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유전자형 -/- 대 델타/델타

유전자형 -/- 대 델타/델타


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https://doi.org/10.1016/j.neuron.2018.07.033에서 Pan et al. TMC1^delta/delta라는 명칭을 사용하여 기능적인 TMC1 유전자가 결여된 마우스 균주를 설명합니다. 이 문맥에서 델타/델타 위 첨자와 --/- 위 첨자 사이에 차이점이 있으면 어떻게 합니까?


델타는 다음을 나타냅니다. 돌연변이 대립유전자, 이 경우 시스테인 점 돌연변이체. -/-는 동형 접합체를 나타냅니다. 널 대립 유전자, 이 경우 녹아웃.


사이의 관계에 대한 조사 TMPRSS6 유방암의 유전자 발현, 유전적 변이체 및 임상적 발견

유방암은 전 세계적으로 여성에게 가장 흔한 유형의 암 중 하나입니다. NS TMPRSS6 (Transmembrane Serine Protease 6) 유전자는 hepcidin 조절자로서 철 지혈에 중요한 역할을 하고 유방암 감수성에서 역할을 할 수 있는 matriptase-2를 인코딩합니다. 이 연구에서 우리는 의 발현 수준을 조사했습니다. TMPRSS6 유방암 환자의 건강한 조직 및 종양 조직에 있는 유전자 및 이러한 수준과 병리학적 소견 사이의 관계. 사이의 관계 TMPRSS6 다형성(rs733655, rs5756506, rs2413450, rs855791, rs2235324, rs4820268) 및 환자의 혈액학적 매개변수. 유전자 발현 연구는 47명의 유방암 환자를 포함했고 유전자 다형성 연구는 181명의 유방암 환자와 100명의 건강한 대조군으로 구성되었습니다. 유전자 발현 분석은 qRT-PCR에 의해 수행되었습니다. 유전자형 TMPRSS6 다형성은 RT-PCR에 의해 수행되었습니다. TMPRSS6 종양 조직에서의 유전자 발현 수준은 대조군 조직에서의 발현 수준보다 1.88배 더 높은 것으로 밝혀졌다. 우리는 사이의 관계를 조사했습니다. TMPRSS6 유전자 발현 수준 및 병리학적 데이터, 환자의 에스트로겐 수용체(ER)와 HER2 발견 사이에 통계적으로 유의한 관계가 발견되었으며, TMPRSS6 유전자 발현(각각 p = 0.02, p = 0.002). 사이의 관계가 있을 때 TMPRSS6 유전자 다형성 관련 유전자형 분포 및 혈액학적 소견을 조사한 결과, 평균 미립자 헤모글로빈 농도(MCHC) 매개변수와 rs733655의 다형성 사이에 유의한 관계가 확인되었습니다. 우리의 연구 결과에 따르면, TMPRSS6 암 조직에서의 유전자 발현은 matriptase-2가 암 과정에서 효과적일 수 있음을 보여줍니다. 따라서 TMPRSS6 유전자 다형성은 환자의 혈액 매개변수에 영향을 주어 질병 진행에 영향을 미칠 수 있습니다.


배경

델타 간염 바이러스(HDV)는 음성 가닥의 게놈을 가진 작은 결함이 있는 RNA 바이러스입니다. 헬퍼 바이러스인 B형 간염 바이러스(HBV)가 비리온 조립 및 분비를 완료하기 위해 외피 단백질(HBsAgs)을 공급해야 합니다[1-3]. HDV 게놈은 약 1,700개의 뉴클레오티드 길이로 분자 내 상보적 염기쌍의 정도가 높기 때문에 가지가 없는 막대 모양의 구조를 형성하는 것으로 보이는 원형 형태입니다[4,5]. HDV의 게놈 서열은 바이로이드 유사 서열과 단백질 코딩 서열로 구분된다[1,6]. HDV는 바이로이드 서열과 DIPA(델타 상호 작용 단백질) 단백질을 코딩하는 세포 mRNA 사이의 RNA 재조합으로 인해 발생한다는 가설이 세워졌습니다[6,7]. 전 세계의 HDV 염기서열을 분석한 결과 아프리카에서 온 것이 가장 다양성이 높은 것으로 나타났으며, 이는 최초의 HDV가 아프리카에서 발생했을 수 있음을 시사합니다[8,9]. 아프리카에서 새로운 HDV 염기서열을 추가로 분리한 후 HDV의 분류는 유전자형 I에서 III까지를 포함하는 분류에서 clades 1에서 8까지 포함하는 분류로 변경되었습니다[8].

지난 30년 동안 집중적인 분자 생물학 연구를 통해 복제에서 HDV로 인코딩된 단백질의 기능과 역할이 크게 밝혀졌습니다. HDV 복제 동안 코딩 서열은 동일한 리딩 프레임에서 각각 195개 및 214개 아미노산 길이인 소형 및 대형 형태(SDAg 및 LDAg)인 2개의 델타 항원(HDAg)으로 번역됩니다[10,11] . LDAg의 생산은 세포 ADAR[12,13]에 의해 수행되는 RNA 편집으로 알려진 과정을 통해 이루어지며, 이는 SDAg의 앰버 정지 코돈(UAG)을 트립토판 코돈(UGG)으로 전환하여 추가로 19개 또는 20개의 아미노를 생성합니다. LDAg의 C-말단에 있는 산[14]. SDAg는 HDV 복제에 필수적이며 LDAg는 SDAg의 기능을 길항하고 비리온 조립 및 성숙 동안 HBsAg와 상호작용하는 데 필요합니다[15,16]. CaaX-box(211 CRPQ 214, 211 CTPQ 214, 211 CTQQ 214, 다양한 HDV 유전자형, 그림 1A 참조)가 LDAg의 C-말단에 있으며, 이는 LDAG의 신호로 작용합니다. 이소프레닐화. LDAg의 이소프레닐화 신호의 돌연변이는 비리온 조립 및 분비의 실패로 이어진다[17-19].

HDV의 LDAg 아미노산 서열의 특징 및 LDAg의 13개 아미노산 펩티드를 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드. (A) 세 가지 유전자형에서 LDAg의 전체 길이의 아미노산(한 글자 기호) 정렬. 유전자형 I은 미국 계통(수탁 번호 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"M28267","term_id":"602445","term_text":"M28267">> M28267), 대만-3 균주의 유전자형 II(수탁 번호 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"U19598","term_id":"1480437","term_text":" U19598">> U19598) 및 페루 균주의 유전자형 III(수탁 번호 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"L22063","term_id":"410182","term_text ":"L22063">> L22063). 추정되는 클라트린 결합 도메인은 직사각형 상자로 표시되고 LDAg의 마지막 19개 또는 20개 아미노산은 굵은 글씨체로 강조 표시됩니다. 번역 후 변형에 대한 공통 아미노산은 다음과 같이 표시됩니다: 아미노산 72에서 Ac(아세틸화), 위치 2, 123 및 177에서 Pi(인산화) 및 위치 211에서 Py(이소프레닐화). 아미노산 위치 숫자로 표시됩니다. (B) LDAg의 상응하는 짧은 아미노산 서열(올리고뉴클레오티드 위의 한 글자 기호로 표시됨)의 발현을 위해 2개의 상보적 올리고뉴클레오티드를 설계했습니다. 올리고뉴클레오티드의 5'-말단과 3'-말단은 제한 부위를 포함하도록 설계되었습니다. 에코RI와 남자 이름나, 각각. 바로 옆에 있는 제한 장소 남자 이름나는 에코빠른 클론 선택이 가능하도록 특별히 설계된 RV.

이소프레닐화 신호 서열 외에도 LDAg의 C-말단에서 NES(nuclear exporting signal)가 확인되었습니다[20]. SDAg 및 LDAg의 일반적인 195개 아미노산 서열 내에서 2개의 추정 류신-지퍼 모티프, RNA 결합 모티프 및 2개의 핵 국소화 신호가 확인되었습니다[21-24]. SDAg와 LDAg는 모두 변형 정도가 다른 인단백질이다[25]. PKC[26], CKII[18,26], PKR[27] 또는 ERK1/2[28]에 의해 인산화된 후 HDV 복제에 영향을 미치거나 SC-35 반점[18,26-28]을 표적으로 합니다. . 리신-72에서 HDAg의 아세틸화와 아르기닌-13에서 SDAg의 메틸화 모두 HDV 복제에 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다[29-31]. 알려진 모든 HDV 유전자형 중에서 HDAg의 번역 후 부위의 보존은 HDAg의 번역 후 변형을 담당하는 세포 효소가 HDV 복제에 모두 관여하지는 않더라도 적어도 부분적임을 시사합니다.

HDV와 HBV의 동시 감염 및 중복 감염은 일반적으로 HBV 단일 감염보다 더 심각한 간 질환을 유발합니다[32]. 다양한 HDV 유전자형은 서로 다른 지리적 분포를 나타내며 서로 다른 질병 패턴과 관련이 있습니다[7,33]. HDV 유전자형 I은 전 세계적으로 분포하며 전격성 간염에서 무증상 만성 간 질환에 이르는 광범위한 질병과 관련이 있습니다. 유전자형 II형은 일본, 대만, 시베리아 등 아시아에서 주로 발견되며, I형보다 덜 심각한 질병을 일으키는 것으로 보인다. 유전자형 III형은 주로 남미의 북부 지역에서 발견되며 심각한 형태의 전격성 간염[ 33]. HDV 발병 기전은 HDV, HBV 및/또는 숙주 인자 사이의 복잡한 상호 작용으로 인해 발생하는 것으로 보이며 완전히 이해되지 않았습니다.

최근 두 연구에서는 SDAg보다 LDAg가 HDV 발병에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다[34,35]. 한 연구에서는 TGF-β 신호전달을 조절하여 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 발현을 조절하는 Smad-3에 대한 LDAg의 직접적인 결합을 보여주었으며, c-Jun에 의해 유도된 신호 캐스케이드는 이것이 간경변으로 이어지는 것으로 보입니다[35]. 다른 연구에서는 LDAg의 세포질 형태가 clathrin heavy chain(CHC)에 결합하고 이 LDAg-CHC 상호작용이 HDV 조립에 필요하다고 제안했습니다. 또한, LDAg-CHC 상호작용은 클라트린 매개 세포내이입 및 세포외배출을 방해하는 것으로 보이며, 이는 결국 간세포 손상으로 이어질 수 있습니다[34]. 그러나, 유전자형 I의 LDAg에서 확인된 clathrin-box(199 LFPAD 203)는 유전자형 II 및 III에서 동일한 위치에 보존되지 않았다(도 200B(도 1A). 1A). 이 연구는 clathrin 결합 활성이 LDAg의 3가지 주요 유전자형에 걸쳐 보존되는지 여부를 확인하기 위한 목적으로 수행되었습니다.


분류

HDV는 국제바이러스분류위원회(ICTV)에 의해 척추동물의 새로운 바이러스 종으로 인정되었으며, 델타바이러스과 가족, 델타바이러스 속 [17]. HDV는 식물병원체, 바이로이드 및 바이러스와 구조적으로 매우 유사하고 복제 방식이 유사하지만 별도의 속으로 분류되기에는 충분히 다릅니다. HDV는 HBV가 없으면 HDV가 감염될 수 없다는 생물학적 원리에 근거하여 일반적으로 HBV의 위성 바이러스로 분류됩니다[14, 18].


논의

우리 실험실 10,26,27 및 기타 28,29의 최근 연구는 변경된 SGTA 발현을 종양 세포 증식 및/또는 암 예후에 연결했습니다. 이는 SGTA가 세포 주기 및 세포자멸사 5,45,46 및 정확한 접힘, 구획화 및/또는 인신매매 1을 보장하기 위해 수많은 단백질 클라이언트의 분자 공동 샤페론에 연루되어 있다는 점을 감안할 때 놀라운 일이 아닙니다. 이러한 각 과정은 결함이 있는 경우 종양 형성에 기여할 가능성이 있습니다. 여러 질병 상태 10,18,26,27,28,29,30,31의 병태생리학에서의 역할을 제외하고 SGTA의 정상적인 생리학적 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

시험관 내, SGTA 신장(NBE) 34, 자궁경부암(HeLa) 5 및 전립선암(C4-2B) 26 세포의 녹다운은 세포 분열 5,34 손상으로 인한 증식 및 생존력을 감소시키며, 이는 세포질 분열 34 결함 및 염색체 정렬 5 완료 실패와 관련이 있습니다. 이것과 그 사실 때문에 Sgta 유비쿼터스 발현되고 SGTA와의 광범위한 단백질 상호 작용이 문서화되어 있습니다 1, 우리는 다음과 같이 가설을 세웠습니다. Sgta 생명에 필수적이며 쥐에서 제거하면 치명적일 것입니다. 그러나 반대로 우리는 여기에서 실행 가능한 Sgta -/- 동물은 번식에서 생산되었습니다 Sgta- 보존된 SGTA 오르솔로그 32,33의 녹아웃/다운의 경우와 같이 결핍된 마우스 C. elegans, D. melanogaster 그리고 S. 세레비지애 14,15,33 . 감소된 수에 대해 관찰한 경향 Sgta -/- 자손은 예상되는 멘델식 유전과 비교하여 유사한 TPR 함유 단백질 FKBP52에 대한 돌연변이체의 유전과 일치합니다(Fkbp4) 47,48 . SGTA가 꼬리 고정(TA) 단백질 삽입에 관여한다는 상당한 증거를 감안할 때 16,22,49 TA 생합성은 초기 발달에 필수적이며 이 과정을 방해하는 유전적 절제는 배아 치사율과 연결되어 있기 때문에 50,51 비정상적인 TA 단백질 처리는 돌연변이 동물의 감소된 수율에 기여할 수 있습니다. 태아 사망의 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 FKBP52 -/- 의 경우 유전적 배경이 FKBP52 작용의 침투에 기여했습니다. 즉, C57BL/6J 47 및 129SvEv 48 배경에서 FKBP52 -/- 마우스의 독립적인 생성은 이형접합 교배로부터의 배아의 각각 50% 및 30%에서 치사율을 산출했습니다. 더욱이, FKBP52-129SvEv 돌연변이를 C57BL/6 균주로 역교배시키면 치사율이 거의 100%로 증폭되어 돌연변이 모델의 기본 유전학이 표현형에 영향을 미친다는 경고를 강조합니다. 더 뚜렷한 표현형인지 여부 Sgta -/- 마우스의 다른 배경 균주에서 특성화되었다면 관찰되었을 것입니다. 아직 결정해야 합니다. FKBP52 -/- 와 대조적으로 유사한 단백질 FKBP51 (Fkbp5), 초기 생존에 영향을 미치지 않았으며 생쥐에서 명백한 변경된 표현형을 이끌어내지 못했습니다 53 , FKBP51 FKPB52 결실(129SvEv 배경)과 함께 녹아웃(C57BL/6J 배경)은 초기 배아 생활 54에서 완전한 치사율을 일으켰습니다. 이것은 공동 샤프론 시스템에 중복성이 존재한다는 것을 강조합니다. 이 개념과 일치하게, FKBP52 -/- 남성은 정상 고환을 발달시켰지만 음경 요도 하열을 나타냈습니다 53 . FKBP52 -/- 고환에서 증가된 FKBP51 mRNA 및 단백질 발현은 음경이 아닌 고환 이형성을 적극적으로 예방할 수 있습니다. 동형접합의 맥락에서 Sgta 절제, 구조적으로 유사한 TPR-함유 단백질(들)이 개입하여 부재 시 SGTA의 역할을 수행하는 것이 가능합니다. 증가 Dnajc7 난소의 (TPR2) mRNA가 이 목적을 수행할 수 있지만 7개의 TPR 함유 단백질의 mRNA 발현은 전립선, 고환 및 유선에서 변하지 않았습니다. 단백질 발현 및/또는 TPR 함유 단백질의 국소화 변화가 정상 생리학에서 SGTA 손실을 보상하는지 여부는 추가 조사가 필요하며 경미한 Sgta-현재 연구에서 null 표현형이 관찰되었습니다. 스트레스 요인을 적용하여 보다 명백한 표현형을 유도할 수 있습니다. Sgta- 공동 샤페론이 최적의 접힘/재접힘 및 스트레스에 영향을 받는 클라이언트 단백질 55 인신매매에 필수적이기 때문에 null 돌연변이가 있습니다. SGTA ortholog용 효모 null로, 병장-2, 2개의 별개의 세포 스트레스 요인은 야생형 효모와 비교하여 효모 생존력 15, 성장 및 집락 형성 20을 감소시켰습니다. 이것은 SGTA가 특정 세포 조건에서 필수적이며 이러한 조건이 발생할 때 기능 장애를 방지하기 위해 손실이 보상될 가능성이 있음을 추가로 뒷받침합니다.

Sgta-무효 마우스, 체중 및 길이의 비례적 감소를 포함하는 감소된 신체 크기는 관찰된 가장 명백한 표현형 변화였으며 동형 접합 돌연변이체로 제한되었습니다. 영양이 부족하면 발육부진을 유발할 수 있습니다 Sgta -/- 성장, 특히 체중 차이가 간호 의존도가 감소하는 단계와 일치함에 따라. 사료 효율이 Sgta −/− 쥐는 섭취한 음식에서 영양분을 흡수하고 활용하는 능력이 아직 알려지지 않았습니다. 이든 Sgta 절제는 특히 미오스타틴 23과 GHR 12가 SGTA 클라이언트 단백질이기 때문에 호르몬 성장 매개체의 신호 전달에 변화를 일으켰습니다. 다음과 같은 경우 골격근의 결함 발달 및 변형된 질량이 예측될 수 있습니다. Sgta 결핍은 근육량 56의 음성 조절자인 미오스타틴의 성숙과 신호 전달에 영향을 주었지만 근육 병리학이나 질량에는 영향을 미치지 않았습니다. GHR을 통해 작용하는 GH는 체세포 성장, 세포 분화 57 및 IGF-1 36의 측분비 생산에 필수적입니다. 비정상적인 GHR 신호 전달 및 GH 저항성은 IGF-1 생산 중단 및 성장 저해를 유발합니다. GH와 GHR이 모두 초기 배아 발생에서 정상적으로 발현되고 있음에도 불구하고, 변경된 GH 신호로 인한 성장 변화는 생쥐 36,58의 출생 후 d14-21에서만 관찰됩니다. GHR-null 마우스에서 3주째 왜소화는 순환 36,58에서 GH 증가 및 IGF-1 수준 감소와 관련이 있습니다. 마찬가지로, 생쥐(IGF-1Rneo)에서 기능적 IGF-1R이 감소하면 4-9주령부터 성장이 저해되며, 이는 유지되는 크기의 안정기에 해당합니다. GHR/IGF-1R 결핍과 유사 58,59 , Sgta-null 돌연변이는 WT보다 물리적으로 작은 것으로 나타났습니다.

6주, 암컷은 WT 동물의 체중의 93%, 수컷은 87%였습니다. GH/GHR과 유사하게 SGTA는 태아에서 태아기에 감지되지만 초기 발달 동안의 기능은 알려져 있지 않습니다. 전구체 및 성숙한 GHR의 유비퀴틴 의존성 세포내이입 모티프와의 상호작용을 감안할 때, SGTA는 전구체 GHR이 있는 소포체에서 성숙한 GHR이 기능하는 세포막으로 수송되는 동안 유비퀴틴 기계와의 GHR 상호작용을 방지하는 것으로 추측되었습니다. . 비정상적인 GHR/IGF-1R 트래피킹 및 잠재적으로 유비퀴틴 매개 GHR 저하가 유발될 수 있습니다. Sgta 제거. 우리는 이것이 관찰된 성장 발육부진에 기여할 수 있다고 가정합니다. Sgta -/- 마우스, SGTA의 손실을 제공하는 경우 다른 보조 샤페론에 의해 보상되지 않습니다. IGF-1 혈청 및 조직 mRNA 수준 감소 Sgta -/- 동물은 결함이 있는 GHR 신호 전달을 반영할 수 있는 반면, Sgta -/-는 결핍된 GH/IGF-1 신호전달에 대한 보상을 나타낼 수 있지만, 후자는 단백질 수준에서 확인이 필요합니다.

생쥐를 불임으로 만드는 동형접합 FKBP52 결실과 달리 53, Sgta 결핍은 이 연구에서 경미한 불임만을 유발했습니다. 안드로겐/AR 기반 발달에 의존하는 성기의 이형성은 결함이 있는 FKBP52 -/- 남성 생식 53 의 주요 원인인 반면, 프로게스테론 수용체 의존성 자궁 이식의 실패는 FKBP52 -/- 여성 48 에서 불임을 부여했습니다. 안드로겐 신호 전달을 위한 대리 조치 증가(AGD, 음경 및 포피샘 크기) 자궁 내, 사춘기 전과 사춘기에 모두 또는 부분적으로 Sgta 결핍은 변경된 AR 신호전달 및/또는 안드로겐과다화를 암시합니다. 그러나 다른 여러 안드로겐 의존성 기관은 영향을 받지 않았습니다. Sgta 의 mRNA 발현과 마찬가지로 남성과 여성에서 절제 아르 및 AR 반응성 유전자. 여하튼 효과는 Sgta 성 스테로이드 생산에 대한 절제를 배제할 수 없습니다.AR 조절 외에도 SGTA는 프로게스테론 및 글루코코르티코이드 수용체 1,60에 대한 조절 특이성을 나타내므로 프로게스테론 및 글루코코르티코이드 신호 전달에 의해 제어되는 생물학적 과정에 대한 SGTA 절제의 영향도 향후 조사를 보증합니다. 세포질의 동시 증가 없이 감소된 핵 AR 면역반응성 Sgta +/- 전립선은 다음을 암시합니다. Sgta, 다른 TPR 함유 단백질과 마찬가지로 TPR2/Dnajc7 그리고 칩/스텁1, AR 안정화 및/또는 저하 61에서 역할을 합니다. 이것은 안정화가 부분적인 환경에서 보상되지 않는 GHR 12의 경우인 것으로 보입니다. Sgta 부족.

요약하면, 이 연구는 SGTA의 다면적 역할에 대한 흥미로운 첫 시각을 제공했습니다. 생체 내. 부분적이지는 않지만 완전한 SGTA의 절제는 난임을 부여하고 자손의 생존력과 성장을 제한했습니다. 분자 공동 샤페론의 복잡한 상호 작용과 생리적 역할, 특히 호르몬 수용체 성숙 및 신호 전달에서 중복성의 중요성은 현재 발견에 의해 강조됩니다. 이것 Sgta-null 모델은 SGTA의 역할이 연루된 호르몬 의존성 및 β-아밀로이드 질환을 비롯한 여러 임상 장애에 대한 추가 연구에 적합합니다.


3개의 결과

3.1 골격근 TRα1 느린 경련 근육에서 섬유 유형 구성을 정의하지만 운동 능력과 에너지 항상성에 크게 필요합니다.

전신 에너지 대사에 대한 골격근의 갑상선 호르몬 수용체 신호 전달의 역할을 연구하기 위해 골격근 특이적 TRα를 생성했습니다.1 기능 상실 마우스 모델(TRα HSACre)(그림 S1A-C). 체중, 지방 및 제지방량, 또는 포도당 내성의 차이는 유전자형 간에 관찰되지 않았습니다(그림 1B-D). 6주 동안 측정된 트레드밀 및 자발적인 바퀴 달리기의 완전한 달리기 능력도 유전자형 간에 다르지 않았습니다(그림 1E,F).

또 다른 동물 집단은 22주 동안 HFD를 먹였습니다. 우리는 식이 도전에 대한 응답으로 WT 마우스에 비해 TRα HSACre 마우스에 대한 느린 체중 증가 궤적을 관찰했으며(그림 1H), 이는 음식 섭취의 차이로 설명할 수 없었습니다(그림 1I). HFD 노출 18주 후, TRα HSACre 마우스의 체중은 WT 마우스와 동일했습니다. 체중이 일치하는 HFD를 먹인 마우스에서는 중간 정도의 감기(14°C에서 4시간)에 대한 반응으로 체성분, 포도당 내성 또는 체온의 유전형 차이가 발견되지 않았습니다(그림 1J-L). 특히, TRα HSACre 마우스는 WT 마우스에 비해 가자미근(SOL)에서 유형 I 섬유의 증가와 유형 IIA 섬유의 감소를 나타냈습니다(그림 1N). 그러나 이 차이는 속근 신근 장지지근(EDL) 근육에서는 나타나지 않았습니다(그림 1O). 느린 트위치 근육의 섬유 유형 스위치는 세포 및 미토콘드리아 스트레스의 전신 마커인 순환 성장 분화 인자 15(GDF15)의 증가(72%)를 동반했습니다(그림 1P).

3.2 TRα1 골격근에서 T3 유도 에너지 소비에 필요하지만 T3 유도 체온 상승에는 필요하지 않습니다.

골격근 TRα의 중요성을 연구하기 위해1 갑상선 호르몬 유도 에너지 소비에 대해 TRα HSACre 및 WT 한배 새끼 마우스의 5가지 다른 코호트를 s.c.로 5, 7 또는 14일 동안 매일 치료했습니다. T3 또는 비히클 주사. T3 및 T4의 혈장 농도는 비히클 처리 린 및 DIO TRα HSACre 및 WT 한배새끼 대조군 사이에서 유사했습니다(그림 2A-C,F-H). 예상대로 T3 처리는 T3를 증가시켰지만 T3(100nmol/kg) 처리 7일 후 T4 혈장 농도를 감소시켰고 유전자형 간에 차이가 없었습니다(그림 2B,C,G,H). 간접 열량측정법은 마른 체형과 비만인 WT 마우스 모두에서 T3 처리에 대한 응답으로 에너지 소비의 증가를 보여주었습니다(그림 2D,E,I,J, 그림 S2A,B). T3 처리는 마른 TRα HSACre 마우스에서 에너지 소비를 유의하게 증가시키지 않았습니다(그림 2D,E). DIO WT 생쥐에서 대사율에 대한 T3의 효과는 마른 WT 생쥐에서보다 더 두드러졌으며, 이는 T3의 열 발생 효과가 지방량과 관련되어 있음을 시사합니다. 이러한 맥락에서 기능적 TRα의 부재일 수 있습니다.1 근육이 마른 마우스보다 DIO 마우스의 에너지 소비에 미치는 영향이 적습니다. 따라서 낮 동안 T3 매개 대사율 증가는 WT 및 TRα HSACre 마우스에서 유사했지만, 암흑기 동안 T3 매개 에너지 소비 증가는 WT 마우스에서만 관찰되었습니다(그림 2I, J). DIO 마우스에서 T3 자극 에너지 소비의 연속적인 증가는 이 식이 모델에서 이전에 관찰한 것과 유사합니다. 11

WT 및 TRα HSACre 마우스에서 미토콘드리아 호흡에 대한 T3의 근육 특이적 효과를 해독하기 위해 T3 처리 마우스에서 지근(SOL) 및 속근(EDL) 근육을 절제하고 미토콘드리아 호흡 능력을 평가했습니다(그림 2K, 엘). SOL에서 누출 호흡(상태 2)은 유전자형 간에 유사했지만 T3 처리의 맥락에서 호흡은 전신 간접 열량계 데이터를 미러링하는 WT 마우스에서만 증가했습니다(그림 2K). 복잡한 I 연결된 기질을 사용한 산화적 인산화 능력은 WT 마우스에 비해 TRα HSACre 마우스에서 비자극 상태의 SOL에서 손상된 호흡을 나타냈습니다. 복합 I- 및 복합 I + II-연관 호흡의 평가는 TRα HSACre의 T3 자극이 WT 마우스와 유사한 정도로 호흡을 증가시키는 것으로 확인되었습니다. 미토콘드리아 호흡의 차이는 EDL에서 관찰되지 않았습니다(그림 2L).

갑상선 호르몬이 체온을 높이는 메커니즘은 파악하기 어렵습니다. 근육 TRα의 가능한 역할을 테스트하기 위해1 T3 매개 체온 상승에서 우리는 7일 동안 T3 또는 비히클을 매일 처리한 WT 및 TRα HSACre 마우스의 핵심 체온을 측정했습니다. 이전 연구와 일치하여 T3 처리는 주변 실온(22°C) 및 열중성 조건(30°C)에서 WT 마우스의 체온을 상당히 상승시켰습니다(그림 2M,N). 특히, T3로 처리된 TRα HSACre 마우스는 22°C 및 30°C 모두에서 체온 증가 측면에서 T3으로 처리된 WT 마우스와 유사하게 반응했습니다(그림 2M, N). 또한, BAT 및 iWAT에서 BAT 중량 또는 UCP1 단백질 발현의 보상적 차이는 T3 또는 비히클 처리 14일에 대한 반응으로 DIO WT 마우스에 비해 DIO TRα HSACre 마우스에서 관찰되지 않았습니다(그림 S2C-G). 종합하면, 이러한 결과는 1) 골격근의 갑상선 호르몬 신호가 T3 유발 발열에 기여하지 않으며, 2) 갑상선 호르몬에 의한 에너지 소비 증가와 T3 유도 발열이 완전히 상호 연결된 과정이 아님을 시사합니다.

3.3 구조 및 대사 경로는 TRα의 T3 매개 활성화에 대한 반응으로 전사체를 지배합니다1 가자미근에

T3 치료에 대한 반응으로 전신 에너지 소비에서 근육 관련 유도의 기계적 토대를 해부하기 위해, 우리는 치료 및 비치료 조건 모두에서 WT 및 TRα HSACre SOL의 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 수행했습니다. 이러한 분석은 788개의 전사체가 WT SOL과 TRα HSACre SOL 간에 차등적으로 발현되었음을 보여주었습니다(그림 3A). 자극되지 않은 조건에서 섬유 유형 구성 및 근육 형태와 연결된 여러 유전자가 WT 마우스와 비교하여 TRα HSACre 마우스에서 차등적으로 발현되었습니다(그림 3A). 또한, sarcolipin 및 MSS51과 같은 근육 열 생성과 관련된 유전자는 유전자형에 따라 다릅니다. T3 처리에 대한 응답으로, 발현 프로파일링은 TRα HSACre 마우스에 비해 WT 마우스에서 차등적으로 조절되는 온톨로지 용어 "NADP 생합성" 및 "분지쇄 아미노산(BCAA) 대사"가 있는 유전자의 농축을 확인했습니다(그림 3B). TRα HSACre 마우스와 비교하여 WT 마우스의 SOL에서 상위 T3-반응성 전사체의 상대적 발현은 전사 조절에서 명확한 구별을 드러냈습니다(그림 3C, 그림 S3A). 특히, TRα의 돌연변이에도 불구하고 전신 T3 투여에 대한 SOL의 명확한 전사 반응은 유지되었다.1 근육에. 이것은 후속적으로 근육 전사체에 2차 효과를 도입하는 T3의 전신 효과를 반영할 수 있습니다. 근육 열 발생(그림 3D) 및 근육 섬유 유형 형태(그림 3E)에 관여하는 주요 유전자의 평가는 비자극 및 T3 유도 조건 모두에서 WT 마우스와 TRα HSACre 마우스 사이의 차등 발현을 입증했습니다. 특히, TRα HSACre 마우스에서 사르코리핀 mRNA의 자극되지 않은 증가는 EDL, 비복근 및 대퇴사두근에서도 분명했습니다(그림 S3B). BAT 열발생 및 BAT의 갑상선 호르몬 신호 전달과 관련된 마커를 조사하여 TRα의 특이성을 결정했습니다.1-관련 근육 전사 변화(그림 3E). T3가 BAT 열발생과 관련된 전사체에 분명히 영향을 미치는 반면, WT 마우스와 비교하여 TRα HSACre 마우스 사이에는 차등 발현이 관찰되지 않았으며, 이는 근육 특이적 돌연변이가 다른 열발생 조직의 대사 프로그램에 전신적 "전이"가 없음을 의미합니다(그림3F) .


CD40 및 CD40L의 유전적 변이 분석: 급성 관상동맥 증후군에서 mRNA 상대 발현 및 가용성 단백질과의 관계

1 Instituto de Investigación en Ciencias Biomédicas(IICB), Centro Universitario de Ciencias de la Salud(CUCS), Universidad de Guadalajara(UdeG), Sierra Mojada #950, Colonia Independencia, C.P, 44340 Guadalajara, Jalisco

2 Doctorado en Ciencias Biomédicas, Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS), Universidad de Guadalajara (UdeG), Guadalajara, Jalisco, Mexico

3 Doctorado en Genética Humana, Centro Universitario de Ciencias de la Salud(CUCS), Universidad de Guadalajara(UdeG), Guadalajara, Jalisco, Mexico

4 Especialidad en Cardiología, Unidad Médica de Alta Especialidad, Centro Médico Nacional de Occidente(CMNO), Departamento de Cardiología, Instituto Mexicano del Seguro Social(IMSS), Guadalajara, Jalisco, Mexico

추상적 인

급성 관상동맥 증후군(ACS)은 CD40 및 이의 리간드 CD40L과 같은 공동자극 분자에 의해 면역 세포의 활성화를 촉진하는 염증 인자의 존재에 의해 유발될 수 있습니다. 환경 및 유전적 요인은 ACS의 병인과 관련이 있습니다. 이 연구의 목적은 다음과 같은 유전자와 단백질 발현을 조사하는 것이었습니다. CD40 그리고 CD40L 서부 멕시코 인구의 ACS 환자의 유전적 변이. 서부 멕시코에서 총 620명의 개인이 모집되었습니다: 320명의 ACS 환자와 허혈성 심장병의 병력이 없는 300명의 개인이 평가되었습니다. 유전형은 TaqMan SNP 유전형 분석을 사용하여 결정되었습니다. CD40 그리고 CD40L mRNA 수준에서의 발현은 TaqMan 유전자 발현 분석을 사용하여 정량화되었습니다. 가용성 단백질 이소형은 효소 결합 면역흡착 분석법으로 측정하였다. 우리는 사이의 연관성에 대한 증거를 찾지 못했습니다. CD40 (rs1883832, rs4810485 및 rs11086998) 및 CD40L (rs3092952 및 rs3092920) 유전적 변이체 및 ACS에 대한 감수성, 그러나 rs1883832 및 rs4810485는 높은 sCD40 혈장 수준과 유의하게 연관되었습니다. sCD40L의 혈장 농도는 성별과 급성 관상동맥 증후군의 임상 스펙트럼에 영향을 받을 수 있습니다. 우리의 결과는 의 기능적 역할을 제안하지 않습니다. CD40 그리고 CD40L ACS의 유전적 변이. 그러나 이는 약리학적 치료를 받는 경우에도 ACS 환자의 염증 과정 및 혈소판 활성화를 반영할 수 있습니다. ACS의 병인에서 CD40-CD40L 시스템의 중요한 역할로 인해 CD40 및 CD40L의 가용성 수준이 ACS 후 재발하는 심혈관 사건의 임상적으로 유용한 마커가 될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 종단적 연구가 필요합니다.

1. 소개

심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인이며[1], 특히 관상 동맥 혈류의 급격한 감소와 심근 허혈 또는 괴사를 특징으로 하는 급성 관상 증후군(ACS)입니다. ST분절 상승 심근경색증(STEMI), 비ST분절 상승 심근경색증(NSTEMI), 불안정형 협심증(UA)의 3가지 임상적 실체가 구별되지만 공통된 병인을 가지고 있지만 결과는 다를 수 있습니다[2]. 이러한 이유로 조기 예후와 위험 계층화는 ACS 이후 재발성 에피소드 또는 심지어 사망의 위험을 줄이기 위한 첫 번째 조치입니다[3].

ACS의 병인에는 대사, 유전, 환경 및 기타 요인이 관련되어 있으며, 이는 동맥경화증 발병의 핵심 요소인 염증 및 내피 기능 장애를 증가시킬 수 있는 상태입니다[4, 5]. 유전 가능성의 백분율은 상당한 유전적 영향을 뒷받침하는 ACS 위험의 개인 간 변이의 40-55%인 것으로 추정되었습니다[6].

CD40은 B 림프구에서 구성적으로 발현되고 단핵구, 대식세포, 내피 세포(EC) 및 평활근 세포(SMC)와 같은 다른 세포에서 발현되는 공동자극 분자입니다[7]. 그것의 리간드인 CD40L은 주로 혈소판(95%), T 림프구, EC, SMC 및 대식세포의 표면에서 발현됩니다[7, 8].

CD40과 CD40L의 상호작용은 신호 전달 경로 c-Jun, NF-를 통한 양방향 세포 활성화에 참여하기 때문에 ACS의 면역 병인 발생에 관여합니다[9].κB 및 ERK 1/2는 부착 분자의 증가, 전염증성 사이토카인의 분비 및 혈소판 활성화를 촉진합니다[7]. 그러나 CD40 및 CD40L의 가용성 형태는 내피 기능 장애 또는 ACS 환자의 심혈관계 부작용의 표지자로서 관련되어 있어 치료제의 잠재적 표적으로 제안되고 있다[9].

이와 관련하여 SNP(단일염기다형성)가 확인되었습니다. CD40 그리고 CD40L 게놈 차원의 연관성 연구[7] 및 후보 유전자 연구[12-16]를 통해 ACS 발병에 대한 감수성을 증가시킬 수 있는 유전자. 이러한 유전적 변이는 염증 및 자가면역 질환[17, 18]과 연관되어 있습니다. CD40 그리고 CD40L mRNA 발현 [19-25] 뿐만 아니라 죽상동맥경화증의 개시, 발달 및 진행에 영향을 미치는 [15, 20] 기능을 수정하는 가용성 형태의 조절 [26, 27].

염증과 내피 기능 장애는 죽상 동맥 경화증의 진행을 촉진하는 요인이지만 기존 위험 요인을 죽상 동맥 경화 과정과 연결하는 근본적인 세포 및 분자 상호 작용은 잘 특성화되지 않습니다. 우리가 아는 한, 의 기여도를 평가하는 연구는 없습니다. CD40 그리고 CD40L 특히 ACS와 관련된 심혈관 질환과 관련된 서부 멕시코 인구의 다형성.

따라서 이 연구의 목적은 단일 염기 다형성 사이의 연관성을 탐색하는 것이었습니다. CD40 (rs1883832(c.-1C>T), rs4810485(c.51+914G>T) 및 rs11086998(c.679C>G)) 및 CD40L (rs3092952(g.1615A>G) 및 rs3092920(18656G>T)) 유전자 및 ACS에 대한 감수성. 우리는 또한 이러한 다형성 사이의 연관성을 탐구합니다. CD40 그리고 CD40L 말초 혈액 백혈구에서의 발현 및 ACS 환자 및 대조군(CG)에 포함된 허혈성 심장병이 없는 대상체로부터 얻은 혈장 샘플에서 정량화된 가용성 수준.

2. 재료 및 방법

2.1. 대조군의 ACS 환자 및 피험자

연구 코호트는 American College of Cardiology[28]에 따라 분류된 ACS로 진단된 320명의 환자와 CG로 ACS 위험 인자가 있지만 허혈성 심장병의 병력(설문으로 확인)이 없는 300명의 대상으로 구성되었습니다. 서부 멕시코의 연구에 포함된 모든 개인은 Hospital de Especialidades del Centro Medico Nacional de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social(CMNO-IMSS)에서 모집되었습니다. 연구 기간은 2016년 2월부터 2018년 6월까지였다.

2.2. 윤리적 고려 사항

이 연구는 2013년 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 모든 개인은 연구 참여에 동의하고 사전 서면 동의서에 서명했습니다. 윤리적 승인은 Centro Universitario de Ciencias de La Salud(CUCS), UdeG(CI/065/2014)에서 획득했습니다.

2.3. 유전자형 및 품질 관리

유전적 변이체는 TaqMan 어세이를 사용하여 유전형을 분석했습니다. CD40 (rs1883832(C__11655919_20), rs4810485(C__1260190_10) 및 rs11086998(C__1260325_10)) 및 CD40L 제조업체의 프로토콜에 따라 TaqMan Genotyping Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 (rs3092952(C__26154899_10) 및 rs3092920(C__27452204_10)). 품질 관리로서 모든 다형성에 대해 샘플의 25%에 대한 이중 맹검 유전형 분석을 수행했으며, 유전형 할당에는 변동이 없었습니다.

2.4. Real-Time PCR 분석

총 RNA는 Chomczynski와 Sacchi의 방법에 따라 제조 업체의 지시에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 말초 혈액 백혈구에서 추출되었습니다[29]. 총 RNA 1마이크로그램을 역전사 시약을 사용하여 역전사하여 제조업체의 프로토콜(Promega Corporation, USA)에 따라 cDNA를 얻었다. 실시간 PCR은 TaqMan 프로브를 사용하여 수행되었습니다. 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(GAPDH) (Hs02786624_g1), CD40 (Hs01002915_g1), 그리고 CD40L (Hs00163934_m1) Roche LightCycler 96® 시스템을 사용하여 TaqMan 유전자 발현 분석 프로토콜(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에 표시된 조건에 따라. 상대 표현은 다음을 사용하여 표현 수준으로 정규화되었습니다. GAPDH 내부 대조군으로 2 -ΔΔCq 및 2 -ΔCq 방법을 사용하여 평가되었습니다[30]. 결과는 각각 대조군과 비교한 상대적인 배수 증가 및 발현의 단위 상대(URE)로 표현됩니다. 2 -∆∆Cq 방법은 Livak and Schmittgen[30]이 제안한 대로 계산되었으며 이 방법의 목적은 GAPDH의 경우 참조 유전자에 대한 정규화를 통해 관심 유전자의 발현 측정치를 비교하는 것입니다. 다음 방정식 사용:

여기서 ∆Cq 교정기는 대조군의 평균 ∆Cq를 나타냅니다. 우리는 ACS 환자의 말초 혈액 백혈구에서 상대적인 CD40 mRNA 발현을 결정했습니다(

). 발현 수준의 평가를 위해 코호트 특성은 다음과 같았습니다.

), 성별(여성/남성 비율 ACS: 1.7, CG: 1.6) 및 유사한 위험 인자 존재 및 ACS의 3개 임상 항목(UA 14개, NSTEMI 14개, STEMI 14개) 각각에 대해 동일한 수의 환자가 포함되었습니다. ).

2.5. sCD40, sCD40L 및 IFN-의 검출γ

sCD40, sCD40L 및 IFN-의 수준γ ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법)(Human CD40 Quantikine ELISA Kit, Human CD40 Ligand Quantikine 및 Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit, R&D Systems)를 사용하여 혈장 샘플에서 제조업체의 프로토콜에 따라 측정되었습니다. sCD40, sCD40L 및 IFN-에 대한 분석 감도γ 각각 5.56pg/mL, 10.1pg/mL 및 8pg/mL였습니다.

2.6. 통계 분석

통계 분석은 SPSS 소프트웨어 버전 22(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 달리 표시되지 않는 한 데이터는 중앙값 및 사분위수 범위(IQR)로 표시되었습니다. 맨 휘트니

테스트 및 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 그룹 간의 차이를 비교했습니다. 유전자형 및 대립 유전자 빈도 CD40 그리고 CD40L 유전적 변이체를 ACS 환자와 대조군 사이에서 비교하였다. 오즈비(OR) 및 95% 신뢰 구간(CI)은 적절한 경우 카이-제곱 및 피셔의 정확한 테스트를 사용하여 계산되었습니다. Bonferroni의 수정은 다중 비교에서 통계적 유형 1 오류(pc)를 줄이기 위해 적용되었습니다. Hardy-Weinberg 평형은 유전자형 분포로부터 계산되었고, 다형성 간의 연관 불균형(LD)은 Lewontin's를 사용하여 계산되었습니다.

유전자 마커 사이. 일배체형과 그 빈도는 SHEsis 소프트웨어 플랫폼(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)을 사용하여 추정되었습니다. 다선형 회귀 모델을 사용하여 일반적인 위험 요소(병적 질환, 성별, 약물 섭취 등)와 sCD40, sCD40L 및 mRNA 발현 수준의 연관성을 추정했습니다. 상관 분석은 Spearman의 상관 관계에 의해 확인되었습니다.

3. 결과

3.1. 임상적 특징

320명의 ACS 환자 및 300명의 대조군 대상의 임상 정보를 표 1에 기록하였다. ACS 환자 및 CG 대상의 평균 연령은 각각 62세(±11 표준편차(SD)) 및 55세(±10 SD)였다. ACS 그룹에서는 남성이 여성보다 3.32명 더 많았고 CG에서는 남성/여성 비율이 거의 1/1이었습니다. ACS 환자는 참조 값과 관련하여 CK, CK-MB 및 트로포닌 I을 포함한 높은 수준의 심장 기능 마커를 제시했습니다. 생화학적 매개변수는 표 1에 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 ACS 환자에서 유의하게 상승했습니다. 가장 유병률이 높은 위험 인자 ACS에서 고혈압, 흡연, 제2형 당뇨병이 있었다. 재경색은 49예(15.3%)에서 발견되었다. 약물 섭취에는 항혈소판(아세틸살리실산, 클로피도그렐), 스타틴, 항응고제(헤파린 및 에녹사파린), 항고혈압제(캡토프릴, 에날라프릴, 스피로노락톤, 푸로세미드)가 포함되었습니다.

test ACS: 급성 관상동맥 증후군 Apo AI: 아포지단백 AI Apo B: 아포지단백 B CG: 대조군 CK: 크레아티닌 키나제 CK-MB: 크레아티닌 키나제 근육 및 뇌 CRP: C 반응성 단백질 HDL-c: 고밀도 지단백 IQR: 사분위수 범위 LDL-c: 저밀도 지단백 NSTEMI: 비 ST 분절 상승 심근 경색 NA: 해당 없음 UA: 불안정 협심증 STEMI: ST 분절 상승 심근 경색증(STEMI). 데이터는 달리 표시되지 않는 한 중앙값 및 사분위수 범위(Q25-Q75)로 표시되었습니다. 에 제공된 데이터

3.2. 유전자형 및 대립유전자 분석

유전자형과 대립유전자 빈도 CD40 (rs1883832, rs4810485 및 rs11086998) 및 CD40L (rs3092952 및 rs3092920) 다형성은 표 2–4에 나와 있습니다. Hardy-Weinberg 평형 기대치와 일치하는 유전자형 분포(

성별 간의 대립 유전자 모델에 대한 값.

또는: 승산비. 일배체형은 각각 rs1883832, rs4810485 및 rs11086998로 표시됩니다.

3의 유전자형도 대립형질 분포도 아님 CD40 다형성은 ACS와 대조군을 비교할 때 통계적으로 달랐습니다.

때문에 CD40L X 염색체에 위치하므로 성별로 분석을 수행했습니다(표 3). 우리가 대립 유전자 빈도에 대한 차이를 찾지 못했다는 점은 주목할 만합니다. CD40L 성별 간 변형(rs3092952 A/G:

). 두 다형성의 유전적 분포는 환자와 대조군 사이에서 유사했습니다(데이터는 표시되지 않음) 또는 성별로 분리되었습니다.

3.3. 일배체형 분석 CD40 그리고 CD40L

우리는 CD40/CD40L 유전자와 ACS의 서부 멕시코 코호트에서 발견된 일배체형 사이의 연관성을 분석했습니다. 분석 결과 rs1883832, rs4810485 및 rs11086998이 CD40 연관 불균형( , , )에 있었습니다. 우리는 ACS 환자와 대조군에서 각각 67.1%와 65.5%를 차지하는 하나의 주요 일배체형(CCG)을 발견했습니다. 우리는 또한 보호 일배체형(CTC, OR: 0.22)을 발견했습니다(표 4).

CD40L 다형성은 LD( )에 없었으며, 이는 3092952 및 rs3092920을 별도로 분석해야 함을 나타냅니다.

3.4. CD40 mRNA 발현

ACS 환자는 더 높은 중앙값 발현을 나타냈다. CD40 말초 혈액 백혈구의 mRNA는 대조군과 비교하여(0.82배 이상), 이 비교는 유의하지 않았습니다. 유사하게, ACS 그룹(UA, NSTEMI 및 STEMI)에서 임상 진단에 의한 계층화는 의 mRNA 발현 수준에 차이가 없음을 나타내었다. CD40. 다음으로, 우리는 rs1883832, rs4810485 및 rs11086998 유전자형을 보유하여 결과를 계층화한 ACS 환자 및 CG의 데이터를 분석했습니다. 소수 대립 유전자의 빈도가 낮기 때문에 우리는 우세한 연관 모델을 가정했습니다(rs1883832: C/C 대 C/T+TT, r4810485: G/G 대 G/T+TT, rs11086998: C/C 대 . C/G+G/G) 수준의 차이는 찾지 못했지만 CD40 어느 한 그룹의 유전적 변이체 간의 발현(데이터는 표시되지 않음).

3.5. CD40L mRNA 발현

2 -ΔΔCq 방법에 의한 분석은 CD40L ACS 환자의 mRNA 발현은 CG보다 1.25배 더 높았습니다(그림 1(a)) 이 차이는 2-ΔCq 방법(피=0.035) (그림 1(b)). 임상 개체별로 차이를 찾지 못했습니다(데이터는 표시되지 않음).

). ACS: 급성 관상동맥 증후군 CG: 대조군.

X 염색체의 위치와 다른 연구의 결론을 감안할 때 CD40L mRNA 발현은 성별에 의해 영향을 받을 수 있습니다[20], 우리는 연관성의 증거 없이 두 연구 그룹에서 각 성별에 대해 별도로 분석했습니다. 성별로는 대조군에 비해 여성 또는 남성 환자가 더 많은 발현을 보이는 경향이 있었다(Figure 2(a)). ACS와 성별의 임상적 진단으로 계층화했을 때, UA 여성 환자가 가장 높은 발현(5.12 URE)을 보였으나 통계적으로 유의한 비교는 없었습니다(남성 환자, 여성 환자, )(그림 2(b)).

우리가 탐구했다는 것을 언급하는 것이 중요합니다 CD40L mRNA 두 연구 그룹에서 유전자 변이체(rs3092952 및 rs3092920)에 따른 발현은 우세한 모델에 따라 나타났지만 차이점을 찾지 못했습니다.

3.6. sCD40과 sCD40L과 ACS의 연결

우리는 두 연구 그룹에서 CD40 및 CD40L의 혈장 수준을 평가했습니다. 우리는 ACS 환자가 대조군(843.3 대 492 pg/mL)과 비교하여 유의하게 더 높은 수준의 sCD40( )을 나타낸다는 것을 발견했습니다. 다중선형 회귀 모델은 이 연관성이 clopidogrel( )에 의해 가려질 수 있음을 나타냅니다. ACS 진단은 sCD40과 관련이 없는 것으로 보입니다(UA: 677.1pg/mL NSTEMI: 661.7pg/mL 및 STEMI: 782.4pg/mL, ).

CD40 유전자 변이체 간의 sCD40 수준 간의 차이는 또한 우세한 연관 모델을 가정하여 분석되었습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 C/C 운반체는 rs1883832 C/T+T/T(561 대 475.7 pg/mL)보다 혈장 sCD40 수준이 더 높았습니다. 유사하게, rs4810485의 동형접합 캐리어는 G/T+T/T 캐리어보다 더 높은 농도의 가용성 CD40을 보여주었습니다(562.5 대 489.7 pg/mL, ).

ACS 환자에서 이러한 CD40 유전적 변이의 연관성도 없었고 CD40 rs11086998 연관성 C/C 대 C/G+G/G의 지배적인 모델을 가정하는 두 연구 그룹에서 CD40 혈장 수준을 갖는 다형성(ACS: 846pg/mL 대 725pg/mL, CG: 509pg/mL 대 540pg/mL, )(그림 4).

sCD40L 혈장 수준과 관련하여, 환자는 대조군과 비교하여 더 높은 수준의 sCD40L을 나타내지만, 이 비교는 통계적 유의성에 도달하지 못했습니다(1080 대 868.9 pg/mL, ). ACS 진단 및 성별로 계층화된 sCD40L에 따르면, STEMI를 가진 여성 환자는 UA 여성 환자에 비해 더 높은 수준을 가졌다(1489.5 vs. 533.8 pg/mL, ). UA 남성 환자는 UA 여성 환자에 비해 더 높은 수준의 sCD40L을 나타냈다(1714.3 대 533.8 pg/mL, 그림 5). 풀링된 경우 sCD40L의 수준은 ACS 진단에 의해 유사했습니다( , 데이터는 표시되지 않음).

약물은 다중회귀 모델에 도입되었을 때 ACS 그룹에서 혈장 sCD40L에 유의한 영향을 미치지 않았습니다.

: 0.003, ) 즉, sCD40L의 ACS 환자 간의 차이는 약물에 의해 유발되지 않습니다.

우리는 유전자 변이 사이의 연관성을 분석했습니다. CD40L 그리고 연관성의 증거가 없는 두 연구 그룹에서 sCD40L의 혈장 수준.

마지막으로, 우리는 sCD40L과 IFN-사이에 양의 선형 상관관계를 관찰했습니다.γ ACS 환자( , )(그림 6).

4. 토론

CD40 및 CD40L은 세포 활성화 및 전염증성 사이토카인 생성을 포함하는 중요한 기능을 가지고 있습니다. 이는 동맥경화 과정을 가속화할 수 있는 염증을 촉진하고 심혈관 질환 발병에 기능적 역할을 합니다[8]. 따라서 유전적 변이체는 심혈관 질환 위험 증가와의 관계에 대해 관심을 가져왔습니다[14, 15].

SNP는 CD40 rs1883832 유전자는 주요 C 대립유전자가 있을 때 ACS와 관련이 있으며 부 T 대립유전자가 있는 경우 sCD40 수준 감소 및 심혈관 질환 위험과 관련이 있습니다[31, 32]. 서부 멕시코 코호트에서는 이것이 류마티스 관절염(RA)의 유전적 위험 인자로 확인되지 않았습니다[25]. 이 다형성은 CD40의 감소된 mRNA 발현과 관련이 있습니다[21, 22] rs1883832는 rs4810485와 함께 높은 LD에서 발견되었으며, 후자는 대만 인구에서 관상동맥 병변 형성과 유의하게 관련되어 있습니다[33]. 이들 SNP의 영역 5 UTR 및 인트론 1에 각각 위치하는 것을 감안할 때, 이들은 CD40 프로모터 내에 존재하고 mRNA의 수준에 영향을 미치는 rs6074022와 거의 완전한 LD( )에 있기 때문에 mRNA 발현의 변화와 연관되었습니다. ]. 그렇지 않으면, 우리가 아는 한, rs11086998은 심혈관 질환의 유전적 위험 인자와 관련이 없지만 전염증성 사이토카인인 TNF의 수준 조절과 ​​관련이 있는 것으로 알려져 있습니다.α 및 IL-6은 CD40의 신호 전달 경로와 관련된 세포내 도메인 단백질을 인코딩하는 엑손 9에 상주하기 때문입니다[34].

이러한 다형성은 이전에 주로 중국과 유럽 인구에서 심혈관 질환의 유전적 마커로 확인되었습니다: Li et al. 중국 한족 인구에서 160명의 ACS 환자와 92명의 대조군을 연구했습니다[12] Tian et al. 중국 인구에서 248명의 ACS 환자와 206명의 대조군을 분석했습니다[13] Wang et al. 는 관상동맥 죽상경화반 환자 474명과 중국 인구의 대조군 225명[14]과 García-Bermúdez et al.에 대한 분석을 보고했습니다. 심혈관 사건이 있는 류마티스 관절염(RA) 환자 290명과 심혈관 사건이 없는 RA 환자 1285명을 분석했습니다[17]. 그러나 우리 연구에서는 이 연관성을 지지할 수 없습니다. 이것은 집단 간의 유전적 차이로 설명될 수 있다[35]. CD40의 3가지 변이체가 LD에서 발견되었으며 이는 적어도 우리 집단에서 함께 분석해야 함을 의미합니다. 이러한 맥락에서, 우리는 일배체형 블록 rs1883832(C)-rs4810485(T)-rs11086998(C)이 ACS의 위험 감소(OR: 0.22)와 관련이 있으며 서부 멕시코에서 ACS의 보호 인자일 수 있음을 발견했습니다. LD 블록의 다른 근처 SNP가 질병 감수성과 관련이 있다는 것을 배제할 수는 없지만 [21].

질병에서 X 염색체의 유전적 변이 분석은 관심 분야입니다. 위와 같은 맥락에서, CD40L, 우리는 5 UTR(rs3092952)과 3 UTR(rs3092920)에 위치한 2개의 SNP를 평가했으며, 이들은 서로 다른 일배체형 블록에 위치하고 약한 LD를 가지고 있습니다[36]. rs3092952는 혈장 샘플에서 sCD40L의 수준을 조절함으로써 기능적 변형으로 설명되었습니다. rs3092920은 RA 환자 및 심근경색증의 심혈관 질환의 유전적 마커로 연구되었지만 일부 연구에서는 이러한 연관성을 찾지 못했습니다[15, 17]. 이는 우리의 결과와 일치합니다. NS CD40L ACS의 유전자와 위험.

그럼에도 불구하고 다른 요인들이 ACS의 위험을 증가시키고 부작용에 영향을 미칠 수 있습니다[5] 우리의 결과는 급성 관상동맥 사건에서 이러한 다형성의 중요한 역할을 보여주지 않습니다. 그러나 이러한 유전적 변이와 ACS의 영향을 뒷받침하는 세포 및 분자 메커니즘은 CD40 및 CD40L의 유전자 및 단백질 발현의 변화에 ​​의해 잠재적으로 매개될 수 있습니다.

분석된 다른 연구 CD40/CD40L 말초혈액 단핵세포와 qRT-PCR을 분리한 후 관상동맥질환(CHD)에서 mRNA 발현 수준을 측정한 결과, 대조군에 비해 CHD군에서 두 유전자의 발현 수준이 유의하게 증가한 것으로 나타났다[24].

우리는 사이의 차이점을 찾지 못했습니다 CD40 ACS 환자 및 대조군의 총 말초 혈액 백혈구의 mRNA 수준. 이는 말초 혈액에서 CD40의 주요 공급원이 B 세포라는 사실 때문일 수 있습니다[21]. Fieldet al. 전혈에서 측정된 유전자형과 CD40 mRNA 발현 사이의 연관성을 찾지 못했지만, C/C rs1883832 유전자형은 B 세포에서 더 높은 CD40 발현과 관련이 있었습니다[21]. 우리는 CD40 mRNA 유전자 발현에서 이러한 유전적 변이체의 기능을 이해하기 위해 이러한 하위 집단을 분석하는 추가 연구가 수행되어야 한다고 제안합니다.

유전적 다형성과 CD40 발현 사이의 연관성 결여는 Jacobson et al.에 의해 보고된 것과 일치합니다. [22], 그들은 rs4810485에 대한 높은 연관 불균형에 있는 rs1883832 유전적 변이를 제안하기 때문에(

), 전사가 아닌 번역 수준에서 작용하여 mRNA 수준에 대한 유전자형 영향이 없는 상태에서 번역 효율의 조절을 통해 질병의 병인에서 기능적 다형성으로 그 효과를 발휘합니다. 같은 계통에서 rs4810485 SNP는 CD14+단핵구 및 CD19+B 세포의 CD40 단백질 발현과 관련이 있었습니다. 다른 연구에서는 rs1883832 및 rs4810485 다형성의 부 대립유전자를 보유하는 피험자에서 sCD40 수준이 증가했다고 보고했습니다[25, 32].

우리는 대조군과 비교하여 급성 관상동맥 환자의 혈장 샘플에서 sCD40의 수준 증가를 관찰했습니다( ). 염증 과정 동안 sCD40은 면역 반응을 억제하기 때문에 면역 조절로 설명되는 생물학적 특성을 가지고 있습니다[37]. 전염증성 전신 반응은 이러한 의미에서 심혈관 결과에 기여하는 이 증후군의 병태생리학에서 중요한 역할을 하며, sCD40은 CD40 활성화에 대한 길항 효과를 통해 CD40-CD40L 시스템이 조절될 수 있는 잠재적 요소를 나타냅니다[38].

ACS의 임상적 개체는 결과가 다른 경우에도 혈장 sCD40 수준에서 차이가 없었으며( ), sCD40은 ACS의 여러 발달 단계에 관여합니다[39]. 우리는 클로피도그렐이 ACS에서 CD40 혈장 수준의 총 변동성의 25%를 설명하고 혈중 지질 농도의 증가가 sCD40 수준의 유의한 예측 인자로 나타났기 때문에 우리의 결과를 주의 깊게 받아들일 필요가 있음을 강조합니다(선형 회귀로 표시됨). ACS 환자에게 사용되는 약리학적 요법에 의한 감소된 콜레스테롤 합성은 sCD40의 증가된 수준과 관련이 있습니다[40]. 클로피도그렐은 이들 환자의 치료 계획에서 초석을 이루는 약물 중 하나라는 점을 명확히 하는 것이 중요하므로 향후 연구에서 고려해야 할 중재 변수입니다. 불행히도, 클로피도그렐로 치료하지 않는 환자의 수는 확고한 비교를 방해하는 매우 적습니다.

약리학적 치료는 CD40의 혈장 수준에 영향을 미칠 수 있으며[41], 이는 다형성 간의 연관성 부족을 설명하는 상황입니다 CD40 ACS 환자의 혈장 샘플의 위치 및 가용성 수준. 이에 찬성하는 주장은 rs1883832 및 rs4810485의 주요 대립 유전자의 동형 접합체가 sCD40 수준이 상당히 높다는 것을 발견한 대조군의 결과입니다(그림 3).

ACS 환자는 CD40L 대조군과 비교한 mRNA. 중요한 것은, 높은 수준의 CD40L T 림프구의 mRNA 발현은 급성 관상동맥 사건과 관련이 있습니다[42]. sCD40L 혈장 수준에서 ACS와 CG 사이에 유의미한 차이를 발견하지 못했지만, 우리는 환자의 sCD40L 수준이 더 높았고 sCD40L과 IFN-사이에 양의 선형 상관관계가 있음을 관찰했습니다.γ 따라서(그림 6), 급성 관상동맥 사건 환자는 내피 기능 장애와 전신 염증을 촉진하는 T 세포 반응이 향상되었다고 추측할 수 있습니다[43, 44].

이전 보고서에서는 다음과 같이 결론지었습니다. CD40L mRNA 발현은 성별에 의해 영향을 받을 수 있습니다[20] 또한 CD40L mRNA 수준이 감소하고 sCD40L 농도가 증가하면 ACS의 면역병리학에서 CD40L 기능을 지원하는 더 큰 혈소판 활성을 반영할 수 있습니다[7]. 따라서, 우리는 ACS 환자에서만 더 높은 혈장 sCD40L 농도를 발견했습니다. 임상 개체별로 UA가 있는 여성은 STEMI가 있는 여성보다 농도가 낮았으며 남성에서 반대 효과가 나타났습니다. 주목할만한 점은 ACS의 세 가지 임상 스펙트럼이 종종 동일한 증상을 갖고[45] 과학계에서 진단을 보완하는 바이오마커를 찾아야 한다는 점입니다.

또한 심혈관 허혈성 질환 환자의 4~30%가 "낮은 반응자" 또는 "무반응자"로 분류된 항혈소판 요법에 대한 반응이 좋지 않은 것으로 보고되었습니다[46], 구체적으로 남성 환자의 경우 2.9배 더 높은 것으로 보고되었습니다. 여성보다 항혈소판 요법에 무반응이고[47] 관상동맥심장질환으로 인한 사망, 주요 비치명적 관상동맥질환(심근경색, 불안정형 협심증으로 인한 입원, 소생심장정지) 또는 치명적인 허혈성으로 인한 심혈관계 재발과 관련이 있다. 뇌졸중[48].

항혈소판제의 사용에도 불구하고 혈소판 반응성이 지속됨에 따라 ACS 후 심혈관계 사건의 재발 위험이 높은 대상을 식별할 수 있는 전략에 대한 관심이 높아졌습니다. 이와 관련하여 CD40L의 혈장 농도는 심근 손상의 표지자로서 연관되어 왔으며 ACS 환자의 사망 및 재발성 MI를 독립적으로 예측합니다[10]. 따라서 ACS에서 사용하는 항혈소판 요법을 성별과 위험인자에 따라 조절하면 부작용의 위험을 줄이고 환자의 예후를 개선할 수 있다.

그럼에도 불구하고, 우리는 우리의 결과가 층화 분석에서 표본 크기 효과로 인해 신중하게 해석되고 복제되어야 한다는 점을 염두에 둡니다.

마지막으로, CD40L의 두 유전적 변이체의 연관성 분석은 mRNA 발현 및 단백질 농도와 상관관계가 없습니다. CD40 및 CD40L 발현에서 이러한 다형성의 기능적 효과를 이해하기 위해 유전자 발현을 변경할 수 있는 수정 가능한 요인을 고려한 추가 연구가 필요합니다.

5. 결론

개별적으로 분석한 유전적 변이체 CD40 그리고 CD40L 이 멕시코 코호트에서 ACS의 감수성 마커가 아닙니다. 그러나 CD40의 CTC 일배체형은 ACS 위험 감소와 관련이 있었습니다.

ACS 환자는 더 높은 CD40L 대조군보다 mRNA 상대 발현.

CD40의 가용성 수준은 ACS 환자에서 상승했지만 클로피도그렐 요법의 영향을 받았습니다.

대조군에서 rs1883232 C/C 및 rs4810485 G/G 유전자형 운반체는 더 높은 가용성 수준의 CD40을 보여주었습니다.

STEMI가 있는 여성 환자는 UA에 비해 sCD40L 수치가 더 높았습니다. 그렇지 않으면, UA 남성 환자는 UA에 비해 더 높은 수준의 sCD40L을 나타냈다. 약물은 혈장 sCD40L에 유의한 영향을 미치지 않았습니다.

이러한 결과는 항혈소판 및 항염증 요법을 받는 경우에도 ACS 환자의 염증 과정 및 혈소판 활성화를 반영할 수 있습니다. ACS의 병인에서 면역학적 과정에서 CD40-CD40L 시스템의 중요한 역할로 인해 CD40 및 CD40L의 가용성 수준이 ACS 후 재발하는 심혈관 사건의 임상적으로 유용한 마커가 될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 종단적 연구가 필요합니다.

데이터 가용성

이 연구의 결과를 뒷받침하는 데 사용된 데이터가 기사에 포함되어 있습니다.

이해 상충

저자는 이 기사의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

저자는 이 연구에 모든 사람의 참여에 크게 감사합니다. 이 작업은 과달라하라 대학교에서 YV에 수여한 PROSNI 2017 및 PROSNI 2018에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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저작권

Copyright © 2019 D. E. Martínez-Fernández et al. 이것은 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이선스에 따라 배포되는 오픈 액세스 기사로, 원본 저작물이 적절하게 인용된 경우 모든 매체에서 무제한 사용, 배포 및 복제를 허용합니다.


행동 양식

참가자들

참가자는 18세에서 77세 사이의 백인 남성 105명(미디엄 = 28.51, SD = 13.82) 전단, 신문 및 온라인 광고를 통해 Stony Brook University 및 주변 커뮤니티에서 모집되었습니다. 참가자는 자격을 위해 전화로 심사되었습니다. 모든 참가자는 심리적 장애의 사전 진단이나 관련 약물 사용을 보고하지 않았습니다. 기타 제외 기준에 대한 자세한 내용은 추가 파일 1에 나와 있습니다. 초기 생애 및 만성 스트레스, 5-HTTLPR 유전자형 및 DNA 메틸화(아래 참조)의 측정은 이 모든 참가자로부터 제공되었습니다. 하위 집합(N = 71) TSST(미디엄 나이 = 29.79, SD나이 = 15.24). 최근 우울 증상, 유전자 발현 및 TSST에 대한 코티솔 반응에 대한 추가 데이터는 이 참가자들로부터 입수할 수 있었습니다. 연구는 Stony Brook University Institutional Review Board의 승인을 받았으며 참가자는 실험 세션에 참여하기 전에 서면 동의를 제공했습니다. 각 세션이 끝날 때 참가자는 구두 및 서면 브리핑을 받았고 대중 교통 비용에 대한 상환과 함께 $100를 보상 받았습니다.

실험 세션

일교차의 영향으로 생물학적 측정을 표준화하기 위해 모든 실험 세션은 12:00에서 14:00 사이에 시작되었습니다. 참가자들은 도착하기 최소 1시간 전에 식사, 음주(물 제외) 및 운동을 삼가도록 지시받았습니다. 약 4시간이 소요된 전체 절차에는 동의, 설문지 작성, TSST, 생애 사건 인터뷰 및 보고가 포함되었습니다. 참가자들은 또한 유전형 및 DNA 메틸화 분석을 위한 혈액 샘플을 제공했는데, 하나는 세션 시작 시(TSST 전 45분) 및 종료 시(TSST 후 105분)였습니다. 세션 전체에 걸쳐 9개의 다른 시점에서 수집된 타액 샘플을 사용하여 코티솔 수준을 평가했습니다.

초기 생활 스트레스 평가

유아기의 스트레스는 아동기 외상 설문지(Childhood Trauma Questionnaire, CTQ)[47]로 평가되었는데, 이는 신체적, 성적, 정서적 학대와 신체적, 정서적 방치의 하위 척도로 구성된 28개 항목으로 구성된 아동 학대의 일반적으로 사용되는 척도입니다. 각 하위척도는 5개 항목과 학대 거부를 통제하는 3개 항목으로 구성됩니다. 항목은 5점 Likert 척도(1~5)로 평가되며 점수가 높을수록 학대 수준이 높음을 나타냅니다. CTQ 총점을 계산하기 위해 점수가 합산되며 범위는 25~125입니다.

만성 스트레스 및 최근 우울 증상 평가

지난 3개월 동안의 만성 스트레스는 Trier Inventory of Chronic Stress(TICS)로 평가되었습니다[48,49]. TICS는 '나는 할 일을 다 할 수 없을까 걱정된다', '할 일이 너무 많다'와 같은 만성 스트레스와 관련된 행동의 빈도에 대한 12문항 자가보고식 척도이다. 0(전혀 그렇지 않음)에서 4(매우 자주)로 등급이 매겨지고 항목을 합산하여 총 만성 스트레스 점수를 계산하며 범위는 0에서 48입니다.

TSST를 수행하는 참가자는 최근 우울 증상을 평가하기 위한 Beck Depression Inventory II BDI-II[50]도 완료했습니다. BDI-II는 슬픔, 절망, 자책과 같은 최근의 우울 증상(지난 2주)의 21개 항목의 자가 보고 척도이다. 각 항목은 0에서 3까지의 척도로 평가되며 점수 범위는 0에서 63까지입니다. 점수가 높을수록 우울 증상이 높음을 나타냅니다.

코티솔 수치 및 스트레스 반응성 평가

TSST에 대한 반응으로 코티솔 수치를 평가하기 위해 참가자의 타액 샘플을 타액(Sarstedt, Rommelsdorf, Germany)을 사용하여 수집했습니다. 첫 번째 채혈 후 45분과 TSST 시작 직전에 참가자들은 기준선 타액 샘플을 제공한 다음 TSST실로 데려갔습니다. TSST는 Kirschbaum에 설명된 대로 수행되었습니다. . [22]. 간단히 말해서, 과제는 준비 단계(5분)에 이어 참가자가 꿈의 직업에 가장 적합한 후보자인 이유에 대한 공개 연설(5분)과 역산 과제(5분)로 구성되었습니다. . 이 작업은 구두 또는 비언어적 피드백을 제공하지 않는 2인 위원회 앞에서 진행되었습니다. TSST 동안 주제에 지시를 내린 활성 위원은 항상 이성(여성)이었고, 비활동 위원은 참가자와 항상 같은 성별(남성)이었다. TSST 후, 참가자들은 초기 시험실로 돌아와 TSST 직후에 두 번째 타액 샘플을 제공하고 스트레스, 위협, 스트레스, 위협, 스트레스, 위협 등 TSST에 대한 경험을 평가하는 8개 항목의 Visual Analog Scale(VAS)을 작성했습니다. 또는 도전. 추가 타액 샘플은 TSST 후 10, 20, 30, 45, 60, 90 및 105분에 수집되었습니다. 타액 샘플은 코르티솔 농도 분석을 위해 보스턴의 Brandeis University로 배송될 때까지 세션 직후 -20°C에 보관되었습니다. 0.16ng/ml의 감도(IBL International, Toronto, ON, Canada)로 시판되는 화학발광 면역분석(RE62019)을 사용하여 각 샘플을 이중으로 분석했습니다. 분석 간 및 분석 내 변동 계수는 각각 7% 및 4% 미만이었습니다. 코티솔 피크 증가는 TSST 후 피크 코티솔 수준과 이전 연구에서 사용된 기준선 사이의 차이로 평가되었습니다[23,24]. 모든 참가자에 대해 TSST 후 가장 높은 응답은 TSST 후 10-20분 이내에 관찰되었습니다. 우리는 곡선 아래 면적보다는 피크 반응을 코티솔 반응성의 척도로 사용했습니다. 왜냐하면 전자는 잠재적으로 유전자 발현의 변화와 더 밀접하게 연관되어 있는 반면 후자는 전체 호르몬 생산량과 더 밀접하게 연관될 수 있기 때문입니다[51].

혈액 샘플 처리

균일한 세포 그룹으로 시작하기 위해 Leucosep® 튜브(Greiner Bio-One Inc., Monroe, NC, USA)와 Ficoll-Paque를 사용하여 채혈 직후 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리했습니다. (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) 제조자의 프로토콜에 따른 분리 매질. 분리된 PBMC 펠릿은 후속 DNA 및 RNA 추출 절차를 위해 -80°C에서 보관되었습니다.

PBMC 펠릿에서 DNA 및 RNA 추출은 제조업체의 지침에 따라 AllPrep DNA/RNA/Protein Mini 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)에 의해 수행되었습니다. DNA 및 RNA의 양과 품질은 NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)을 통해 평가되었으며, DNA 샘플은 -20°C에서, RNA 샘플은 -80°C에서 보관되었습니다.

5-HTTLPR 및 rs25531의 유전자형 분석

5-HTTLPR 유전자형은 이전 연구에서 사용된 프라이머를 사용하여 67.5°C의 annealing 온도에서 25ng DNA의 PCR 증폭을 통해 결정되었습니다[5]. 100%인 테스트-재테스트 신뢰도를 설정하기 위해 초기 결과를 모르는 기술자가 24개 샘플의 무작위 하위 집합을 두 번 처리했습니다. 유전자형의 결과로 개체는 S/S, S/L 또는 L/L로 유전자형이 지정되었습니다.

A/G SNP(rs25531) 유전자형 분석을 위해 5-HTTLPR PCR 산물 6㎕를 5단위로 분해했습니다. 하파II 제한 효소(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 37°C에서 3시간 결과적으로 개인은 S/S, S/L로 유전자형이 지정되었습니다.NS, S/LNS, 패NS/엘NS, 패NS/엘NS, 그리고 나NS/엘NS. L의 그 표현을 감안할 때NS 대립유전자는 S 대립유전자[52], 시험유전자(S, LNS, 패NS) 분류 체계 그룹화 S/LNS 그리고 나NS/엘NS 개인은 'S/S' 및 LNS/엘NS 개인을 'L/S'로 지정합니다. 유전자형 분포는 이대립 및 삼대립 분류 체계에 따라 Hardy-Weinberg 평형에 있었습니다.NS >.05).

DNA 메틸화 분석

DNA 메틸화 분석을 위해 기준선에서 각 참가자의 500ng DNA를 제조업체의 지침에 따라 Epitect Bisulfite 키트(Qiagen, CA)를 사용하여 바이설파이트 처리하고 메틸화 분석에 사용할 때까지 -20°C에서 보관했습니다. 또한 모든 메틸화 분석에서 500ng의 비메틸화(0%) 및 완전 메틸화(100%) 인간 DNA 샘플(Zymo Research, Irvine, CA, USA)을 참가자의 샘플과 함께 중아황산염으로 처리하여 중아황산염 전환으로 활용했습니다. 통제 수단.

전체 DNA 메틸화

긴 산재 핵 원소-1의 메틸화(라인-1)는 ELS와의 연관성 조사([39]와 유사) 및 유전자 특이적 메틸화([31]과 유사)를 조사할 때 전체 메틸화를 통제하기 위해 전체 메틸화의 척도로 사용되었습니다. 라인-1 Stony Brook University Genomics Core Facility의 PyroMark Q96 MD 시스템에서 제조업체의 프로토콜에 따라 키트와 함께 제공된 상용 프라이머와 함께 PyroMark Q96 CpG LINE-1 키트(Qiagen, CA)를 사용하여 메틸화를 이중으로 정량화했습니다. 절차에 대한 자세한 내용은 추가 파일 1에 나와 있습니다.

SLC6A4 CpG 섬 DNA 메틸화

CpG 섬 상류의 메틸화 SLC6A4 Sequnom Epityper MassArray 시스템(San Diego, CA, USA)에 의해 정량화되었습니다. 두 세트의 프라이머는 Philibert와 유사한 두 개의 앰플리콘에서 CpG 섬의 79개 CpG 사이트를 증폭하도록 설계되었습니다. . Epityper 소프트웨어(Sequenom, CA)를 사용하여 [40]. 이 기술로 메틸화 CpG 단위 하나 이상의 인접한 CpG 사이트로 구성될 수 있는 분석됩니다. 총 37개의 CpG 단위가 79개의 CpG 사이트로 구성된 2개의 앰플리콘으로 처리되었습니다. 모든 샘플은 삼중으로 실행되었습니다. 전처리 후 앰플리콘 1과 2에 있는 26개 CpG 단위의 메틸화 데이터가 모든 분석에 포함되었습니다(그림 1). 절차, 프라이머 서열 및 데이터 분석에 대한 자세한 내용은 추가 파일 1에 나와 있습니다.

SLC6A4 DNA 메틸화 분석을 위한 CpG 섬 앰플리콘. 분석된 CpG 단위는 1에서 26까지 번호가 매겨져 있습니다. 번역되지 않은 엑손은 CpG 단위 12에서 15에 걸쳐 있으며 5-HTTLPR은 CpG 섬의 상류에 있습니다. 별표는 요인 1, 2, 3(F1 ~ F3)에 속하는 CpG 단위를 나타냅니다. F1 요인 적재 범위는 .35에서 .83, F2 요인 적재 범위는 .37에서 .76, F3 요인 적재 범위는 .73에서 .87입니다.

유전자 발현 분석

각 참가자에 대해 2개의 RNA 샘플이 유전자 발현 분석에 사용되었습니다. 하나는 TSST(기준선) 전 45분, 다른 하나는 TSST(반응) 후 105분입니다. 유전자 발현을 정량화하기 전에 Agilent 2100 BioAnalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA 샘플의 무결성을 평가했습니다. 샘플의 RIN(RNA Integrity Number)이 높았습니다(미디엄 = 7.94, SD = 1.32), TSST 전후의 샘플의 RIN은 크게 다르지 않았습니다(NS = .853). 이후, 제조사의 프로토콜(Qiagen, CA)에 따라 QuantiTect Reverse Transcription Kit를 사용하여 각 시점의 RNA 1μg을 cDNA로 변환했습니다. 그런 다음 cDNA 샘플을 5배 희석하고 희석된 cDNA 1μl를 Qiagen SYBR Green PCR + UNG 키트(Qiagen, CA) 및 유전자를 사용하여 정량적 PCR(qPCR)에 의한 후보 유전자의 유전자 발현 분석에 사용했습니다. - Roche Universal Probe Library 웹사이트(http://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/ezhome.html)에서 설계된 특정 프라이머. qPCR 반응은 60°C의 어닐링 온도에서 Roche 480 LightCycler 시스템(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)에서 3회 수행되었습니다.

PBMC에서 최고의 참조 유전자를 확인하기 위해 기준선 및 반응 시점에서 얻은 5명의 개인 RNA 샘플에서 6개의 후보 참조 유전자의 발현을 분석했습니다. 이 방법은 식별 HPRT1 (하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1) 및 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 PBMC에서 최고의 참조 유전자로 사용합니다. 씨NS qPCR에 의해 얻은 값은 델타-델타-C를 사용하여 기준선과 반응 샘플 사이의 유전자 발현 변화를 평가하는 데 사용되었습니다.NS 방법[53]. 참조 유전자에 대해 정규화된 각 샘플에 대한 유전자 발현의 변화는 배수 변화 값으로 표시되며, 이는 SLC6A4 그리고 NR3C1 기준선에 상대적인 TSST 이후. qPCR 분석 및 프라이머 서열에 대한 자세한 내용은 추가 파일 1에 나와 있습니다.

통계 분석

모든 통계 분석은 SPSS for Windows 버전 16.0(Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었으며 유의 수준은 다음으로 설정되었습니다. α = .05. TSST가 코르티솔 반응을 성공적으로 유발했는지 여부를 평가하기 위해 실험 전반에 걸쳐 수집된 9개의 타액 샘플에 대해 반복 측정 ANOVA를 사용했습니다. 모든 분석에 앞서, 코티솔 데이터는 Kolmogorov-Smirnov 테스트에 의해 정규 분포에 대해 테스트되었습니다. 여러 시점에서 샘플의 정규성 위반으로 인해(NS < .05), 로그 변환이 모든 코티솔 데이터에 적용되었습니다. 구형도 위반으로 인해 (NS < .05), 온실-가이저 보정이 적용되었습니다.

관심변수 간의 상관관계를 조사하기 위해 Pearson의 상관계수(NS)는 정규 분포 변수에 사용되었으며 Spearman의 rho 계수(RS)는 비정규 분포 변수에 사용되었습니다. 연령 및 일부 변수의 영향을 통제하기 위해 필요에 따라 부분 상관을 사용했습니다. 라인-1 메틸화.

CpG 섬 전체의 메틸화 패턴을 이해하고 조사되는 변수의 수를 줄이기 위해 섬 전체의 26개 CpG 단위를 포괄하는 요인 분석이 Olsson과 유사하게 수행되었습니다. . [41]. Kaiser-Meyer-Olkin 샘플링 적절성 측정(.834) 및 Bartlett의 구형도 테스트(NS < .001)은 요인 분석이 데이터 세트에 적합하다고 제안했습니다. 분석 결과 분산의 75%를 설명하는 5가지 요인이 나타났다. 그러나 세 개 미만의 변수가 마지막 두 요인에 로드되었으므로 처음 세 가지 요인인 요인 1(F1), 요인 2(F2) 및 요인 3(F3)만 고려되었습니다. F1, F2 및 F3에 의해 설명된 분산의 백분율은 각각 37, 15 및 12였습니다. 이러한 요인에 대한 하중은 F1이 CpG 섬의 시작부터 엑손의 시작까지 주로 CpG 단위를 포함하는 반면 F2는 섬의 끝을 향한 것들을 포함하고 F3은 섬의 끝쪽으로 더 짧은 영역을 포함하는 것과 같았습니다( 그림 1).


소개

단백질 품질 관리(PQC)는 진핵 세포에서 단백질 항상성의 유지에 중요합니다. 세포질에서 잘못 접힌 단백질 전용 경로를 포함하여 여러 세포 구획에 특이적인 PQC 경로가 확인되었습니다(Eisele and Wolf, 2008 Heck ., 2010 닐레고다 ., 2010), 핵(가드너 ., 2005), 원형질막(Zhao ., 2013) 및 소포체 막(Vembar and Brodsky, 2008). 실제로 리보솜에서 나올 때 결함 있는 번역 산물을 공격하는 PQC 경로도 존재합니다(Bengtson and Joazeiro, 2010 Brandman ., 2012 드프누이에르 ., 2013 베르마 ., 2013). 그러나 단백질 구조와 위치의 엄청난 다양성을 감안할 때 PQC에 대한 우리의 이해는 아직 완전하지 않은 것 같습니다.

단백질 생합성이 직면한 과제의 경관을 조사하면서 우리는 PQC의 기계론적 조사를 위한 흥미로운 표적으로 리보솜을 주목했습니다. 효모에서 리보솜 형성은 35S 및 5S rRNA의 전사, 35S 1차 rRNA의 처리, 79개의 다른 리보솜 단백질의 번역 및 핵 도입, 핵소체에서 처리된 rRNA 및 리보솜 단백질의 조립을 필요로 하는 복잡한 과정입니다(Kressler ., 2010). 리보솜 조립은 복잡할 뿐만 아니라 생물학적 능력의 인상적인 부분을 독점하기도 합니다. 빠르게 성장하는 효모 세포에서 총 전사의 60%가 rRNA에 사용되고 RNA 중합효소 II 전사의 50%와 mRNA 스플라이싱의 90%가 리보솜 단백질에 사용됩니다(Warner, 1999). 이 엄청난 흐름은 사용할 수 없는 구성 요소의 형성 및 축적을 최소화하기 위해 효율적인 PQC 메커니즘에 프리미엄을 부여합니다. 그러나 조립된 리보솜에 대한 항상성 조절 메커니즘에 대한 우리의 이해가 빠르게 확장되었음에도 불구하고 리보솜 조립을 모니터링하고 세포가 조립 과정의 오류 또는 불균형에 대처하도록 돕는 항상성 메커니즘은 제대로 이해되지 않고 있습니다.

리보솜 조립에 대한 간단하지만 심오한 질문 중 하나는 세포가 모든 단백질의 화학량론적 생산을 보장하기 위해 리보솜 유전자 발현을 제어하는 ​​방법에 관한 것입니다. 여러 연구에 따르면 일부 리보솜 단백질이 과도하게 만들어질 수 있으며 세포는 조립되지 않은 단백질을 분해하여 이러한 단백질의 적절한 수준을 유지합니다. 그러한 메커니즘의 존재는 몇 가지 증거에 의해 뒷받침됩니다. 예를 들어, 새로 합성된 리보솜 단백질은 rRNA 처리가 손상되면 빠르게 분해됩니다(Gorenstein and Warner, 1977 Warner, 1977). 또한, 리보솜 단백질 유전자의 여분의 사본을 보유하고 있는 세포에서 극도로 짧은 펄스 표지(~45초)가 수행되지 않는 한 해당 단백질의 과잉 생산을 감지할 수 없습니다(Abovich ., 1985). 이러한 관찰에 기초하여, 일부 리보솜 단백질은 일반적으로 세포가 필요로 하는 것 이상의 수준에서 합성되지만 초과량은 검출가능하게 축적되지 않도록 빠르게 분해된다는 것이 제안되었습니다. 그러나 과잉 생산된 리보솜 단백질이 분해되는 메커니즘은 탐구되지 않았다. 이 가설은 두 가지 더 최근의 연구에 의해 뒷받침됩니다. 세포 배양에서 아미노산을 사용한 펄스 안정 동위원소 표지 실험은 새로 합성된 인간 리보솜 단백질이 rRNA와 조립하기 위해 핵소체로 빠르게 유입되고 과잉은 프로테아솜에 의해 분해된다는 것을 보여줍니다. ., 2007). 또한 효모에서 여분의 염색체를 획득하면 여분의 염색체에 있는 대부분의 유전자에 대한 mRNA와 단백질 수준이 비례적으로 증가하는 반면(Torres ., 2007, 2010), 대부분의 리보솜 단백질은 복제 수에 비례하여 증가하지 않지만 미확인 기전에 의해 번역 후 감쇠됩니다(Dephoure ., 2014). 여러 메커니즘이 잠재적으로 과잉 리보솜 단백질의 분해를 중재할 수 있습니다. 인간 연구는 프로테아솜과 관련이 있지만 Lam이 관찰한 리보솜 소단위의 분해 여부는 결정되지 않았습니다. . (2007) 어셈블리 상태와 관련이 있거나 유비퀴틴화에 의존합니다. 효모 세포에서 두 가지 다른 메커니즘이 리보솜 대사와 연결되었습니다. 아미노산이 결핍된 효모 세포는 리보파지(ribophagy)라고 하는 과정에서 자가포식소체의 기존 성숙한 리보솜을 캡슐화합니다(Kraft ., 2008). 또한 열 충격을 받는 효모 세포는 40S 소단위를 포함하는 스트레스 과립을 형성하며, 이들은 자가포식에 의해 제거됩니다(Grousl ., 2009).

이 연구에서 우리는 다른 리보솜 소단위보다 화학량론적으로 과잉으로 만들어진 리보솜 단백질의 운명을 조사합니다. 우리는 과잉 생산된 리보솜 단백질이 리보솜으로 조립되지 않고 대신 빠르게 유비퀴틴화되고 프로테아솜 의존적 방식으로 핵에서 분해된다는 것을 보여줍니다.


저자는 GS와 그의 가족의 적극적이고 친근한 협력에 대해, 기술적인 도움을 위해 O. Sthandier와 M. Marchioni를, 과학적 조언을 위해 D. Cacchiarelli를, 원고를 읽기 위해 V. Silenzi를, 생물학을 위한 Telethon Network Genetic Biobanks(GTB12001F)를 인정합니다. 피규어 디자인을 위한 샘플 및 SMART by Servier(https://smart.servier.com/). 이 작업은 ERC-2019-SyG(855923-ASTRA), Telethon(GGP16213), Parent Project Italia, AIRC(IG 2019 Id. 23053) 및 PRIN 2017(2017P352Z4)에서 I.B까지의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 스페인 경제산업경쟁력부(MEIC)(BFU2016-75008-P)에서 L.D.C.로및 Sapienza Research Calls(RM118164363B1D21)에서 J.M.

작업의 개념화 및 디자인은 JM, LDC 및 IB에서 수행했습니다. JM, ML, FC, AR, VDC, DM, TS 및 LP로 실험을 수행하고 분석했습니다. 생물정보학 데이터 분석은 EB, AS 및 AC에서 수행했습니다. 원고의 원본 초안은 JM과 IB가 작성했습니다. 초안은 모든 저자가 검토하고 편집했습니다.



코멘트:

  1. Dugrel

    이제는 표현할 수없는 것은 유감입니다. 매우 점령되었습니다. 나는 석방 될 것이다 - 나는 반드시 의견을 표현할 것이다.

  2. Orham

    이 주제에 대해 이야기하고 싶습니다.



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