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인간의 영양소 섭취는 어떻게 측정됩니까?

인간의 영양소 섭취는 어떻게 측정됩니까?


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영양소 흡수에 대해 많은 주장이 있습니다. 예를 들어 "즙은 야채의 모든 영양소를 흡수하는 데 도움이 됩니다". 영양섭취량을 어떻게 측정하는지 궁금합니다.

예를 들어 순수 영양소 대 영양소 배출 방정식입니까? 아니면 섭취 전후에 영양소의 혈중 농도를 측정합니까?

방법이 무엇이든 간에 특정 식이 요법이나 식습관의 상대적인 흡수율에 대한 주장을 뒷받침할 만큼 충분히 신뢰할 수 있습니까?


생물학의 적극적인 흡수에 대한 설명

인체는 세포, 세포간 기질 및 체액으로 구성됩니다. 세포는 신체의 기능적 단위이며 진정으로 살아있는 유일한 부분입니다. 한 사람의 몸에는 수조 개의 세포가 있습니다. 인간 조직의 종류에 따라 세포의 종류가 다르지만(200종류 이상 있음), 세포는 항상 기본적으로 동일하며 외막, 세포질 또는 세포 내 생체 물질과 핵으로 구성됩니다. 영양소, 단백질 및 미네랄은 몸 전체에서 끊임없이 움직이며 외부, 세포외, 체액에서 내부 세포로 또는 그 반대로 영원히 앞뒤로 이동합니다. 신체가 기능할 수 있도록 하는 생화학적 과정은 이러한 입자가 세포 안팎으로 드나들 때 매 순간 발생합니다.

이러한 영양소와 입자가 세포 안팎으로 이동하는 몇 가지 다른 메커니즘이 있습니다. 일부 메커니즘은 수동적입니다. 여기에는 단순 확산, 촉진 확산 및 삼투가 포함됩니다. 확산은 농도가 높은 영역에서 농도가 낮은 영역으로 입자(원자, 이온 또는 분자)가 수동적으로 이동하는 것입니다. 예를 들어 호흡을 위한 가스 교환은 혈액에서 나온 산소가 조직 세포로 가고 이산화탄소가 조직 세포에서 나와 혈액으로 들어가는 것입니다. 촉진 확산은 특정 운반체 단백질의 도움으로 막을 통과하는 농도 구배 아래로 분자의 이동입니다. 삼투는 물이 반투막(일부 유형의 입자만 통과할 수 있는 막)을 통해 더 묽은 용액에서 더 농축된 용액으로(수위 구배 아래로) 이동하는 일종의 확산입니다. 삼투의 예는 위와 결장에서 물을 흡수하는 것입니다.

그러나 물질이 세포 안팎으로 통과하는 메커니즘 중 일부는 에너지 입력을 필요로 하므로 "활성"이라고 합니다. 능동 수송은 농도 구배에 대해 세포막을 가로질러 분자를 펌핑하는 것입니다. 다시 말해, 세포 외부보다 세포 내부에 더 많은 나트륨 이온이 있다고 가정합니다. 능동 수송에서 에너지는 더 많은 나트륨 이온을 막을 통해 세포로 펌핑하여 세포 내의 나트륨 이온 농도를 훨씬 더 높이는 데 사용됩니다. 농도 구배에 대해 펌핑하고 있습니다.

능동수송에는 1차 능동수송과 2차 능동수송이 있다. 1차 능동 수송에서 화학 에너지는 ATP 또는 아데노신 삼인산의 형태로 프로세스에 전력을 공급하는 데 사용됩니다. ATP는 신체의 에너지 통화로, 음식을 사용하여 에너지를 생산하는 세포 내의 소기관인 세포의 미토콘드리아에서 제조됩니다. 2차 능동 수송은 전기화학적 구배를 사용하여 작동합니다. ATP를 직접 사용하지 않지만 기존의 농도 구배를 활용합니다.

신체 기능에 능동 수송이 필요한 이유는 무엇이며 어디서 발생합니까? 일부 신체 세포는 제대로 기능하기 위해 특정 영양소의 고농축을 필요로 합니다. 이러한 농도는 단순 확산으로 발생하지 않으며 여기에서 능동 수송이 작동합니다. 예를 들어, 장을 둘러싸고 있는 상피 세포는 소화를 통해 얻은 포도당을 체내로 가져와야 하며, 체내에서 장으로 포도당이 역류하는 것을 막아야 합니다. 포도당은 장이 아니라 혈류에 필요합니다. 장 세포가 확산에 의해서만 기능한다면, 식사 후에 포도당은 장내 고농도에서 혈류의 저농도로 확산됩니다. 그러나 나중에 혈류의 농도가 충분히 높아지면 포도당이 장으로 다시 확산되기 시작합니다. 이것은 혈중 포도당 수치를 위험하게 낮출 것입니다. 그러나 능동 수송은 ATP의 에너지 입력을 사용하여 이러한 일이 발생하는 것을 방지하고 혈당 수준을 조절합니다.

능동 수송은 또한 많은 신체의 다른 시스템, 아마도 가장 주목할 만한 신경계에서 중요한 역할을 합니다. 신경 세포 또는 뉴런이 휴식을 취하면 세포 내부와 외부 사이에 전하 차가 유지됩니다. 이 전하 차이는 나트륨-칼륨 펌프를 사용한 능동 수송에 의해 생성되고 유지됩니다. 뉴런의 내부와 외부의 전하 차이를 휴지막 전위(resting membrane potential)라고 합니다. 신경 자극이 세포막을 교란함에 따라 상대 전압의 또 다른 변화가 발생하고 활동 전위가 생성되어 충격이 세포를 따라 이동하게 됩니다.

능동 수송은 또한 근육 세포에서 일어나며, 칼슘 이온을 펌핑하여 근육 수축을 생성합니다. 능동 수송은 또한 신장에서 중요하며, 신장에서 세뇨관과 네프론 또는 신장 세포를 둘러싼 모세혈관 사이에서 물질을 교환하는 데 사용됩니다.

인체와 모든 생리적 과정의 질서와 복잡성은 진정으로 자연의 가장 위대한 불가사의 중 하나입니다. 능동 수송은 거대한 상호작용의 작은 부분일 뿐입니다. 그러나 인체에만 있는 것은 아닙니다. 다른 생물체에서도 발생합니다. 식물에서 식물 뿌리를 통한 미네랄 흡수는 능동 수송의 한 형태입니다. 사실, 모든 살아있는 유기체의 세포는 공통된 특징을 가지고 있으며, 능동 수송은 유기체가 적절한 영양을 공급받고 항상성 균형을 유지하도록 이들 세포가 보장할 수 있는 한 가지 방법일 뿐입니다.


종양 미세 환경에서 세포 프로그래밍된 영양소 분할

암세포는 특징적으로 양전자방출단층촬영(PET)에 의한 종양 영상화의 기초를 형성하는 과정인 바르부르크 대사 1를 통해 포도당을 소비합니다. 종양 침투 면역 세포는 또한 포도당에 의존하고 종양 미세 환경(TME)에서 손상된 면역 세포 대사는 종양 세포 2-4에 의한 면역 회피에 기여합니다. 그러나 면역 세포의 대사가 TME에서 세포 고유 프로그램에 의해 조절되지 않는지 또는 제한된 영양소에 대한 암세포와의 경쟁에 의해 조절되는지 여부는 불분명합니다. 여기에서 우리는 TME의 특정 세포 하위 집합에 의해 포도당과 글루타민에 대한 접근과 흡수를 측정하기 위해 PET 추적자를 사용했습니다. 특히 골수 세포는 다양한 암 모델에서 종양 내 포도당을 흡수하는 능력이 가장 높았고 T 세포와 암세포가 그 뒤를 이었습니다. 대조적으로, 암세포는 글루타민의 가장 높은 흡수를 보였다. 이 뚜렷한 영양소 분배는 mTORC1 신호 전달 및 포도당 및 글루타민 대사와 관련된 유전자 발현을 통해 세포 고유 방식으로 프로그래밍되었습니다. 글루타민 흡수를 억제하면 종양 상주 세포 유형 전반에 걸쳐 포도당 흡수가 향상되어 글루타민 대사가 TME의 제한 요인이 되는 포도당 없이 포도당 흡수를 억제한다는 것을 보여줍니다. 따라서 세포 고유 프로그램은 면역 세포와 암세포가 각각 포도당과 글루타민을 우선적으로 획득하도록 합니다. 이러한 영양소의 세포 선택적인 분할은 TME에서 특정 세포 집단의 대사 프로그램 및 활동을 향상 또는 모니터링하기 위한 요법 및 이미징 전략을 개발하는 데 활용될 수 있습니다.


소개

말라리아 병리는 복제로 인해 발생합니다. 변형체 적혈구(RBC)의 기생충. 말라리아 기생충은 기생충과 숙주 세포 사이의 경계면인 PV(PVM) [1,2]의 막으로 둘러싸인 기생 액포(PV) 내에서 증식합니다. PVM은 기생충의 세포내 생존을 위한 핵심 기능을 하는 단백질 복합체를 가지고 있습니다[1]. NS 변형체 내보낸 단백질의 트랜스로콘(PTEX)은 PVM을 통해 숙주 세포로 기생충 단백질의 수송을 매개합니다[3,4,5]. 비선택적 기공은 PVM을 통해 단당류, 엽산 및 아미노산과 같은 영양소의 통과를 허용합니다[6,7]. PTEX의 구성과 기능이 좀 더 자세히 연구되었지만 영양소 투과성 채널 활동에 대한 분자적 기초는 훨씬 덜 정의되어 있습니다. PTEX는 heptameric PVM 스패닝 채널을 형성하는 exported protein 2(EXP2)를 포함하여 3가지 핵심 구성 요소의 올리고머로 구성됩니다[8]. 조건부 녹다운 및 패치 클램프 측정은 EXP2가 PTEX의 일부로 단백질을 내보내는 것과 PVM의 영양소 투과성 채널 활성에서 이중 역할을 한다는 것을 나타내었으며 용질 기공 활성에 필요한 2개의 단백질 톡소플라스마 곤디 [9].

다른 PVM 단백질에는 ETRAMP(Early Transcribed Membrane Protein)[10] 및 Exported protein 1(EXP1)[11]과 같은 고도로 발현된 단일 통과 막횡단(TM) 단백질이 포함됩니다. EXP1은 혈액 및 간 단계의 PVM에 국한된 최초의 단백질로, N-말단이 PV 내강을 향하고 C-말단이 RBC 세포질에 노출되어 호모-올리고머를 형성합니다[1,11,12,13]. 유전자 파괴 시도 실패 exp1 기생충 발달에서 EXP1의 필수적인 역할을 제안했습니다[14].

생물정보학 분석은 EXP1을 에이코사노이드 및 글루타티온 대사(MAPEG)에서 막 관련 단백질 슈퍼패밀리의 구성원으로 분류했습니다[15,16]. 효소 시험관 내 분석 결과 EXP1은 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 활성을 가지고 있으며 환원된 글루타티온(GSH)과 결합하여 헤모글로빈 부산물의 해독을 통해 산화적 손상으로부터 기생충을 보호하는 것으로 제안되었습니다[16]. EXP1의 전사가 ART 내성 기생충 균주에서 상향 조절되기 때문에 EXP1이 아르테미시닌(ART) 내성과 관련이 있다고 추가로 제안되었습니다[16]. 연구 NS. 베르가이 EXP1은 또한 간내 발달 동안 지질 흡수에 역할을 할 수 있음을 나타냅니다[17].

여기에서 조건부 녹아웃(KO)을 사용하여 exp1, 우리는 EXP1이 성장에 필수적임을 보여줍니다. NS. 팔시파룸 이전에 제안된 GST 활동과 독립적으로 혈액 단계. 우리는 EXP1이 PVM의 영양 투과성 채널 활동에 필요하다는 것을 발견했습니다. 일관되게 EXP1 수준이 감소한 기생충은 영양소 제한 조건에 과민해져서 PVM에서 측정된 투과성을 영양소 획득과 연관시켰습니다. EXP1은 PVM에서 EXP2와 상호 작용하며 EXP2의 적절한 분포와 영양소 투과성 채널로서의 기능에 필요하지만 단백질 수출에서 EXP2의 기능에는 필요하지 않습니다. 따라서 EXP1은 EXP2의 기능을 영양소 투과성 채널로 정의하고 PVM 전반에 걸친 영양소 흡수에 중요하며, 이는 이제 구체적으로 연구할 수 있습니다.


결과

IL3 철수 시 Glut1 수준 및 Δψm 감소

이전 보고서에 따르면 다양한 골수 유래 세포에서 주요 포도당 수송체인 Glut1의 mRNA 수준은 성장 인자 의존성 세포주에서 성장 인자가 철수하거나 1차 T 세포를 무시할 때 감소합니다(Whettonet al., 1984 래스멜 et al., 2000). 이 감소는 미토콘드리아 막 전위의 감소를 동반했습니다. 이러한 변화는 Bcl-2 계열의 항세포자멸사 구성원에 의해 역전되지 않았지만 구성적으로 활성인 Akt에 의해 방지되었습니다(Garland and Halestrap, 1997 Plas et al., 2001). Glut1 mRNA 감소의 생리학적 중요성을 더 조사하기 위해 우리는 성장 인자 철수 전후에 IL3 의존성 세포주 FL5.12에서 Glut1 단백질 수준을 측정했습니다. Bcl-x- 발현 세포는 IL3 철수 후 세포 사멸의 교란 효과를 피하기 위해 이들 및 후속 실험에서 사용되었습니다. 비록 Bcl-x성장인자 금단현상으로 인한 세포사멸 방지, Bcl-x– 보호된 세포는 여전히 위축되고 IL3 중단 시 야생형 FL5.12 세포에서 관찰된 것과 유사한 포도당 대사 변화를 나타냅니다(Plas et al., 2001년 미공개 데이터). Bcl-x를 발현하는 세포 IL3에서 24시간 동안 제거하고 Glut1 단백질 수준을 Western blotting으로 측정했습니다. IL3 철수 시 총 세포 단백질의 비율로서 Glut1 단백질의 감소가 관찰되었습니다(그림 1A). 대조적으로, Glut1 단백질 수준은 myrAkt와 Bcl-x를 공동 발현하는 FL5.12 세포에서 유지되었습니다. IL3가 없는 대조군 세포에 비해 (그림 1A). 포도당 대사의 변화는 미토콘드리아 항상성에 영향을 줄 수 있습니다. myrAkt 발현이 성장 인자 없이 미토콘드리아 대사를 지원할 수 있는지 확인하기 위해 TMRE를 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 측정했습니다. 24시간의 IL3 철수 후, Δψm이 Bcl-x를 발현하는 세포에서 떨어졌습니다.그러나 myrAkt를 공동 발현하는 세포에서는 그렇지 않습니다(그림 1B).

그림 1. 활성화된 Akt는 IL3 중단 시 관찰되는 Glut1 단백질 수준 및 미토콘드리아 막 전위의 감소를 부분적으로 예방할 수 있습니다. (A) Bcl-x를 발현하는 대조군 FL5.12 세포 단독으로 또는 myrAkt를 또한 발현하는 세포를 24시간 동안 IL3에서 유지하거나 IL3에서 회수하고, 용해시키고, Glut1 및 액틴 단백질 수준에 대해 웨스턴 블롯으로 동등한 양의 총 단백질을 조사하였다. (B) 세포는 A에서와 같이 준비되었지만 미토콘드리아 막 전위를 평가하기 위해 전위차 염료 TMRE로 염색되었습니다. CCCP를 사용한 미토콘드리아 양성자 구배의 소산은 배경 수준의 형광을 발생시켰습니다(우리의 미공개 데이터).

세포 생존을 촉진하는 myrAkt의 능력은 세포 외 포도당의 존재에 부분적으로 의존하며 포도당 대사가 세포 사멸에 대한 세포 참여를 제어하는 ​​모델이 제안되었습니다(Vander Heiden et al., 2001). 성장 인자 철수 유도 세포 사멸에 대한 중요한 조절 위치에 포도당을 배치하는 중요한 문제는 세포가 미토콘드리아 대사에 연료를 공급하기 위해 대체 탄소 공급원을 산화시킬 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 아미노산의 산화는 미토콘드리아 대사를 지원할 수 있으며 포도당이 제한될 때 에너지 생산을 위한 자동 소화에 대한 세포 의존도를 제한해야 합니다. 세포 위축과 Δψm의 손실이 성장 인자 철수를 수반하기 때문에, 우리는 성장 인자 철수 세포가 세포외 아미노산을 흡수하는 능력을 평가했습니다.

IL3 철수 시 아미노산 수송 감소

포유류 아미노산 수송체는 수송 특성에 따라 크게 정의되며 분자 복제는 거의 이루어지지 않았습니다(Palacin et al., 1998). 복제된 아미노산 수송과 관련된 한 단백질은 4F2 중쇄(4F2hc)입니다. CD98로도 알려진 이 단백질은 원래 T 세포 활성화 및 종양 세포의 초기 마커로 기술되었으며 일부 시스템에서 변형 특성을 갖는 것으로 나타났습니다(Palacin et al., 1998 데브스와 보이드, 2000). 4F2hc는 다양한 경쇄와 복합된 이종이량체로 존재하며 경쇄가 아미노산 수송체로 기능하는 세포 표면으로 경쇄를 지시하는 샤페론으로 작용하는 것으로 생각됩니다. 우리는 면역형광에 의해 IL3의 존재 및 부재하에 4F2hc 단백질의 표면 발현에 대해 FL5.12 세포를 평가하였다. IL3의 존재하에 항-4F2hc 항체는 세포 주변의 밝은 형광 테두리에 의해 반사되는 바와 같이 주로 세포 표면을 염색했습니다(그림 2). 세포 표면 단백질은 주로 리소좀에서 분해되는 것으로 생각됩니다. IL3의 존재 하에, 리소좀 막 단백질 LAMP-1에 대한 항체로 공동 염색에 의해 결정된 바와 같이 리소좀에서 매우 적은 4F2hc가 발견되었습니다. 그러나 IL3 철수 24시간 후에 4F2hc에 대한 표면 염색이 감소하고 밝고 국소적인 세포내 염색이 관찰되었습니다. 이 염색 패턴은 이러한 4F2hc 함유 구조가 LAMP-1에 대한 항체로 염색되기 때문에 리소좀에 대한 4F2hc의 표적화를 반영합니다. 대조적으로, myrAkt의 발현은 IL3 철수 시 국소 세포내 4F2hc 염색 패턴의 출현을 완전히 방지하고 표면 염색은 성장 인자 철수에 의해 최소한으로 변경된 것으로 보였다(그림 3A). 세포 외 아미노산을 획득하는 능력을 직접 평가하기 위해 우리는 삼중수소화 아미노산의 세포 흡수를 측정했습니다. 성장 인자 철수 24시간 후, 우리는 대조군 세포가 아미노산 혼합물을 흡수하는 능력에서 50% 감소를 관찰했습니다(그림 3B). IL3가 결핍된 myrAkt-발현 세포에서의 아미노산 흡수는 IL3에서 유지된 대조군 세포에서 관찰된 것과 동일하였다. 따라서 myrAkt 발현은 IL3가 없을 때 4F2hc 표면 발현과 아미노산 흡수를 모두 지원합니다.

그림 2. 4F2hc는 성장 인자 철회 시 하향 조절되고 리소좀으로 수송됩니다. Bcl-x– 발현 FL5.12 세포는 IL3의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 유지되었고 면역형광을 위해 처리되었습니다. 오버레이에서 4F2hc 염색은 빨간색으로, LAMP-1 염색은 녹색으로, 핵 DNA의 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 염색은 파란색으로 표시됩니다. 흰색 막대는 10 μM을 나타냅니다.

그림 3. MyrAkt는 IL3가 없을 때 4F2hc의 표면 수준과 아미노산 수송을 유지합니다. (A) Bcl-x를 발현하는 대조군 FL5.12 세포 또는 myrAkt를 또한 발현하는 세포를 IL3의 존재 또는 부재 하에 24시간 후 4F2hc 염색에 대해 평가하였다. 흰색 막대는 10 μM을 나타냅니다. (B) Bcl-x를 발현하는 대조군 FL5.12 세포 (CNTL) 또는 myrAkt도 발현하는 세포를 24시간 동안 IL3에서 회수하고 재료 및 방법에 설명된 대로 15개의 삼중수소화 아미노산 혼합물을 흡수하는 능력에 대해 평가했습니다. 값은 IL3가 있는 대조군 세포의 흡수에 대해 정규화됩니다. 4개의 독립적인 실험의 결과가 표시되며 오차 막대는 SEM을 반영합니다.

성장 인자는 세포 외 콜레스테롤에 대한 세포 접근을 제어합니다

콜레스테롤은 세포막의 중요한 구성 요소이며 콜레스테롤의 결합은 지질 뗏목을 통한 세포 신호 전달뿐만 아니라 막 유동성에 영향을 미칩니다(Simons and Ikonen, 2000). 세포가 콜레스테롤을 합성할 수 있지만 포유동물 세포도 순환에서 LDL 입자 형태로 콜레스테롤을 얻습니다. 콜레스테롤은 세포 성장에 필요하고 부분적으로 세포외 배지에서 획득되기 때문에 LDL 수용체 표면 발현이 성장 인자에 의존하는지 여부를 결정했습니다. 세포를 DiI 표지된 인간 LDL과 함께 얼음 위에서 배양하고 형광 현미경으로 표면 결합을 평가했습니다. IL3의 존재 하에, 점상 표면 염색이 관찰되었다(도 4). 고정 전에 세포를 37°C로 이동하면 이 LDL이 세포내이입되어 결국 리소좀과 함께 국소화됩니다(우리의 미공개 데이터). 대조적으로, 24시간 동안 IL3에서 회수된 세포는 감소된 수준의 DiI-LDL 표면 결합을 나타냈다. 활성화된 Akt의 발현은 성장 인자가 없는 상태에서도 포도당 및 아미노산 수송체 발현을 유지하기 때문에 myrAkt 발현이 LDL 수용체 발현에 영향을 미치는지 여부를 평가했습니다. myrAkt-발현 세포에서 24시간의 IL3 철수 후에 DiI-LDL 표면 결합의 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 4). 이러한 관찰은 성장 인자가 LDL 수용체 표면 발현을 조절하고 Akt가 이 신호 전달 경로에서 역할을 한다는 것을 시사합니다.

그림 4. LDL 수용체 발현은 IL3 철수에 따라 감소하지만 myrAkt에 의해 유지됩니다. 제어 Bcl-x- 발현 세포 또는 myrAkt도 발현하는 세포를 IL3의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 유지하였다. 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 DiI 표지된 인간 LDL과 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 파라포름알데히드에 고정하고, 형광 현미경으로 검사하였다. 세 가지 독립적인 실험을 수행했습니다.

성장 인자는 세포의 철분 흡수를 조절합니다

철분은 다양한 세포 효소에 필요한 보조인자입니다., cytochrome oxidase와 ribonucleotide reductase를 포함한 세포의 철 결핍은 미토콘드리아의 손상과 기능 상실을 초래합니다(Sussman, 1992 Walter et al., 2001). 트랜스페린에 결합된 철은 수용체 매개 세포내이입을 통해 세포에 의해 흡수됩니다. 증식 속도와 트랜스페린 수용체의 표면 수준 사이의 상관관계가 일부 세포 유형에서 관찰되었으며 트랜스페린 수용체(CD71)는 활성화 시 림프구에서 상향 조절됩니다(Aisen et al., 2001). 우리는 트랜스페린 수용체의 표면 수준이 배지에서 성장 인자의 존재에 민감한지 여부를 결정했습니다. IL3가 있는 경우 FACS 분석(그림 5)과 면역형광법(우리의 미공개 데이터)에 의해 높은 표면 수준의 트랜스페린 수용체가 관찰되었습니다. IL3 철수 24시간 후, 트랜스페린 수용체의 표면 수준이 유의하게 감소했습니다. 성장 촉진 분자의 획득과 관련된 다른 단백질에 대해 위에서 보고된 관찰과 일관되게, myrAkt를 발현하는 세포는 대조군 세포보다 IL3가 없을 때 세포 표면에서 더 높은 수준의 트랜스페린 수용체를 유지했습니다(그림 5). 이러한 결과는 트랜스페린 수용체 표면 발현이 IL3에 의해 조절되고 myrAkt가 성장 인자-비의존적 트랜스페린 수용체 발현을 지원할 수 있음을 나타낸다.

그림 5. 트랜스페린 수용체 표면 발현은 IL3와 Akt에 의해 조절됩니다. 제어 Bcl-x-발현 세포(CNTL) 또는 myrAkt도 발현하는 세포를 IL3의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 유지하고 트랜스페린 수용체(TFNR) 표면 발현에 대해 FACS로 분석하였다. 음성 대조군으로 Bcl-x 세포는 이차로만 염색되었습니다(1° 없음). 동일한 음성 대조군 플롯이 두 패널에 모두 표시됩니다. 세 가지 독립적인 실험을 수행했습니다.

Akt E40K는 또한 성장 인자가 없을 때 영양소 전달체 발현을 지원합니다

영양소 수송체 수송에 영향을 미치는 능력이 미리스토일화된 형태의 Akt로 제한되었는지 여부를 결정하기 위해 우리는 두 번째 활성화된 Akt 구조를 평가했습니다. 플렉스트린 상동성 도메인에 E40K 돌연변이를 포함하는 Akt의 발현은 원형질막과의 결합을 강화하고 키나제 활성을 증가시킵니다(Aoki et al., 1998). Akt E40K가 FL5.12 세포에서 발현되었을 때, myrAkt를 발현하는 세포에서 얻은 결과와 유사하게 성장 인자 철수 유도된 세포자멸사와 위축이 극적으로 감소하였다. IL3 철수 후 24시간에, 벡터 대조군 세포는 PI 배제에 의해 21 ± 1% 생존 가능한 반면, E40K 발현 세포는 매우 생존 가능하게 유지되었습니다(62 ± 2%). 또한, E40K-발현 세포의 G1 집단은 전방 광 산란에 의해 IL3의 존재 및 부재 모두에서 벡터 대조군 세포보다 더 컸다(우리의 미공개 데이터). E40K 발현 세포에서 관찰된 증가된 세포 생존 및 감소된 위축이 세포 표면 영양소 수송체의 유지와 상관관계가 있는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 이들 세포에서 4F2hc 염색을 평가했습니다. myrAkt-발현 세포에서 얻은 결과와 유사하게 Akt E40K의 발현은 IL3 철수 시 4F2hc가 리소좀으로 이동하는 것을 방지하고 단백질을 세포 표면에 유지했습니다(그림 6). 따라서 Akt의 대체 활성화된 형태는 영양소 수송체 수송에 영향을 미칠 수 있으며 Akt의 이러한 기능은 src 미리스토일화 시퀀스를 필요로 하지 않습니다.

그림 6. Akt E40K는 IL3가 없을 때 4F2hc의 표면 발현을 유지합니다. EF6 벡터를 발현하는 FL5.12 세포 또는 Akt E40K를 발현하는 세포를 IL3의 존재 또는 부재하에 14시간 후 4F2hc 염색에 대해 평가하였다. 흰색 막대는 10 μM을 나타냅니다.

라파마이신은 myrAkt의 효과를 역전시킵니다.

효모의 영양 반응 경로는 TOR 키나아제에 의해 조절됩니다(Schmelzle and Hall, 2000 Raught et al., 2001). 영양 수송의 Akt 의존적 조절에 포유동물 상동체 mTOR가 필요한지 여부를 결정하기 위해, 우리는 성장 인자가 없을 때 아미노산 흡수를 보존하는 myrAkt의 능력에 대한 mTOR 억제제 라파마이신의 효과를 테스트했습니다. myrAkt 발현 세포의 동시 성장 인자 철수 및 라파마이신 처리는 IL3 철회 대조군 세포에서 관찰된 바와 같이 4F2hc가 LAMP-1 양성 세포내 구조로 재편재화되었습니다(그림 7A 우리의 미공개 데이터). 라파마이신은 IL3의 존재 여부에 관계없이 대조군 세포에서 4F2hc 국소화에 영향을 미치지 않았습니다(우리의 미공개 데이터). 우리는 다음으로 LDL 결합에 대한 myrAkt의 효과가 라파마이신 치료에도 민감한지 여부를 결정했습니다. 아미노산에 대한 myrAkt 지원 접근에 대해 관찰된 바와 같이, IL3가 결핍된 myrAkt 발현 세포를 20nM 라파마이신으로 처리하면 DiI-LDL 결합이 감소했습니다(그림 7B). 마지막으로, 트랜스페린 수용체 발현의 Akt 매개 증가에 대한 라파마이신의 효과를 평가하였다. 라파마이신 처리는 myrAkt 세포에서 IL3가 없을 때 트랜스페린 수용체 표면 발현을 감소시켰지만 IL3가 결핍된 대조군 세포에서 트랜스페린 수용체 수준에는 영향을 미치지 않았습니다(그림 7C). 이러한 결과는 IL3가 없을 때 수송체 및 수용체 표면 발현의 Akt 매개 증가가 mTOR 활성에 의존적임을 시사합니다.

그림 7. 4F2hc, LDL 수용체 및 트랜스페린 수용체 표면 발현에 대한 myrAkt의 효과는 라파마이신에 의해 억제됩니다. (A) MyrAkt 발현 세포를 20nM 라파마이신(RAP)으로 처리하고 4F2hc에 대한 고정 및 염색 전에 24시간 동안 IL3의 존재 또는 부재하에 유지하였다. 흰색 막대는 10 μM을 나타냅니다. (B) MyrAkt 발현 세포는 A에서와 같이 제조되었지만 고정 전에 얼음 위에서 1시간 동안 DiI-LDL과 함께 인큐베이션되었습니다. 흰색 막대는 10μM을 나타냅니다. (C) Bcl-x를 발현하는 대조군 세포(CNTL) 또는 myrAkt를 또한 발현하는 세포는 트랜스페린 수용체의 표면 발현에 대해 FACS에 의해 표시되고 평가된 바와 같이 20nM 라파마이신(rap)의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 IL3에서 회수되었다. 동일한 음성 대조군 플롯이 두 패널에 모두 표시됩니다.

영양 전달체 발현의 손실은 Δψm 및 세포 생존에 영향을 미칩니다

세포외 분자에 대한 세포 접근을 유지하는 능력이 성장 인자 철회 후 세포 크기 및 생존의 Akt 매개 증가의 중요한 구성요소인 경우 라파마이신은 이러한 매개변수에 대한 myrAkt 발현의 보호 효과를 손상시켜야 합니다. 우리는 먼저 유세포 분석을 사용하여 세포 크기에 대한 myrAkt의 효과가 라파마이신에 민감한지 여부를 조사했습니다. 표시된 처리 24시간 후, 세포를 세포 투과성 DNA 염료 Hoechst 33342와 propidium iodide로 염색했습니다. 분석은 세포 크기에 대한 세포 사멸 및 세포 주기의 교란 효과를 피하기 위해 2N DNA 함량을 갖는 요오드화 프로피디움 음성 세포로 제한되었습니다. 도 8A에 도시된 바와 같이, myrAkt-발현 세포는 성장 인자의 존재 및 부재 모두에서 대조군 세포보다 크다. 그러나 myrAkt 발현 세포를 라파마이신으로 처리하면 이러한 세포의 크기가 대조군의 크기로 감소했습니다. 대조적으로, 라파마이신은 이러한 조건에서 예상되는 Akt 활성화 수준과 일치하는 IL3의 존재하에 대조군 세포의 크기를 감소시켰지만 IL3의 부재하에서는 감소시키지 않았다. 우리는 다음으로 라파마이신이 myrAkt의 항세포자멸사 효과를 감소시켰는지 여부를 결정했습니다. myrAkt를 발현하는 FL5.12 세포가 IL3에서 철회되었을 때, 세포자멸사는 벡터 대조군 세포에 비해 지연되었다(도 8B). 그러나, 라파마이신 존재하에서 IL3 철수를 수행한 경우, myrAkt 발현 세포의 생존이 감소하였다. 라파마이신은 대조군 세포의 생존에 거의 영향을 미치지 않았으며 Bcl-x의 생존에는 영향을 미치지 않았습니다.– IL3가 없는 상태에서 세포를 발현하며, 이러한 세포에서 예상되는 Akt 활성 부족과 일치합니다. 마지막으로, 우리는 라파마이신이 Akt가 Δψm을 유지하는 능력에 영향을 미치는지 여부를 조사했습니다. myrAkt 세포를 라파마이신으로 동시에 처리하고 IL3에서 회수하면 Δψm에 대한 myrAkt의 보호 효과(그림 1B)가 제거되었습니다(그림 8C).

그림 8. 라파마이신은 세포 크기, 생존 및 미토콘드리아 막 전위에 대한 myrAkt의 긍정적인 효과를 방해합니다. (A) 컨트롤 Bcl-x- 발현 세포 또는 myrAkt도 발현하는 세포를 24시간 동안 표시된 대로 IL3 및 20nM 라파마이신의 존재 또는 부재하에 유지하고 PI 및 Hoechst 33342로 염색하고 FACS 분류로 평가했습니다. 세포 크기 분석은 2N DNA 함량을 갖는 PI 음성 세포로 제한되었습니다. 전방 각도 광산란의 임의 단위로 측정된 세포 부피가 표시됩니다. 세 가지 유사한 실험 중 하나가 표시되며, 오차 막대는 삼중 샘플의 SD를 나타냅니다. (B) 벡터 대조군 FL5.12 세포 또는 Bcl-x를 발현하는 세포 또는 myrAkt는 표시된 대로 IL3 및 20nM 라파마이신(rap)의 존재 또는 부재하에 유지되었고 이들의 생존력은 표시된 시점에서 PI 배제에 의해 측정되었습니다. 세 가지 유사한 실험 중 하나는 오류 막대가 삼중 샘플의 SD를 반영하는 것으로 표시됩니다. (C) 컨트롤 Bcl-x- 발현 세포 또는 myrAkt도 발현하는 세포를 20 nm 라파마이신(rap)으로 처리하고 IL3의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 유지하고 미토콘드리아 막 전위를 평가하기 위해 TMRE로 염색하였다. CCCP 처리는 형광을 배경 수준으로 감소시켰습니다(우리의 미공개 데이터).


인은 결핍이 경작 시스템에서 주요 고려 사항인 또 다른 필수 다량 영양소입니다. 그것은 DNA와 RNA의 구성 요소의 필수적인 부분이며 세포막 기능과 무결성에 관여합니다. 그것은 또한 식물과 동물의 "에너지 통화"인 ATP 시스템의 구성 요소입니다. 인 결핍은 식물 잎의 자주색 또는 붉은색 변색으로 보이며 식물과 뿌리의 저조한 생장, 수확량 감소 및 조기 결실, 성숙 지연을 동반합니다. 인 과잉도 문제를 일으킬 수 있지만 그렇게 흔하지는 않습니다. 과잉 P는 생화학적 상호작용을 통해 아연 결핍을 유발할 수 있습니다. 인은 일반적으로 토양에서 움직이지 않아 적용 방법에 영향을 미치며 식물에서는 다소 움직입니다.

성장하는 식물은 인 결핍의 특징적인 자주색 잎을 보여줍니다.


탄수화물의 소화 및 흡수

대부분의 미국인이 섭취하는 기본 탄수화물에는 단순당(포도당 및 과당), 이당류(유당 및 자당), 복합 탄수화물(전분 및 글리코겐)이 포함됩니다. 탄수화물은 식단에 필수적이지는 않지만 일반적으로 인간의 총 일일 칼로리 섭취량의 ~40-45%를 구성하고 식물성 전분은 일반적으로 소비되는 탄수화물 칼로리의 50-60%를 구성합니다(9). 소비되는 주요 올리고당은 이당류인 자당과 유당이며, 이는 식이 탄수화물의 약 30-40%를 구성합니다(4). 전분은 아밀로오스와 아밀로펙틴을 포함하고 >100 kDa의 식물 저장 다당류입니다. 전분은 직쇄형 포도당 중합체 아밀로오스(α-1,4 글리코시드 결합 포함)와 분지형 포도당 중합체 아밀로펙틴(분지점 대 1,4 글리코시드 결합의 비율이 1인 α-1,6 글리코시드 결합 포함)으로 구성됩니다. :20 그림 1)(6) 참조. 글리코겐은 동물 세포에서 발견되는 다당류 저장 분자이며 글리코겐에서 더 많은 수의 분기점을 제외하고는 구조가 아밀로펙틴과 유사합니다(6). Initial digestion of these complex carbohydrates begins with salivary α-amylase while still in the mouth. Both salivary and pancreatic α-amylases are endosaccharidases that are specific for internal α-1,4 glycosidic bonds (6). They have no effect on α-1,6 glycosidic bonds or on α-1,4 bonds of glucose molecules at the branch points or at the ends. The two α-amylases are secreted in active forms and are ∼94% identical in amino acid sequences (4). Salivary α-amylase is deactivated by acid pH so that it remains active in the stomach only as long as it is protected from stomach acid. If trapped within a large bolus of food inside the stomach, salivary α-amylase can continue to digest complex carbohydrates until the bolus is broken up and exposed to stomach acid. Thus, up to 30–40% of the digestion of complex carbohydrates can take place before the food reaches the small intestine.

그림 1.Diagrams of the structures of the bonds between carbohydrate moieties in dietary disaccharides and polysaccharides. The sugars are linked through glycosidic bonds between the carbon of one sugar and a hydroxyl group on another sugar. The bond may be either α or β, depending on its position above or below the plane of the sugar. [Modified from Ref. 6.]

Inside the small intestine, pancreatic juice enters the lumen through the hepatopancreatic sphincter (sphincter of Oddi), and its high bicarbonate concentration begins to neutralize gastric acid. Concomitantly, pancreatic α-amylase reaches the lumen and actively continues to break down complex carbohydrates into maltose, maltotriose (isomaltose), trisaccharides, larger oligosaccharides, and α-limit dextrins (oligosaccharides with branch points) (9). Since di-, tri-, and oligosaccharides result from the hydrolysis of starch by α-amylase, additional digestion is required before the absorption of the monosaccharide breakdown products of starch can occur. These starch hydrolysis products must be further broken down by the disaccharidases found as membrane-spanning enzymes in the plasma membranes of the brush borders of intestinal epithelial cells (enterocytes) (4). Table 1 shows a summary of the major carbohydrates found in food with their typical sources, chemical bonds, brush-border membrane enzymes needed, and final monosaccharide products.

Table 1. Sources of carbohydrates, glycosidic bond types, membrane enzymes, and monosaccharide products

These brush-border membrane enzymes have varied specificities and varied locations within the small intestine. They are exoenzymes that cleave one monosaccharide at a time from the oligosaccharides or convert disaccharides into monosaccharides (6). One of the brush-border membrane enzymes is β-glucoamylase (also known as maltase), which hydrolyzes only α-1,4 glycosidic linkages between glucose molecules in maltose or beginning with the residue at the tail end of the polysaccharide (9). Another of the brush-border membrane enzymes is the sucrase-isomaltase complex, which is actually two polypeptides (isomaltase spanning the membrane with associated sucrase) (4). Isomaltase (also known as limit dextrinase or debranching enzyme) hydrolyzes α-1,6 glycosidic bonds at the branch points in a number of limit dextrins and α-1,4 linkages in maltose and maltotriose (4). Sucrase hydrolyzes α-1,2 glycosidic linkages between glucose and fructose molecules and thus splits sucrose. Another of the brush-border membrane enzymes is the β-glycosidase complex, which includes lactase and glucosyl-ceramidase (9). Glucosyl-ceramidase splits β-glycosidic bonds between glucose or galactose and hydrophobic residues such as those found in the glycolipids glucosylceramide and galatosylceramide. Lactase splits β-1,4 bonds between glucose and galactose in milk sugar (9). Lactase deficiency (adult hypolactasia) is common in adults of many ethnic groups and leads to adult lactase levels that may be as low as 10% of those found in infants (9). Lactase-deficient small intestinal epithelial cells allow dietary lactose to reach the colon, where bacteria ferment lactose into gas and organic acids. This lactose produces an osmotic gradient, increasing water in the lumen. Thus, the gut walls are distended by the excess fluid, which increases peristalsis, causing further malabsorption and the frequent consequences of bloating and flatulence along with diarrhea (4).

Another brush-border membrane enzyme is trehalase, which hydrolyzes the glycosidic bond in trehalose, a small disaccharide uncommon in the American diet (9). Trehalose is found in insects, algae, young mushrooms, and other fungi and may cause gastrointestinal distress if consumed by an individual without adequate quantities of trehalase (1). Undigested trehalose arriving in the colon also causes an osmotic gradient leading toward loose stools and diarrhea followed by the digestion of trehalose by the microflora in the colon, producing gases (particularly hydrogen and methane, appearing in the exhaled air) (1). Trehalase is shorter than the other disaccharidases and has only one catalytic site to hydrolyze the α-1,1 linkage between glucose molecules in trehalose. It is still unclear how variable the duodenal trehalase activity may be in the human population however, studies with Eskimos in Greenland and with people in Finland have identified both self-proclaimed mushroom-intolerant and trehalase-deficient individuals (1).

Pancreatic α-amylase acts mostly in the duodenum shortly after its entry through the hepatopancreatic sphincter and generates maltose, maltotriose, and α-limit dextrins from complex carbohydrates (6). Sucrase-isomaltase and β-glycosidase have a high distribution and activity in the proximal jejunum, whereas glucoamylase has its highest activity in the proximal ileum (9). Thus, the spatial distribution of these disaccharidases (little activity in the duodenum and distal ileum and none in the large intestine) maximizes their activity to coordinate with the segments of the small intestine where glucose transporters predominate (4). These disaccharidases thus contribute to the phenomenon known as membrane digestion and provide monosaccharides for absorption across epithelial cells.

Once monosaccharides result from the digestion of carbohydrates by α-amylase and the brush-border membrane enzymes, the monosaccharides are taken up by the enterocytes via specific transport proteins that facilitate the transport of the d -isomers (but not l -isomers) of hexoses (4). d -Glucose and d -galactose are taken up by the Na + -coupled secondary active transport symporter known as Na + -glucose transporter 1 (SGLT1). SGLT1 is a high-affinity Na + -glucose transporter with 12 transmembrane-spanning α-helical domains and 662 amino acid residues with a mass of ∼74 kDa (15). 그것의 케이미디엄 for sugar transport is a function of the Na + concentration, and its stoichiometry is 2 Na + for every d -glucose molecule (15). In the absence of Na + , d -glucose binds to SGLT1 with a much lower affinity (glucose 케이미디엄 >> 10 mM), but in the presence of Na + , a conformational change allows sugar to bind with high affinity (glucose 케이미디엄 << 0.5 mM). When the intracellular Na + concentration is low (∼10 mM), Na + dissociates from its binding site, causing the transporter affinity for d -glucose to decrease, and the sugar is released into the cytoplasm of the cell. The transporter must complete its cycle by undergoing a third, much slower transition to reorient the binding sites to the extracellular surface (15).

Thus, SGLT1 takes advantage of the Na + gradient (i.e., low intracellular Na + concentration) that is created by basolateral Na + ,K + -ATPases to bring hexoses into the enterocytes. Since SGLT1 moves 2 Na + with each d -glucose, it is capable of generating a glucose concentration gradient across the luminal membrane of 10,000-fold (3). Subsequently, d -glucose can leave the cell on the basolateral side of the cell via facilitated diffusion transporters [glucose transporters (GLUT2s)] from a high concentration inside the cell to a low concentration outside the cell (4). GLUTs are integral membrane transport proteins folded into 12 transmembrane-spanning α-helixes that form a central aqueous channel for the movement of the substrate ( d -glucose, d -galactose, or fructose) across the lipid bilayer. Of the five original GLUTs, only GLUT2 and GLUT5 are able to transport fructose, and GLUT5 has a very limited capacity for transporting d -glucose (12). GLUT2s are distinguished by being a low-affinity, high-turnover transport system with a 케이미디엄 in oocytes of 11 mM. GLUT2s are found in intestinal and kidney basolateral membranes (predominantly), in the liver, and in β-cells of the pancreas and mediate both the uptake and efflux of glucose, galactose, or fructose (12).

However, fructose is not transported by SGLT1 but rather is taken up on the brush-border side of the enterocyte by the specific facilitated diffusion transporter GLUT5. GLUT5s exhibit the weakest homology to other members of the GLUT family of all GLUTs and serve primarily as fructose transporters with a 케이미디엄 of 6 mM (12). They are found in the membranes of fructose-metabolizing tissues, including the brush-border membranes of intestinal cells and the membranes of sperm. They are likely the primary route for dietary fructose uptake in the small intestine. The intracellular conversion of fructose into glucose and lactic acid maintains its low intracellular concentration, aiding its continued absorption via facilitated diffusion from the lumen. As the bloodstream adjacent to the intestinal epithelial cells continuously removes the sugars that traverse entire enterocytes, glucose, galactose, and any remaining intact fructose easily exit the cells down their concentration gradients through facilitated diffusion GLUT2s without the use of cellular energy. Figure 2 shows a summary diagram of the steps involved in the digestion and absorption of carbohydrates.

그림 2.Summary of the basic steps involved in carbohydrate digestion and absorption with important enzymes and transporters. The steps are explained in more detail in the text. SGLT1, Na + -glucose transporter 1 GLUT, glucose transporter. [Modified from Ref. 13.]

Clinical example.

Glucose-galactose malabsorption is a rare genetic disease in which the patient has defective intestinal d -glucose and d -galactose absorption (15). It presents as neonatal onset of severe, watery diarrhea, which can result in death unless water and electrolyte balance is quickly restored. Complete removal of glucose, galactose, and lactose from the diet stops the diarrhea within 1 h. Molecular studies have shown that multiple mutations in SGLT1 lead to glucose-galactose malabsorption in the small intestine however, those patients with low glucose absorptive capabilities do not have glycosuria (glucose in the urine) because kidney proximal tubule epithelial cells (as opposed to enterocytes with only SGLT1 in healthy individuals) use both SGLT1 and SGLT2 for the uptake of glucose in the filtrate (4) and SGLT2 is not mutated simultaneously.


The Issue

Nutrient pollution is one of America's most widespread, costly and challenging environmental problems, and is caused by excess nitrogen and phosphorus in the air and water.

Nitrogen and phosphorus are nutrients that are natural parts of aquatic ecosystems. Nitrogen is also the most abundant element in the air we breathe. Nitrogen and phosphorus support the growth of algae and aquatic plants, which provide food and habitat for fish, shellfish and smaller organisms that live in water.

But when too much nitrogen and phosphorus enter the environment - usually from a wide range of human activities - the air and water can become polluted. Nutrient pollution has impacted many streams, rivers, lakes, bays and coastal waters for the past several decades, resulting in serious environmental and human health issues, and impacting the economy.

Too much nitrogen and phosphorus in the water causes algae to grow faster than ecosystems can handle. Significant increases in algae harm water quality, food resources and habitats, and decrease the oxygen that fish and other aquatic life need to survive. Large growths of algae are called algal blooms and they can severely reduce or eliminate oxygen in the water, leading to illnesses in fish and the death of large numbers of fish. Some algal blooms are harmful to humans because they produce elevated toxins and bacterial growth that can make people sick if they come into contact with polluted water, consume tainted fish or shellfish, or drink contaminated water.

Nutrient pollution in ground water - which millions of people in the United States use as their drinking water source - can be harmful, even at low levels. Infants are vulnerable to a nitrogen-based compound called nitrates in drinking water. Excess nitrogen in the atmosphere can produce pollutants such as ammonia and ozone, which can impair our ability to breathe, limit visibility and alter plant growth. When excess nitrogen comes back to earth from the atmosphere, it can harm the health of forests, soils and waterways.


소개

Constraint-based genome-scale models and flux balance analysis (FBA) have been widely used to investigate metabolic systems of various organisms. By connecting genotype to phenotype, genome-scale metabolic models (GeM) provide detailed information about biochemical reactions networks that compose cellular metabolism. 1 Assuming pseudo-steady-state for the intracellular metabolites, one can limit the solution space of these underdetermined systems by optimizing one particular reaction via linear programming, referred to as the objective function. Besides a value of the optimized objective function, the resulting solution also provides information about intracellular fluxes within the system. 2 A conventional objective function often used for biological entities is maximization of the growth rate, known as the biomass objective function (BOF), giving the underlying assumption that the “goal” of an organism is to maximize its reproduction, from a perspective of adaptive evolution. 3 This optimization approach has been well-studied and validated for many prokaryotic organisms such as 대장균 4,5 and B. subtilis. 6,7 However for a more complex metabolic system such as mammalian cells, fewer successful constraints-based and FBA-related models have been published. 8 Chinese hamster ovary (CHO) cells represent the most widely used host cell for therapeutic recombinant protein production and have been gaining increased attention for in-silico modeling to better understand the metabolism. Prior to the development of CHO genome-scale models, constraint-based modeling work done on CHO cells included studies using metabolomics and FBA to investigate key metabolism such as energy consumption and lactate production, 9,10 using a non-specific mammalian cell genome-scale model and 근육 metabolic model.

A recent CHO-specific genome-scale model contains information on 1766 genes, 6663 reactions, and has led to the generation of three cell line-specific models (CHO-S, CHO-K1, and CHO-DG44). 11 The model was validated by predicting growth rates using sets of metabolic flux data from the literature, and was then applied to study the tradeoff between growth and recombinant protein production. 11 The published CHO GeM has demonstrated its value in facilitating the studies of CHO metabolism. For example, one study tailors the generic CHO GeM into host and recombinant cell-specific models and integrated with multi-omics data to understand the differences of genotypic and phenotypic traits between wild-type and recombinant CHO cells. 12 Another study perturbed the constraints of a CHO GeM to mimic the variation of medium composition and found that CHO cells stop growing when CHO-specific essential amino acids availability decreases, and limitations in non-essential amino acids can be overcome by enhancing amino acid biosynthesis reactions. 10 Besides understanding intracellular physiology and predicting metabolic engineering consequences, constraint-based models can be useful for other applications such as model predictive control, 13,14,15 for various organisms including yeast and mammalian cells. 16,17,18,19

Computational models are useful tools typically because of their capability to describe multiple or hard-to-measure outputs from fewer or easy-to-measure inputs. However, current constraint-based modeling approaches do not fully exploit the value of detailed metabolic models, in particular for mammalian cells with complex, numerous and distinct nutrient inputs. Although intracellular fluxes can be estimated, required inputs are considerable and may be challenging to quantify rapidly. These represent some of the principal difficulties in extending constraint-based models to mammalian cell bioprocesses, eliciting the need for a modeling approach specifically tailored for mammalian cells.

In particular, mammalian cell growth predictions by FBA suffer from a significant complication due to the input requirement of numerous essential amino acids exchange fluxes as part of the constraints. Even slight disagreement between these uptake rate constraints and biomass composition in the model can result in optimization solutions being overly restrictive or even dictated by a single or a few potentially underestimated essential amino acid uptake rates. However, direct estimation of these essential amino acid uptake inputs is possible based on measured growth rates and a “essential nutrient minimization” (ENM) approach which solves for the absolute minimal consumption requirements. These rate estimations can be used to adjust the FBA constraints in order to resolve problematic mass balance constraints. Also, they can be transformed into real-time concentration predictions via a static optimization approach, 14 which can be useful for bioreactor monitoring and control. In this study, we introduce an unorthodox FBA approach based on a set of uptake-rate objective functions (UOFs), which utilizes the measured growth rate as a constraint and independently minimizes the uptake rate of each individual non-essential nutrient. We demonstrate that the UOFs approach reveals insights concerning metabolic differences between mammalian cell line variants not evident from traditional BOF methodologies. Furthermore, sensitivity data derived from the UOFs solution provides a direct visualization of metabolic relationships between nutrients in the networks, providing enhanced characterizations of CHO physiology with applications ranging from cell line evaluation, metabolic engineering to media optimization and biomanufacturing control.


연구 관심사:

Research in the Tank lab focuses on the influence of human activities on ecosystem function in streams and rivers. The Tank Lab is committed to interdisciplinary, translational research that includes outreach to a broad community of policy makers, NGOs, and agencies.

Key research themes in the Tank Lab include:

1. Biogeochemistry of streams and rivers:
We study nutrient and carbon cycling in streams and rivers and the effect of human activities on water quality and ecosystem function. To prevent nutrient runoff from polluting downstream ecosystems, we need to understand the role that streams and rivers play in removing nitrogen and phosphorus from water. The movement of nutrients from agricultural areas in the Midwest to the downstream water bodies such as the Great Lakes and Gulf of Mexico have been linked to the recurring “Dead Zones”. For example, we have projects quantifying greenhouse gas emissions in watersheds of contrasting land use, examining regional and seasonal nutrient limitation status in river biofilms, and quantifying the effects of agricultural and urban land use on the uptake and retention of nutrients through biotic pathways.

2. Influence of agricultural land use and conservation on streams:
Researchers in the Tank lab are also working to assess the efficacy of agricultural conservation practices designed to keep nutrients on fields, where farmers need them. For example, we are measuring how the planting of winter cover crops can influence nutrient export in agricultural streams, by preventing nutrient runoff from fields to adjacent waterways. We are also exploring how improved soil health equates to changes in water quality via the planting of cover crops.

3. Stream restoration:
Floodplains connect streams to riparian areas and often function as hotspots for nitrogen removal as well as sediment deposition. Conventionally-managed agricultural streams are generally channelized, and are characterized by high nutrient and sediment export due to runoff and unstable banks. We are studying the "two-stage ditch” practice which restores floodplains to formerly incised streams, reducing erosion, sediment, and associated phosphorus export to sensitive downstream ecosystems. We also study how floodplains, with their saturated organic-rich soils, may increase biological nitrogen removal through the promotion of microbial denitrification.

4. Using experiments to quantify stream transport at ND-LEEF:
The Tank Lab also uses experiments conducted at the Notre Dame Linked Experimental Ecosystem Facility (ND-LEEF), which is a globally-unique research facility associated with the Notre Dame Environmental Change Initiative (ND-ECI). The facility includes two replicated watersheds that each contain linked streams, ponds, and wetlands, and the Tank Lab is investigating the influence of stream substrate on nutrient uptake and particle retention including the transport of novel materials in flowing waters such as environmental DNA (eDNA).



코멘트:

  1. Habib

    그래요 나는 당신을 이해합니다. 이것에 무언가가 있고 나는 이것이 좋은 생각이라고 생각합니다. 나는 당신과 동의합니다.

  2. Zulkijora

    여전히 품질 ......... 아니, 기다리는 것이 낫다

  3. Ohanzee

    물론 사과드립니다. 또한 내 의견을 표현하고 싶습니다.

  4. Nikolrajas

    .. 거의 .. 이것을 말할 수 있습니다. :) 규칙에 대한 예외

  5. Kegan

    정보에 대해 매우 감사합니다.

  6. Johnston

    그들은 틀렸다. 우리는 논의해야합니다. 오후에 저에게 편지를 보내십시오.

  7. Ackerman

    사과드립니다. 그것은 나에게 가까이 오지 않습니다. 누가 또 무엇을 말할 수 있습니까?

  8. Zulujinn

    나는 최근에 이것이 가능하다고 들었다



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