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Monod-Wyman-Changeux 모델의 포화 함수 이해

Monod-Wyman-Changeux 모델의 포화 함수 이해


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나는 수학 생리학, Sneyd를 읽고 있습니다. 저는 이 분야를 추구하는 데 관심이 있는 학부 수학자이므로 제 용어가 틀렸더라도 용서해 주십시오. 이 예에서 작성자는 두 개의 결합 부위가 있는 단백질을 고려합니다. 아래 첨자 $i$는 결합된 리간드의 수를 나타냅니다. 포화 함수라고 하는 이 표현식은 18페이지에 나타납니다.

$$Y = frac{r_1 + 2r_2 + t_1 + 2t_2}{2(r_0+r_1 + r_2 + t_0 + t_1 + t_2)}$$

여기서 $r_i, t_i$는 각각 화학종 $R_i, T_i$의 농도를 나타냅니다.
바인딩 사이트를 점유한 ezymes의 가중 평균처럼 보입니다.

$t_0, r_0$가 분자에 나타나지 않는다는 사실은 그것이 효소 결합 부위의 포화임을 시사하고, $r_2,t_2$ 앞의 $2$는 두 결합 부위가 모두 점유된 효소가 "이중 농축됨"을 나타냅니다. ". 분모의 두 개는 효소에서 사용 가능한 결합 부위의 수를 나타냅니다. 아마도 우리가 3개의 결합 부위를 가진 효소를 고려한다면:

$$Y = frac{r_1 + 2r_2 + 3r_3 + t_1 + 2t_2 + 3t_3}{3(r_0+r_1 + r_2+ r_3 + t_0 + t_1 + t_2 + t_3)}$$

이 설명이 맞을까요?


나는 Sneyd의 수학 생리학에 접근할 수 없지만 Monod-Wyman-Changeux 모델에 대한 Wikipedia의 설명에서 Y를 "리간드 결합 부위의 부분 점유"라고 부릅니다. 다른 참조에서는 이를 "부분 포화"라고 합니다.

다시 말해, 현재 리간드가 결합되어 있는 결합 부위의 일부일 뿐입니다. 분모는 단백질의 총 농도(즉, 모든 단백질 형태의 합)에 단백질당 결합 부위의 수를 곱한 것과 동일한(단위 부피의 경우) 결합 부위의 총 수입니다.

분자는 의 수 리간드 결합 바인딩 사이트. 이것은 각 형태의 농도에 결합된 리간드의 수를 곱한 것과 동일합니다(단위 부피에 대해). 따라서 제로 리간드 형태에 0을 곱하고, 1리간드 형태에 1을 곱하고, 2개 리간드 형태에 2를 곱합니다. (이것은 "이중 집중"을 반영하는 것이 아니라 화학량론을 반영합니다. 2 결합 상태의 각 단백질 분자에는 두 개의 리간드 분자가 결합되어 있습니다.)

따라서 귀하의 박스형 질문에 대한 대답은 '예'입니다. 이는 3개의 결합 부위가 있는 협력 단백질에 적합한 형태일 것입니다.


알로스테릭 상호작용의 50년: 모델의 우여곡절

지형적으로 구별되는 부위 사이의 간접적 또는 '알로스테릭' 상호작용의 개념과 이를 매개하는 형태적 변화에 대한 후속 1965년 MWC(Monod-Wyman-Changeux) 모델은 약 50년 전에 발생했습니다. 많은 고전적 조절 단백질(헤모글로빈, Asp 트랜스카바밀라제 및 니코틴성 아세틸콜린 수용체 포함)은 새로운 기술의 결과로 확장되고 도전을 받은 MWC 모델의 중심 패러다임을 따릅니다. 중요한 것은 알로스테릭 상호작용의 개념이 인간의 질병과 약물 설계에 대한 이해를 도왔다는 것입니다.


모델 진핵생물의 고해상도 화학 해부는 표적, 경로 및 유전자 기능을 밝힙니다

생물학의 진화적 보존으로 인해 진핵생물 모델 유기체의 유전 연구에서 얻은 실험 지식은 인간 세포 경로와 궁극적으로 생리학에 대한 통찰력을 제공합니다. 효모 화학 게놈 프로파일링은 소분자에 대한 세포 반응에 주석을 달기 위한 강력한 접근 방식입니다. 최적화된 플랫폼을 사용하여 거의 1800개의 생물학적 활성 화합물에 대한 이형 및 동형 접합 삭제 컬렉션의 상대적 감도를 제공합니다. 데이터 품질은 알려진 화합물과 새로운 화합물 모두에서 입증된 바와 같이 주어진 섭동에 민감하고 내성이 있는 경로에 대한 고유한 통찰력을 가능하게 합니다. 우리는 치료 관련 지방산 합성 효소 및 불포화 효소(Fas1p 및 Ole1p)를 억제하는 새로운 화합물의 예를 제시하고 개별 프로필이 화합물 작용 메커니즘을 설명하기 위해 가설 기반 실험을 촉진하는 방법을 보여줍니다. 중요하게도, 테스트된 화합물의 규모와 다양성은 변조된 경로의 수가 포화에 접근하는 데이터 세트를 생성합니다. 이 리소스는 새로운 생물학적 연결을 매핑하고 주석이 없는 유전자의 기능을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 (i) 미세소관 또는 액포 ATPase에 작용하는 유사한 작용 기전을 가진 신규 화합물 및 (ii) 호흡에 역할을 하는 주석이 없는 ORF, YIL060w에 대한 프로파일의 전역 양방향 계층적 클러스터링에 의해 생성된 가설을 검증했습니다. 미토콘드리아에서. 마지막으로, 우리는 커뮤니티 전반에 걸쳐 과거 및 미래 스크린의 해석을 개선해야 하는 널리 사용되는 효모 결실 컬렉션에서 배경 돌연변이를 식별하고 특성화합니다. 이 포괄적인 세포 반응 자원을 통해 진핵생물 경로 생물학에 대한 이해를 확장할 수 있습니다.

키워드: 화학 게놈 프로파일링 Cmpd FAS HIP HIP HOP 프로파일링 HOP 작용 메커니즘 MoA 대상 식별 효모 화합물 지방산 합성 효소 반수체 부족 프로파일링 동형 접합 프로파일링 작용 메커니즘.


P의 관점에서 헤모글로빈 생리학의 특성화50 그리고 N

헤모글로빈 포화 곡선(그림 1 NS)는 일반적으로 헤모글로빈이 반포화되어 있는 산소 분압의 관점에서 경험적으로 특성화되며, 일반적으로 p로 표시됩니다.50, 그리고 반포화점에서 포화 곡선의 협동성은 다음과 같이 표시됩니다. N. 헤모글로빈 포화 곡선은 S자형이며 산소 결합의 협동성을 반영한다는 것이 오랫동안 이해되어 왔습니다(16, 17). 광범위한 측정은 p의 변화를 보여줍니다.50 (18, 19) 포유류에서는 20-40mmHg, 반면 N 범위 2에서 3.5까지 다양합니다. 따라서 두 매개변수는 진화 중에 수정되었으며, 아마도 강력한 선택 압력 하에서일 것입니다. 예를 들어 피50 동물의 체중에 따라 감소하며(18, 19), 일반적으로 다양한 기초 대사 요구로 설명됩니다.

헤모글로빈 포화 곡선과 MWC 모델. (NS) 산소 포화도 곡선은 산소 부분압의 함수로 산소에 결합된 헴 그룹의 비율을 나타냅니다. 반포화점, p50, 는 사이트의 절반이 차지하는 부분 압력입니다. 협력 N 산소 부분압의 변화가 포화 수준에 영향을 미치는 정도를 정량화합니다. Hill 플롯 [log(와이/(1 − 와이)) 대 log(pO2)]. (NS) MWC 모델. 헤모글로빈 사량체는 두 개의 대칭 구조 중 하나로 가정됩니다. 친화도가 낮은 상태 T(케이 NS) 또는 친화도가 높은 상태 R(케이 NS). 각 형태에는 결합된 산소의 수(0-4)에 의해 아래첨자가 붙은 5개의 상태가 있습니다. 완전히 탈산소화된 상태 사이의 평형 상수는 다음과 같습니다. 0 (≫ 1) 그리고 완전히 산소화된 상태 사이는 4 (≪ 1). 낮은 산소 수준에서 분자는 T 상태에 있습니다. 높은 수준의 산소에서는 산소 결합이 증가함에 따라 평형이 R 상태로 이동합니다. T0R4 상태 T 사이의 표준 조건에서 평형 상수0 및 R4. () MWC 모델의 에너지 다이어그램. 평형 상수의 물리적 의미 그리고 친화력 케이 표준 조건에서 에너지 수준을 나타내는 이 도표에서 이해할 수 있습니다. 자세한 토론은 다음을 참조하십시오. SI 텍스트 . (NS) 측정된 포화 곡선 및 MWC는 여러 유기체(사각형) 및 여러 생리학적 조건(원)에 적합합니다. Hill 공간에 대한 묘사는 SI 그림 6을 참조하십시오.

포화 곡선은 다양한 생리적 조건의 영향을 받습니다. 디포스포글리세르산[DPG(19), 높은 산소 요구량 동안 대사 부산물로 생성됨] 및 낮은 pH(근육에서 혐기성 대사 부산물로 생성됨)와 같은 다양한 이펙터가 포화 곡선에 영향을 미칩니다. 유기체가 휴식에서 격렬한 활동으로 변할 때 증가하는 산소 요구는 조직의 pH를 떨어뜨리고 포화 곡선을 오른쪽으로 이동시킵니다(높은 p50) [보어 효과(20, 21)]. 이러한 생리적 적응(분에서 몇 시간의 규모로 작동)은 고도, 생활 방식, 신체 활동, 신체 크기의 변화 또는 태반 발달의 수정에 반응하는 진화적 적응(천년 규모로 작동)과 비교할 수 있습니다. 산모-태아 산소 수송 균형.


그래픽 요약

하이라이트

N시간 형태 전환을 위한 값에는 참조 상태가 필요합니다. ► 다음과 같은 형태 전환의 경우 N시간 > 1, 등가 단량체의 경우: N시간 < 1. ► 올리고머 대 단량체의 실제 비율 N시간 값은 단량체의 수와 같습니다. ► 정규화는 용량-반응 곡선을 확장하고 다음 값을 증가시킵니다. N시간. ► 등가 단량체 개념은 1965년 Crick과 Wyman에 의해 처음 제안되었습니다.


Monod-Wyman-Changeux 모델의 포화 함수 이해 - 생물학

하는 동안 미오글로빈, 단위체 산소 결합 단백질로서, 아마도 쌍곡선 포화로 제한되고, 산소는 헤모글로빈에 협력적으로 결합한다. 이것은 헤모글로빈에 대한 산소 포화도 곡선에 S자 형태를 발생시킵니다.

S자 결속 곡선에 대한 단순하고 우아한 모델은 다음과 같습니다. 대칭 또는 Monod-Wyman-Changeux(MWC) 모델. 이 모델에서 헤모글로빈은 산소에 대한 친화도가 다른 두 가지 기능적으로 다른 형태를 채택합니다. 이 양적 기능적 차이는 아마도 특정 구조적 또는 형태적 차이와 관련이 있으며 이들 간의 상호 변환은 (일반적으로) 2차, 3차 및 4차 구조의 변화를 수반할 수 있습니다. 일반적인 MWC 모델에서 다량체 리간드 결합 단백질(T 상태로 표시)에 대한 더 낮은 친화도 형태는 더 높은 친화도 상태(R 상태로 표시)로의 변화를 겪을 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지라고 규정되어 있습니다. 즉, R과 T 형태는 빠르게 평형에 도달할 수 있습니다. 이 경우, 리간드 농도가 증가하면 R과 T 사이의 평형이 R 상태로 향하게 됩니다. 긍정적인 협력. 우리는 R과 T 사이의 형태적 평형에 대한 리간드 농도의 효과를 호모트로픽 효과. 이 모델은 리간드 결합 부위와 다른 부위에 결합하여 어느 방향으로든 R 및 T 평형에 영향을 미치는 다른 효과기 분자를 수용할 수 있습니다. 이들은 종속 효과.

헤모글로빈의 경우 R과 T 사이의 이러한 전환에 대한 분자 세부 사항은 텍스트에서 논의됩니다. 헤테로트로픽 보어 효과는 폐에서 호흡 조직으로의 산소 수송과 반대 방향으로의 이산화탄소 수송을 향상시킵니다. 또 다른 종속성 효과기(heterotropic effector)는 소분자 2,3-비스포스포글리세레이트(BPG)로, 이는 데옥시헤모글로빈에 결합하여 형태적 평형을 T 상태로 이동시킵니다. BPG는 고지대 적응에 중요한 역할을 합니다. 태아 헤모글로빈은 BPG에 대해 더 낮은 친화력을 가지므로 태아 헤모글로빈은 모든 산소 장력에서 성인 헤모글로빈보다 더 높은 비율의 R 상태 순응자를 가지며 따라서 산소에 대한 친화도가 다소 더 큽니다. 헤모글로빈은 동종 및 종속 효과를 통해 이러한 협력 행동을 나타내는 단백질인 소위 알로스테릭 단백질의 모델입니다. 알로스테리즘에 대한 이론적 모델은 앞서 언급한 MWC/대칭 모델입니다. 그리고 비대칭 순차 모델. 변형 헤모글로빈은 인간 병리학의 한 요인입니다. 우리는 다음의 경우를 고려합니다. 겸상 적혈구 빈혈.

단백질의 헤모글로빈과 알로스테릭 거동

헤모글로빈(Hb)에 대한 연구는 단백질 구조-기능 관계가 생리적 적응을 설명하는 방식에 대한 가장 매혹적인 일견을 제공합니다. 우리는 Hb와 같은 다량체 리간드 결합 단백질을 단량체 리간드 결합 단백질(이 경우 미오글로빈 또는 "Mb")과 대조하여 고려하고 협동성 및 알로스테릭 조절에 대한 기본 모델을 개발하는 것이 유용하다는 것을 알게 되었습니다. 다음으로, 우리는 Hb가 그러한 효과적인 산소 수송체로서의 능력 뒤에 있는 구조적 및 화학적 세부사항에 주의를 기울일 것입니다.

하나 이상의 소단위로 구성된 단백질의 특성과 생리학적 역할은 기능적으로 상동성인 단백질의 단량체 버전과 상당한 방식으로 다를 수 있습니다. (서브유닛은 별도의 폴리펩타이드 사슬을 의미합니다). 한 가지 예는 근육에서 4량체(4개의 소단위로 구성됨) 헤모글로빈과 이에 상응하는 단량체인 미오글로빈 사이의 대조입니다.

단백질의 여러 부위에서 여러 리간드의 결합은 매우 복잡한 행동을 유발할 수 있습니다. 알로스테리 단백질 구조에서 서로 떨어진 부위에 결합하는 리간드가 기능적으로 상호작용하는 현상에 적용되는 용어이다.

소단위 사이의 이러한 기능적 상호작용의 가장 일반적인 결과는 다음과 같습니다. 협력. 예를 들어, 헤모글로빈(Hb)의 올리고머 특성은 한 서브유닛의 특정 리간드 결합 부위에 리간드의 결합이 동일한 리간드에 대한 다른 서브유닛의 친화도에 영향을 미치는 경우 서브유닛 간의 협력 효과를 가능하게 합니다. 이것은 호모트로픽 효과. Hb에서, 산소 결합 부위 사이의 호모트로픽 상호작용은 한 부위에서 한 산소 분자의 결합이 산소에 대한 다른 부위의 친화력을 증가시키는 성질을 갖는다. 즉, Hb에서의 리간드 결합은 긍정적인 협력. 알로스테릭 효과는 또한 헤테로트로픽, 서로 다른 리간드 간의 상호 작용을 포함합니다. Heterotropic allosteric 효과는 헤모글로빈에서도 발생합니다. CO와 같은 리간드2, H + 및 2,3-BPG는 O에 대한 Hb의 결합 부위의 친화력에 영향을 미칩니다.2.

비협조적 및 협력적 구속력 곡선

우리가 보았듯이 미오글로빈, 분수에 대한 예측 방정식 와이 독립적인 리간드 결합 부위의 경우에 차지하는 리간드 결합 부위의 수(예: 부위가 별도의 분자에 있는 경우)는 쌍곡선 결합 곡선을 설명합니다. 즉, 언제 와이 리간드 농도의 함수로 표시되며, 와이 처음에는 상대적으로 적은 양의 리간드가 첨가되면서 크게 증가하지만, 리간드 농도가 증가함에 따라 와이 같은 양의 리간드를 첨가하면 꾸준히 떨어집니다. 결국, 점근적 한계 와이 = 1에 접근합니다. 의 가치 케이NS 사용 가능한 사이트의 절반이 점유되는 리간드 농도를 나타냅니다. 와이 = 0.5. 다음 방정식으로 설명하는 쌍곡선은 비협조적 구속력이 있는 경우를 나타냅니다.

아래 그래프는 협력적 결합 곡선을 나타내며, 비협조적 결합 곡선과 대조적으로 S자형 모양을 하고 있습니다. 이것은 헤모글로빈의 산소 결합 곡선에서 관찰되는 것입니다. 헤모글로빈은 첫 번째 리간드의 결합이 다음 리간드에 대한 친화력을 증가시키는 식이므로 긍정적인 협력성을 나타냅니다. 이러한 S자형 곡선은 수많은 약한(비공유) 상호작용의 생성(또는 중단)을 포함하는 두 개의 별개 상태 사이의 협력적 전이의 특징입니다.

비협조적 구속력 곡선은 케이NS = 1. 협력 곡선은 다음과 같이 계산되었습니다. 대칭 모델 (VVP4e, p.192 참조 합심 또는 MWC 후자의 이름은 그 창시자인 Monod, Wyman 및 Changeux의 이름에서 파생되었습니다. 이 모델은 아래에서 자세히 설명합니다.

협력 및 알로스테릭 조절을 위한 MWC 또는 "concerted" 모델

하나의 완전히 대칭적인 4차 구조에서 다른 4차 구조로의 일치된 변화를 가정하는 모델은 헤모글로빈의 독특한 특성을 크게 설명할 수 있습니다. 이 우아한 모델은 MWC 이 모델은 이종성 알로스테릭 효과뿐만 아니라 동종성 양의 협동성을 설명합니다. MWC 모델은 1965년 알로스테리 모델을 공식화한 Jacques Monod, Jeffries Wyman 및 Pierre Changeux의 이름을 따서 명명되었습니다. Jacques Monod는 분자 생물학의 위대한 개척자 중 한 명입니다.

두 개의 별개의 대칭 상태의 개념은 MWC 모델의 중심 가정입니다. 헤모글로빈의 경우, deoxy-Hb 및 oxy-Hb에 해당하는 최소한 두 개의 별개의 4차 구조에 대한 구조적 증거를 보았고, 이 두 구조는 T와 R 상태라고 부를 수 있는 완전한 대칭 4차 구조의 원형 역할을 합니다. 리간드(또는 기질)에 대해 뚜렷한 친화력을 갖는 구조. 아래에서는 긍정적으로 협력하는 리간드 결합 곡선을 재현하는 방정식에 도달하기 위한 평형 개념의 사용이 논의됩니다.

아래 그림은 리간드가 A로 표시된 가상 사량체 리간드 결합 단백질에 대한 MWC 모델을 보여줍니다. 사량체의 서브유닛은 서브유닛이 채택할 수 있는 유일한 두 가지 상태인 T(낮은 친화성 A - 사각형) 및 R(고친화도, 원). T 또는 R에 관계없이 각 단백질 분자는 0, 1, 2, 3 또는 4개의 리간드에 결합하여 표시된 모든 평형을 생성할 수 있습니다.

모델은 완전히 대칭입니다. 중간 상태가 없습니다(정사각형과 원의 혼합). T 4차 상태는 친화도가 낮은 3차 구조(우리는 4개의 그룹 내 각 사각형에 "NS”) 상대적으로 더 큰 각 리간드 결합 부위 케이NS 값. R 4차 상태는 친화도가 높은 3차 구조를 가진 4개의 소단위(원으로 표시)로 구성됩니다(4개의 그룹 내 각 원을 "NS”) 각 리간드 결합 부위가 상대적으로 더 작은 케이NS 값. 그림의 수평 방향을 따라 결합 평형을 나타내는 화살표의 길이는 친화성의 차이를 정성적으로 나타냅니다. R 상태 평형의 하부 행과 비교한 T 상태 결합 평형의 상단 행은 리간드가 R 상태 분자. 화살표의 상대적 길이는 두 행 모두에서 동일하게 유지됩니다. 대조적으로, R과 T 사이의 평형을 나타내는 수직 화살표는 리간드 농도가 증가하고 단백질이 리간드로 점점 포화됨에 따라 R &hArr T 평형이 R 상태를 점점 더 선호한다는 것을 길이를 변경함으로써 정성적으로 보여줍니다. 이 모델은 S자형 포화 곡선(와이 대 [A]).

이 수학적 설명에서 모델은 세 가지 매개변수를 사용합니다. N, 분자당 리간드 결합 부위의 수(보통 서브유닛의 수와 동일) L, 이는 R 상태를 T 상태로 전환하기 위한 평형 상수로 정의되고 , 비율 케이NS R 상태에 대해 케이NS T 상태를 위해.

이 모델의 매우 만족스러운 기능 중 하나는 - 헤모글로빈의 경우(N = 4) - 단일 매개변수 L의 관점에서 호모트로픽 및 헤테로트로픽 효과를 설명할 수 있습니다. 특히, 리간드 농도가 증가함에 따라 L이 감소함에 따라 양의 협동성이 (결합과 구조적 평형 사이의 연결로 인해) 설명됩니다. BPG 결합 및 보어 효과와 같은 이종 효과는 BPG 또는 H + 결합에 의해 유도된 L의 증가로 설명됩니다. 에 대한 방정식의 플롯인 여기에 표시된 그래프에서 와이 위에 주어진 두 곡선은 다음과 같은 경우 L을 변경하는 효과를 보여줍니다. N = 4 및 0.014의 값으로 고정되어 있습니다. L을 증가시키면 T 상태가 선호되고 S자 곡선이 오른쪽으로 이동합니다.


화학양론적, 열역학적 및 생리학적 제약을 희생하지 않고 게놈 규모의 대사 네트워크의 운동 모델링을 향하여

수학적 모델링은 세포 대사와 환경 및 공정 조건과의 상호 작용을 포괄적으로 이해하는 데 필수적인 도구입니다. 화학량론적 모델의 구성 및 분석의 최근 발전으로 플럭스 균형 분석을 사용하여 정상 상태 대사 행동에 대한 한계를 정의할 수 있게 되었습니다. 그러나 동적 대사 반응을 정확하게 포착할 수 있는 운동 모델을 공식화하려면 효소 동역학 및 효소 조절에 대한 자세한 정보가 필요합니다. 기계적 효소 동역학의 사용은 효소의 동역학적 특성의 불확실성으로 인해 어려운 작업입니다. 따라서 최근 연구의 대부분은 대사 네트워크에서 반응에 대한 질량 작용 동역학만을 고려했습니다. 여기에서 우리는 ORACLE(complex living entities) 프레임워크의 최적화 및 위험 분석을 적용하고 최적으로 성장한 대장균의 대규모 기계 운동 모델을 구축했습니다. 우리는 신진대사의 유연성과 능력을 결정하기 위해 화학량론, 열역학, 동역학 간의 복잡한 상호 작용을 조사했습니다. 우리의 결과는 효소 포화가 대사 네트워크를 모델링하는 데 필요한 고려 사항이며 대사 플럭스와 대사 산물 농도의 실현 가능한 범위를 확장한다는 것을 나타냅니다. 우리의 결과는 대사 네트워크의 효소가 세포 대사의 더 큰 유연성과 견고성을 보장하기 위해 다른 포화 상태에서 기능하도록 진화했음을 시사합니다.

키워드: 탄성 질량 작용 포화 안정성 열역학.


소개

헤모글로빈은 주요 협력 및 알로스테리 개념의 발전을 반영하는 이 단백질에 대한 연구와 함께 고전적인 모델 알로스테릭 단백질입니다[1-7]. 헤모글로빈에 결합하는 산소의 정상 상태 S자형 프로파일은 1910년에 제공된 '전부 아니면 전무' Hill 공식의 기초를 제공했습니다[8]. 15년 후 Adair는 헤모글로빈 포화를 설명하기 위해 현상학적 단계적 결합 메커니즘을 제안했습니다[9]. 10년 후에 출판된 Linus Pauling의 획기적인 논문은 헤모글로빈에 의한 협력적 산소 결합에 대한 구조적 또는 기하학 지향적인 설명을 제안한 최초의 논문이었습니다. Pauling은 단일 산소 결합 상수와 단일 헴-헴 상호작용 매개변수가 있는 간단한 순차 모델을 사용하여 Adair의 데이터에 맞는 대분할 함수를 구성했습니다[10]. 산소와 헤모글로빈의 협력적 결합을 합리화하려는 시도는 Monod-Wymann-Changuèx(MWC)[11-12]와 Pauling에서 영감을 받은 Koshland-Nemethy-Filmer(KNF)[13] 기계론적 모델에 의존했습니다. 1960년대 중반에 각각 합동 및 순차적 소단위 전환을 포함합니다. 이후에 MWC 모델(S1 그림(패널 A))이 헤모글로빈 기능을 더 잘 설명한다는 것이 분명해졌습니다. 특히, 헤모글로빈은 각각의 구조적 상관관계에 따라 deoxy와 oxy 구조 사이에 평형 상태로 존재하는 것으로 밝혀졌습니다. NS 그리고 NS MWC 공식의 4차 구조[14-16]. 둘째, 구조[17-18] 또는 겔상[19-20]에서 분리될 때 구조는 별개의 친화력을 가지지만 독립적인(쌍곡선) 방식으로 4개의 산소 분자와 결합합니다.케이NS 그리고 케이NS, 각각). 수많은 리뷰에 요약된 기타 증거(이자형.NS. [6, 21]), MWC 모델은 4개의 먼 O를 포함하는 헤모글로빈의 동종 상호 작용을 적절하게 설명합니다.2- 바인딩 사이트.

그러나 헤모글로빈의 종속성 상호작용을 설명하는 데 MWC 모델을 적용하려고 하면 다른 그림이 나타납니다. MWC 모델에 따르면 활성화 또는 억제 여부에 관계없이 알로스테릭 리간드는 NS 에게 NS 단백질의 4차 구조적 평형( = [NS]/[NS]) [11–12]. 실제로 Edelstein(1971)은 헤모글로빈의 알칼리 보어 효과와 관련 '협력성의 완충' 현상(즉, pH 변화가 주로 산소 친화도에 영향을 미친다는 관찰)을 지적했습니다.NS50) 협력성(N시간) S1 그림(패널 B) 참조)에서 양성자 유도 변화로 설명할 수 있습니다. [22]. 그러나 H + , CO가 있는 상태에서 헤모글로빈의 정상 상태 포화 곡선을 맞추려는 시도2 또는 MWC 방정식에 대한 유기 인산염 억제제, 가정 - 유일한 효과, 지속적으로 실패했습니다. 오히려, 그러한 생리학적 데이터에 대한 성공적인 적합은 둘 다 그리고 (= 케이NS/케이NS) 매개변수를 변경할 수 있었습니다[23–27]. 이러한 정상 상태 관찰은 헤모글로빈 [24, 28] 또는 3차 상호 작용 [29-31]에 대한 추가 4차 구조 상태를 포함하도록 원래 MWC 모델의 수정을 요구했습니다. 헤모글로빈은 더 이상 '순수한' MWC 단백질로 간주되지 않습니다(토론 참조). 그러나 커브 피팅 절차에 관한 몇 가지 문제가 여전히 남아 있습니다. 첫째, 일반적으로 평가된 매개변수에 대해 큰 오차 막대를 얻었습니다. [23]은 데이터가 정확하고 집중적으로 샘플링된 경우에도 매개변수 값을 제한하지 않았으며 다른 매개변수 세트도 성공적인 적합을 산출할 수 있음을 나타냅니다. 두 번째로 얻은 값은 그리고 농도 관련 생리학적 데이터 세트의 매개변수는 직관적인 기계론적 설명 없이 상관 관계가 있는 경우가 많습니다[29,31-32]. 마지막으로 많은 경우 파생된 또는 값은 효과기 농도에 따라 조정되지 않고 대신 인위적으로 상관되는 것으로 나타났습니다(예를 들어, S2 그림에서 제시되고 분석된 엄격한 생리학적 데이터 세트를 참조하여 다양한 유기인산염 억제제가 있는 상태에서 헤모글로빈의 보어 효과를 설명합니다[29]). 이러한 관찰은 헤모글로빈 포화도 데이터가 두 가지[31], 나중에는 MWC 매개변수 중 하나만[32]으로 설명될 수 있다는 제안을 촉발했습니다. 이러한 점들이 MWC 매개변수에 대한 추정치, 특히 , 항상 신뢰할 수 있는 것은 아니므로 주의해서 보아야 합니다.

Milo의 ​​헤모글로빈 기능에 대한 우아한 메타 분석 연구 . [33] 엄격한 방식으로 이 문제를 해결했습니다. 연구에 따르면 서로 다른 감도로 인해 , 케이NS 그리고 케이NS 매개변수를 실험적 변동에 따라 변경하기 때문에 이러한 매개변수의 값은 기존 MWC 방정식을 사용하여 명확하게 결정할 수 없습니다(참조 [33]의 그림 3 참조). 이러한 단점을 극복하기 위해 저자는 MWC 방정식의 수정된 형태를 제시했습니다. Lc 4 그리고 LKNS 4개의 복합 매개변수. 정상 상태 산소 결합 데이터를 수정된 방정식에 맞추면 LKNS 4 그리고 Lc 4개의 헤모글로빈 매개변수[33]. 이러한 매개변수가 각각 중간점 전환점(NS50) 및 협력성(N시간) 결합 곡선의 표현형 매개변수[33], 수정된 버전의 MWC 방정식을 사용하면 직관적으로 이해됩니다. 그러나 수정된 ​​방정식은 기초에 대한 추정치를 제공할 수 없습니다. , 케이NS 그리고 케이NS 헤모글로빈의 MWC 매개변수.

NS , 케이NS 그리고 케이NS 매개변수는 MWC 결찰 경로에서 구체적이고 해석하기 쉬운 단계와 관련이 있습니다[11]. 또한 이러한 매개변수의 값을 아는 것은 생리학적 변화, 돌연변이 및 진화적 변화가 헤모글로빈 기능에 미치는 영향을 이해하는 데 필수적입니다. 이 원고에서 우리는 신뢰할 수 있는 추정치를 얻기 위한 두 가지 간단한 전략을 제시합니다. , 케이NS 그리고 케이NS 생리적 및 진화적 변이 모두에 대해 그리고 각 전략의 성능을 평가하기 위한 기준을 제공합니다. 이전에 컴파일된 헤모글로빈 모델 알로스테릭 단백질[33]에 사용할 수 있는 광범위한 생리학적 및 진화적 기능 데이터 세트를 사용하여 헤모글로빈에 대한 신뢰할 수 있는 기계론적 지식을 얻기 위해 여기에 설명된 전략의 유용성을 보여줍니다. 우리의 결과는 호모트로픽 및 헤테로트로픽 상호작용이 모두 전통적인 MWC 모델에 의해 적절하게 설명되었음을 시사합니다. 또한, 현재 연구는 정상 상태 리간드 결합 데이터를 MWC 알로스테릭 모델에 성공적으로 피팅하여 관심 있는 단백질의 기계적 매개변수에 대한 신뢰할 수 있는 추정치를 산출하기 위한 일반적인 로드맵을 설명합니다.


결과 및 논의

리간드 결합 및 구조적 변화의 모델.

그림 1은 R 또는 T 상태(11)에 존재할 수 있는 단백질에 결합하는 리간드(A)에 대한 고전적인 MWC 모델을 보여줍니다. ATCase의 경우, 결합은 c(기질) 또는 r(효과기) 부위에 있을 수 있으며 6개의 기질/이펙터가 각 분자에 결합할 수 있습니다(즉, N = 6). 이 모델에서 6개의 c 사슬(또는 r 사슬) 각각이 동등하다고 가정하기 때문에 주어진 상태에 대한 모든 미시적 해리 상수는 동일합니다(케이디, 알 마이크로 및 케이디, 티 각각 R 및 T 상태에 대한 마이크로) 및 케이D(T,j) = 제이/(N제이 + 1)케이디, 티 마이크로 . 그림 1의 연결된 결합 평형은 열역학적 사이클을 형성하므로 L′ = c n L, 여기서 L = [NSN]/[NSN], L′ = [NSN·NSN]/[NSN·NSN], 그리고 = 케이D(R,j)/케이D(T,j) = 케이디, 알 마이크로 /케이디, 티 마이크로 . 고유한 단순성 때문에 MWC 모델은 많은 협력 시스템에서 리간드 결합을 설명하는 데 사용되어 왔으며(11), ATCase의 경우 광범위한 기간에 걸쳐 축적된 많은 증거가 이러한 결합 방식을 지원합니다(9). 원칙적으로 NMR 분광법은 모델을 추가로 테스트하고 다른 기술에서는 나오지 않는 확실한 답을 얻기 위한 매우 강력한 도구입니다. 예를 들어, 특정 부위를 독립적으로 조사하지 않고 평균 특성만 보고하는 다른 생물물리학적 접근 방식을 사용하면 기질/이펙터 결합으로 인한 국소 효과를 R–T 평형에서 수반되는 전체 이동과 분리할 수 없습니다. 대조적으로, 우리는 리간드 결합에 대한 반응으로 결합 부위 부근에서의 화학적 이동의 변화가 리간드 단백질 결합 평형의 민감한 리포터를 제공하는 반면, R 및 T 상태에 상응하는 개별 공명의 수반되는 출현은 최종 결론을 이끌어낸다는 것을 보여줍니다. 리간드 결합이 R–T 평형에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 그림 1의 복잡한 평형을 𠇍issect”하는 이러한 능력은 예를 들어 뉴클레오티드 결합이 R–T 비율을 이동시킨다는 것을 결정적으로 확립하기 위해 이용되었습니다.

ATCase의 메틸-TROSY.

도 2는 U-[2H]Ile-[�H]의 1H-13C 메틸-TROSY 이핵 다중 양자 상관(HMQC) 스펙트럼을 나타낸다.3]-표지된 비리간드 WT-ATCase는 37ଌ(복합체에서 0.1mM, 단량체에서 0.6mM)에서 실온 프로브 헤드가 장착된 분광계에서 40분 동안 800MHz(1H 주파수)에서 기록되었습니다. 데이터 세트의 높은 신호 대 잡음비와 필요한 짧은 측정 시간은 메틸기가 이 시스템에서 분자 구조 및 역학에 대한 유용한 프로브가 될 것임을 시사하므로 광범위한 리간드의 효과를 비교적 짧은 시간에 연구할 수 있습니다. 주문하다. 또한, 홀로효소 분자는 r과 c 사슬에서 조립될 수 있기 때문에(원하는 경우 다른 NMR 표지 패턴으로)(19) 사슬 유형에 상관 관계를 쉽게 할당할 수 있으며 필요한 경우에만 표지된 온전한 효소를 연구할 수 있습니다. 두 체인 중 하나. 그림 2에서 볼 수 있듯이 ATCase의 1 H, 13 C 상관관계 맵의 Ile 영역은 잘 분해되어 있으며, r 또는 c 사슬에 표지가 한정된 샘플을 준비하여 두 개 또는 세 개의 겹치는 교차 교차를 분리할 수 있습니다. 분자의 27개 Ile 잔기에서 유래하는 모든 27개의 상관관계를 계산합니다. 리간드가 없는 경우 R–T 평형이 T(9)로 높게 이동하기 때문에 그림 2의 스펙트럼은 따라서 T 상태의 스펙트럼에 해당합니다. 또한 각 Ile에 대해 단일 상관관계만 관찰되기 때문에 각 c(r) 사슬은 구조적으로 동일해야 하거나 대안적으로 사슬 간의 구조 차이는 NMR 화학 이동 시간 척도(즉, 빠른 교환 ). Although it likely is possible that individual peaks could be assigned to specific sites in the protein by using approaches similar to those described in the context of our work on the proteasome (5), we have not done so here. Instead, we show that quantitative inferences about binding and allostery can be made simply by analysis of how spectra change as a function of ligand, without time-consuming steps that are involved in resonance assignment.

Binding of Active Site Ligands and Analogues.

Upon titration of U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3]-labeled WT-ATCase with substrate CbmP or its nonhydrolyzable analogue phosphonoacetamide (PAM), a number of the correlations derived from the c chain shift linearly, consistent with weak binding (millimolar affinity) and exchange rates that are fast on the NMR chemical shift time scale [see below and supporting information (SI) Fig. 6]. In contrast, cross-peaks from residues in the r chain (that are all distant from the binding site) do not shift during the titration. During the course of the titration, a second set of correlations emerges, consistent with a second conformation in slow exchange with the T state. This finding is illustrated in Fig. 3 NS, which focuses on an Ile correlation from the r chain with chemical shifts (ω 13 C,ω 1 H) = (9.3 ppm, 0.90 ppm) in the unliganded WT state ( Fig. 3 A Upper, first column) and a second Ile correlation (9.8 ppm, 0.31 ppm) derived from the c chain ( Fig. 3 A Lower). Addition of saturating amounts of CbmP or PAM produces a second set of peaks for both correlations, as indicated in the second and third columns of Fig. 3 NS. To establish the identity of this second state, we have recorded spectra of ATCase with different substrates or analogues that are known to shift the equilibrium to R and of a double mutant (cK164E, cE239K) that has been shown to be exclusively in the R form even when unliganded (22). Columns 4 and 5 of Fig. 3 NS show how spectra change with saturating amounts of the high-affinity, bisubstrate analogue phosphonoacetyl- l -aspartate (PALA) ([PALA]/[ATCase]단위체 = 1.5, where [ATCase]단위체 is the concentration of the c chains that form the PALA binding site) and saturating quantities of CbmP and succinate, an analogue of the reactant aspartate ([CbmP]/[ATCase]단위체 = 30, [succinate]/[ATCase]단위체 = 75), respectively. The corresponding region of the Ile correlation map of unliganded cK164E, cE239K𠄺TCase is shown in column 6. The excellent correspondence between chemical shifts of the second conformer in spectra of CbmP or PAM-loaded WT-ATCase and the correlations in the subspectra of columns 4𠄶 that are known to derive from the R state establishes that the observed second state in CbmP- or PAM-saturated ATCase is indeed the R form of the enzyme. Note that the correspondence in shifts is better for residues in the r chain ( Fig. 3 A Upper) than in the c chain ( Fig. 3 A Lower) because residues proximal to substrate binding sites formed by the c chains sense both the binding event and the T to R conformational transition. Further, the similarity in shifts between spectra of unliganded cK164E, cE239K𠄺TCase and R states of the enzyme generated through the addition of ligands argues strongly that the double mutant form of the enzyme is a good model of the R state (see SI Fig. 7). The titration data also establish unequivocally that both CbmP and PAM shift the equilibrium toward R and thus bind preferentially to this state, in agreement with the MWC model. This finding is in contrast to results from earlier literature in which it was argued that CbmP binding would not shift the equilibrium (23). Finally, the absence of exchange cross-peaks connecting correlations between R and T states in magnetization exchange experiments recorded on a PAM-saturated sample allows an upper limit of 𢒁/s to be placed on the exchange between the two conformers.

Because the exchange between R and T conformers is slow on the NMR chemical-shift time scale (i.e., separate correlations are observed for each state), it is possible to measure the R–T equilibrium under saturating conditions of PAM or CbmP (see below), where correlations derived from both states are visible. In the absence of chemical-shift assignments of correlations in R and T states, care must be taken to ensure that equilibrium constants are derived from intensities of cross-peaks that belong to the same residue. Two residues have been identified for which the R–T pairs can be assigned with certainty, corresponding to the correlations illustrated in Fig. 3 NS (SI Fig. 8), and values of L′ can be estimated from them. Differential relaxation of magnetization from R and T states during the course of the NMR experiment that could perturb the relative intensities of correlations, and hence L′ values, also must be accounted for, as described in 재료 및 방법. A value of L′ = 3.4 ± 1.2 has been calculated with PAM saturation, corresponding to ΔNST−R = 𢄠.76 ± 0.22 kcal/mol. Because of the lability of CbmP, only an approximate value of L′ = 1.5 (ΔNST−R ∼ 𢄠.24 kcal/mol) could be obtained for this compound. Values of L′ for CbmP and PAM are in reasonable agreement with the previously reported value of 7 for CbmP, considering that different pH values were used in the two sets of measurements (1 pH unit different) (10), the known sensitivity of ATCase function to pH (24), the different solvents used (H2O versus D2O), and the fact that ATCase used in the present set of experiments is highly deuterated.

Measuring the R–T Equilibrium Constant.

The ability to monitor R and T conformations independently provides NMR with a unique advantage over many other spectroscopic techniques. It can be shown that if ligand binding is in the fast exchange limit and separate signals are observed from the R and T states (i.e., slow exchange), then chemical shift changes of cross-peaks belonging to either R or T states that accompany ligand binding can be described by a simple hyperbolic isotherm with the extracted dissociation constant 케이D, R Micro or 케이D, T Micro (see SI 텍스트). In contrast, titration curves derived from techniques that monitor contributions from both R and T states simultaneously must be analyzed by taking the complete reaction scheme into account ( Fig. 1 ), and the resulting binding curves will be sigmoidal. 그림 3 NS shows the titration of a correlation from WT-ATCase (왼쪽) as a function of added PAM along with the corresponding titration for the same residue from cK164E, cE239K𠄺TCase (오른쪽). All titration curves that derive from binding to either T (WT-ATCase) or R (cK164E, cE239K𠄺TCase Fig. 3 ) states of the enzyme were fit simultaneously to a simple 아빠NS + NS 모델. Excellent fits were obtained with this hyperbolic binding model, as expected. 값 케이D, T Micro = 3.8 ± 0.3 mM and 케이D, R Micro = 1.8 ± 0.1 mM were extracted from fits of 8 and 10 titration curves, respectively, and by using these 케이NS Micro values along with L′ = 3.4 ± 1.2 and the relation L′ = 6 L (see above), a value of 300 ± 190 is calculated for L = [T6]/[R6] ( Fig. 1 ), corresponding to ΔNST−R = 𢄣.5 ± 0.4 kcal/mol, which agrees well with a previously published value of L = 250 based on analytical ultracentrifugation (10) and less well with L = 70 obtained from SAXS (25). Thus, even though correlations from the R state cannot be observed in spectra of unliganded WT-ATCase, the relative populations of R and T still can be established, albeit indirectly, by using the linked binding equilibria of Fig. 1 and data obtained from titration of R and T states with ligand.

Effects of Ligand Binding to the Regulatory Chains.

The presence of significant populations of both R and T conformers in the PAM-saturated enzyme ( Fig. 3 NS) allows a straightforward determination of how effectors such as ATP and CTP perturb the R–T equilibrium. 그림 4 NS shows examples of how the R–T equilibrium is shifted upon addition of MgATP (센터) or MgCTP (오른쪽) starting from PAM-loaded WT-ATCase (왼쪽). Although it is difficult to quantify precisely the shift upon addition of ATP, because the population of the T state becomes very low, changes in L′ of 15- to 30-fold are estimated from spectra, leading to a decrease in L′ from 3.4 ± 1.2 to 0.1𠄰.2. Conversely, the effect with CTP is opposite, with correlations from the R conformer disappearing completely from spectra. Such changes are in complete agreement with the MWC model of heterotropic effects, where binding of ATP to the R state is favored and binding of CTP to the T state is preferred.

The spectra of Fig. 4 NS, which were obtained with saturating amounts of PAM, could also be explained, however, under the assumption that MgATP binding does not affect the R–T equilibrium directly but rather promotes conformational changes in at least one of the states. These changes would lead to an increase in R state affinity for substrate Asp (12) or for its analogue succinate and by extension also for the CbmP analogue, PAM, and subsequent shifting of the R–T equilibrium only on substrate binding. The latter explanation was put forth to explain the results of SAXS experiments (13, 26). In particular, if this model were operative, we would expect to see significant changes in chemical shifts of probes in the c chain upon ATP binding that reflect the “postulated” changes in structure leading to higher affinity of substrate, which, however, is not what we observed. Of the 22 cross-peaks in 1 H, 13 C correlation spectra of U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3] PAM-saturated WT-ATCase that are well resolved (belonging to either of T or R conformers), only 2 change position by at least 0.1 ppm in 1 H or 0.4 ppm in 13 C when MgATP is added. These two peaks, both from the regulatory chain, are almost certainly rIle12 and rIle86, which contact bound ATP directly (8). The other 20 peaks change positions by π.025 ppm and 0.2 ppm in 1 H and 13 C, respectively peaks obscured by overlap move very little as well. The fact that a set of 20 well dispersed peaks that includes probes in the c chain change position very little in response to the addition of MgATP suggests that even if binding of nucleotide does induce alteration of R and T conformations, these changes must be minor, at least in parts of the molecule remote from the site of nucleotide binding. A similar situation also holds for MgCTP. Results from a second experiment are even more conclusive in favor of the MWC model. From the measured value L = 300 for WT-ATCase and the fact that MgATP shifts the equilibrium to the R state by 15- to 30-fold (see above), L′ is predicted to be in the range of 10� in the presence of saturating amounts of ATP. Thus, the ATP-saturated R form of the enzyme is expected to constitute 𢒅�% of the population (effective monomer concentration of 50� μM), and with the sensitivity of the NMR methodology used here, such a fraction should be observable, even for a system as large as ATCase. As predicted by our numerical estimates and the MWC model, Fig. 4 NS shows that the addition of saturating amounts of MgATP to unliganded WT-ATCase does indeed produce measurable amounts of R, estimated to be on the order of 5% on the basis of relative peak heights. Note that in the second set of spectra ( Fig. 4 B Lower), addition of ATP also causes a shift in one of the correlations from the T state (cross-peak tentatively assigned to rIle12), as indicated by the arrow. The only explanation for the appearance of R state cross-peaks is that MgATP is an allosteric effector that directly alters the R–T equilibrium.

To study the binding of MgATP to ATCase in more detail, we have recorded an ATP titration series. Unfortunately, the two significantly perturbed Ile correlations in 1 H- 13 C spectra, most likely derived from rIle12 and rIle86 as discussed above, are not particularly useful for quantifying binding because rIle12 titrates into another peak and rIle86 broadens very significantly in response to ATP addition (because of the large 1 H chemical-shift difference between free and bound forms, 0.64 ppm). To increase the number of probes available, a U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3],Leu,Val-[ 13 CH3, 12 CD3]-labeled WT-ATCase sample was prepared so that cross-peak positions from Leu and Val residues could be quantified as well. Labeling in the complex was confined to only the r chain, the site of ATP binding. The HMQC correlation map of this Ile-, Leu-, and Val-labeled ATCase sample is provided in SI Fig. 9 there are a total of 27 Leu and Val residues in the r chain, and 50 peaks can be counted in the Leu-Val region of the spectrum. Of interest, one of the Val residues, rVal121, is immediately adjacent to the fully protonated catalytic chain, and its signal would not be expected to be observed because of contributions to transverse relaxation resulting from proximal 1 H spins (27) such a situation also occurs for rIle115, which is proximal to the c chain.

Upon titration of MgATP into the Ile, Leu, and Val methyl-labeled sample of WT-ATCase, the majority of peaks shift in position, although no more than 36 Hz in either 1 H or 13 C dimensions, with little or no broadening, consistent with fast exchange. A pair of correlations that are assigned tentatively to Leu and Val residues from the amino-terminal end of the r chain that are proximal to the nucleotide binding site shift in position by at least 0.35 ppm in the 1 H dimension and broaden beyond detection during the course of the titration. Of note, the trajectories of at least six of the correlations that titrate in the fast exchange limit are not linear, indicating that the binding of MgATP to ATCase is more complex than 1:1, as observed previously (28, 29). To quantify the binding further, we chose 17 titration curves (either 1 H or 13 C) derived from 13 peaks that were in the fast exchange limit and fitted these data simultaneously to a number of binding models. Several of the titration profiles are shown in Fig. 5 NS, 그리고 삽입 highlighting the response to binding for low [MgATP] makes it clear that the binding cannot be described by a hyperbolic function, which would characterize a 1:1 interaction. Global fits to such a model produced a poor reduced χ 2 value (𢒅) with noticeable deviations from experiment for low [MgATP]. The data subsequently were fit to a sequential binding model (SI Fig. 10) that assumes a pair of equivalent binding sites where the binding of ligand to the first site alters the affinity at the second (cooperative binding). Although outside the scope of the MWC model, which postulates that the intrinsic affinity of ligand at one site is independent of the binding of ligand to a second site (i.e., same microscopic binding), the sequential model is attractive on the basis of the structure of ATCase in which the regulatory chains that bind nucleotides are arranged as dimers that certainly could 𠇌ommunicate” in response to ligand binding (8).

그림 5 NS shows a χ 2 surface of the distribution of 케이1 그리고 케이2 values that are obtained from the fits of the titration curves, where 케이1 그리고 케이2 are the macroscopic dissociation constants associated with the first and second binding events, respectively. The bold line, 4케이1 = 케이2, indicates where microscopic dissociation constants for the first and second binding events are the same so that no binding cooperativity is observed. Points above the line correspond to positive cooperativity of binding (i.e., binding at the first site increases affinity at the second), whereas those below the line indicate negative cooperativity. The seven best solutions obtained from a grid search of (케이1, 케이2) space are indicated by circles in the plot with the best solution corresponding to 케이1 = 7.9 mM and 케이2 = 0.25 mM. These solutions lie within a shallow trough on the χ 2 surface, where 케이1× 케이2 ∼ 2 mM 2 . Finally, the bold contour line encompasses the range of solutions that lie within the 95% confidence limit (for a model with 221 degrees of freedom). It is worth noting that an alternative model that assumes consecutive binding to two noninteracting sites with different affinities can be rejected via NS test statistical criteria. Other studies involving NaATP binding in which data have been interpreted in terms of a consecutive binding model report 케이1 그리고 케이2 values of 0.065 and 1.25 mM, respectively, at 4ଌ and 케이1 = 0.14 mM and 케이2 = 0.67 mM at 24ଌ, pH 7 (28, 29). Deviations from the values obtained here likely arise from the different experimental conditions used because, for example, it is known that increasing temperature decreases nucleotide affinity (28).

In summary, we have presented an NMR study of how ligand binding affects the allosteric equilibrium in the 306-kDa enzyme ATCase. Despite the size of this system, high-sensitivity 1 H, 13 C correlation maps of Ile, Leu, and Val methyl groups could be obtained in very reasonable measuring times (ρ h) using protein concentrations ρ mM in monomer (𼅠 μM in complex), so that large numbers of spectra could be recorded as a function of different ligands or ligand concentrations. By using relations that describe linked binding equilibria, a value for L = [T6]/[R6] could be calculated for WT ATCase, despite the fact that the R form of the protein is “invisible.” The effect of binding of a variety of different substrates or substrate analogues and nucleotides on the R–T equilibrium could be well understood within the framework of the MWC model, and the binding of MgATP to ATCase was shown unequivocally to alter this equilibrium, in contrast to observations from a series of other studies (12, 13, 25, 26). This work emphasizes the important role that modern solution NMR spectroscopy can play in providing quantitative information on systems with molecular masses in the hundreds of kilodaltons.


작가 정보

소속

Guangdong Provincial Education Department Key Laboratory of Nano-Immunoregulation Tumour Microenvironment, The Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, PR China

Centre for BioNano Interactions, School of Chemistry, University College Dublin, Dublin, Ireland

Kenneth A. Dawson & Yan Yan

School of Biomolecular and Biomedical Science, UCD Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, University College Dublin, Dublin, Ireland


비디오 보기: MWC model (칠월 2022).


코멘트:

  1. Jessie

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