여 마찰력에 대항하여 움직이는 경향이 있습니다. 입자가 클수록 이동 속도가 느려집니다.

분자생물학 및 생화학 분야에서 전기영동은 다양한 크기와 밀도의 거대분자를 분리하는 유용한 분석 기술입니다. 전기영동을 받는 복잡한 단백질과 핵산은 주로 중합된 아가로스 또는 폴리아크릴아미드로 구성된 젤 매트릭스를 통해 이동합니다. 아가로오스는 끓는 물에 용해될 때 젤라틴과 같은 물질을 형성하는 다당류입니다. 폴리아크릴아미드는 테트라메틸렌디아민과 결합된 과황산암모늄의 첨가를 통해 아크릴아미드 용액의 중합에 의해 생성된 고체 겔 유형입니다.

Agarose Gel은 주로 복잡한 단백질 분자와 DNA 또는 RNA 단편을 분리하는 데 사용됩니다. 더 큰 분자는 다공성 물질에 갇히게 되고 더 작은 입자는 쉽게 통과합니다. 현대 연구자들은 폴리아크릴아미드 젤의 사용을 선호합니다. 다른 형태의 겔 전기영동에는 등전점 집속, 2D 전기영동, 모세관 전기영동 및 웨스턴 블롯팅이 포함됩니다.


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Medicago AB 제품은 전 세계에서 사용 가능합니다.

분자 생물학에서 Tris-Borate-EDTA(TBE) 완충액 분말 및 TAE 완충액은 핵산과 관련된 절차에 자주 사용되며 가장 일반적인 것은 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동입니다. Tris-acid 용액은 DNA가 탈양성자화되고 물에 용해되도록 유지하는 약간 염기성인 조건에 대한 효과적인 완충액입니다. EDTA는 2가 양이온, 특히 마그네슘(Mg 2+ )에 대한 킬레이트제입니다. 이러한 이온은 오염된 뉴클레아제를 포함한 많은 효소에 필요한 보조 인자이므로 EDTA의 한 가지 임무는 뉴클레아제에 의한 효소 분해로부터 핵산을 보호하는 것입니다. 그러나 Mg 2+는 또한 제한 효소 및 DNA 중합효소와 같은 많은 DNA 변형 효소의 보조 인자이기 때문에 TBE 또는 TAE 완충액에서의 농도는 일반적으로 낮게 유지됩니다.

붕산염은 많은 효소에 대한 강력한 억제제이므로 TBE 완충액에 존재하는 것이 매우 대중적입니다. DNA 조각.

TBE 버퍼는 PCR 증폭, DNA 분리 프로토콜 또는 DNA 클로닝 실험에서 DNA 단편을 분석할 때 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 자주 사용됩니다. 이는 특히 작은 DNA 단편(0.8% 아가로스 겔에서 1500bp 미만)을 분리하는 데 유용합니다. 제한 효소 소화의 작은 산물. TBE는 버퍼링 용량이 더 크며 TAE보다 더 선명한 해상도를 제공합니다. DNA 단편은 또한 TAE 완충액보다 TBE에서 더 빠르게 움직입니다. 그러나 TBE 겔은 일반적으로 TAE 겔에 비해 핵산 회수율이 낮습니다. TBE는 또한 DNA 리가아제를 억제하여 후속 DNA 정제 및 연결 단계를 계획할 경우 문제를 일으킬 수 있습니다.

TBE 버퍼는 3가지 농도로 공급됩니다. 미리 칭량된 분말은 10x 및 5x 스톡 솔루션 또는 1x 작업 솔루션을 제공합니다.


내용물

Mobility shift assay는 polyacrylamide나 agarose gel에서 짧은 시간(15-20cm gel의 경우 약 1.5-2시간) 동안 protein-DNA 또는 protein-RNA 혼합물을 전기영동적으로 분리하는 것입니다. [4] 서로 다른 분자(및 이들의 조합)가 겔을 통해 이동하는 속도는 크기와 전하, 그리고 덜한 정도는 모양에 따라 결정됩니다(겔 전기영동 참조). 제어 레인(단백질이 없는 DNA 프로브)에는 결합되지 않은 DNA 또는 RNA 단편에 해당하는 단일 밴드가 포함됩니다. 그러나 단백질이 단편에 결합할 수 있다고 가정하면 존재하는 단백질과 결합하는 레인은 겔에서 위로 '이동'된 단백질에 결합된 핵산 프로브의 더 크고 덜 이동성인 복합체를 나타내는 다른 밴드를 포함할 것입니다. (더 천천히 움직이기 때문에).

올바른 실험 조건에서 DNA(또는 RNA)와 단백질 사이의 상호 작용이 안정화되고 겔에 결합된 핵산과 결합되지 않은 핵산의 비율은 결합 반응이 겔에 들어갈 때 자유 및 결합 프로브 분자의 분율을 반영합니다. 이 안정성은 부분적으로 "케이지 효과"로 인한 것인데, 이는 겔 매트릭스로 둘러싸인 단백질이 재결합하기 전에 프로브에서 확산될 수 없다는 점입니다. [5] 단백질 및 프로브의 출발 농도를 알고 있고 복합체의 화학량론을 알고 있으면 핵산 서열에 대한 단백질의 겉보기 친화도를 결정할 수 있습니다. 착물이 겔 조건에서 매우 오래 지속되거나 전기영동 중 해리를 고려하지 않는 한 유도된 숫자는 겉보기 Kd입니다. 단백질 농도를 알 수 없지만 복잡한 화학량론이 있는 경우, 추가 증분으로 인해 결합된 단백질의 분율이 증가하지 않을 때까지 DNA 프로브의 농도를 증가시켜 단백질 농도를 결정할 수 있습니다. 동일한 젤에서 실행된 자유 프로브의 표준 희석 세트와 비교하여 단백질의 몰 수를 계산할 수 있습니다. [4]

단백질을 인식하는 항체를 이 혼합물에 추가하여 더 큰 이동으로 더 큰 복합체를 만들 수 있습니다. 이 방법을 슈퍼시프트 분석, 그리고 단백질 - 핵산 복합체에 존재하는 단백질을 명확하게 식별하는 데 사용됩니다.

종종, 추가 레인은 경쟁자 올리고뉴클레오티드와 함께 실행되어 결합 단백질에 대한 가장 유리한 결합 서열을 결정합니다. 정의된 서열의 다른 올리고뉴클레오티드를 사용하면 경쟁에 의해 정확한 결합 부위를 식별할 수 있습니다(다이어그램에는 표시되지 않음). 경쟁 분석의 변형은 결합의 특이성을 측정하고 결합 및 해리 역학을 측정하는 데 유용합니다. 따라서 EMSA는 또한 주어진 단백질에 실제로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선택하기 위한 SELEX 실험의 일부로 사용될 수 있습니다. [ 인용 필요 ]

DNA-단백질 결합이 결정되면 시험관 내, 많은 알고리즘이 전사 인자의 식별 검색을 좁힐 수 있습니다. 관심 있는 전사 인자에 대한 컨센서스 서열 올리고뉴클레오티드는 결합에 대해 경쟁하여 이동된 밴드를 제거할 수 있으며 슈퍼시프트에 의해 확인되어야 합니다. 예측된 컨센서스 서열이 결합에 대해 경쟁하지 않는 경우, 전사 인자의 식별은 다중화된 경쟁자 EMSA(MC-EMSA)에 의해 도움을 받을 수 있으며, 이에 의해 각 반응에서 컨센서스 서열의 큰 세트가 다중화되고, 한 세트가 결합을 위해 경쟁하는 경우, 이 세트의 개별 합의 시퀀스는 추가 반응에서 실행됩니다. [7]

시각화 목적으로 핵산 단편은 일반적으로 방사성, 형광성 또는 비오틴 라벨로 표시됩니다. 표준 ethidium bromide 염색은 이러한 방법보다 덜 민감하며 소량의 핵산 또는 단일 가닥 핵산이 이러한 실험에 사용되는 경우 핵산을 검출하는 감도가 부족할 수 있습니다. 비오틴 표지를 사용하는 경우 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소에 접합된 스트렙타비딘을 사용하여 DNA 단편을 검출합니다. [8] [9] 동위원소 DNA 표지는 단백질 결합 친화도에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않지만 형광단 또는 비오틴을 포함한 비동위원소 표지의 사용은 관심 단백질 상호작용의 친화도 및/또는 화학량론을 변경할 수 있습니다. 형광단 또는 비오틴으로 표지된 프로브와 동일한 서열의 표지되지 않은 DNA 간의 경쟁은 표지가 결합 친화도 또는 화학량론을 변경하는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.


나는 이미 아가로스 겔 전기영동 프로토콜을 언급했습니다. 일상적인 실험실에서 아가로스 겔 전기영동 프로토콜을 사용할 수 있으며 이는 당사의 표준화된 프로토콜입니다.

      • 아가로스 분말은 위험하므로 아가로스 젤을 준비하는 동안 항상 장갑, 안면 마스크 및 고글을 착용하십시오.
      • 아가로즈를 끓이는 동안 오븐 장갑(내열성)을 착용하십시오. 플라스틱 장갑을 사용하지 마십시오. 손에 화상을 입을 수 있습니다.
      • EtBr은 발암성 및 돌연변이성이므로 취급하기 전에 필요한 예방 조치를 취하십시오.

      나는 개인적으로 비용 효율적이고 아름다운 결과를 제공하는 Seakem 아가로즈 분말을 선호합니다.

      우리 연구실에서 전기 영동 기기를 만들 수 있습니까? 그것에 대해 생각하고 댓글 상자에 알려주십시오.


      비디오 보기: 중고생을 위한 DNA를 확인하는 전기영동 실험 (할 수있다 2022).


코멘트:

  1. Dusty

    흔쾌히 수락합니다. 제 생각에는 흥미로운 질문입니다. 토론에 참여할 것입니다. 우리는 함께 올바른 답을 찾을 수 있습니다.

  2. Everleigh

    매우 재미있는 의견

  3. Akinotaur

    죄송합니다만 제 생각에는 당신이 옳지 않다고 생각합니다. 나는 확신한다. 논의해 봅시다. PM으로 저에게 편지를 보내주시면 연락드리겠습니다.

  4. Nelrajas

    얼마나 매력적인 대답

  5. Gascon

    너가 확실히 맞아. There is something in this and I think this is a very great idea. 나는 당신과 완전히 동의합니다.

  6. Yozshukora

    나는 일주일 전에 그것을 읽었고, 나는 댓글을 달고 싶었지만 잊어 버렸지 만 여기에 그런 토론이있다 :)

  7. Shepherd

    Theater props come out



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