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3.2: 자연 및 비자연 그룹 - 생물학

3.2: 자연 및 비자연 그룹 - 생물학



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종을 자연 그룹으로 볼 수 있지만 더 높은 수준의 분류는 생물학적으로 중요한 정보를 반영할 수도 있고 반영하지 않을 수도 있다는 점을 반복할 가치가 있습니다. 우리는 같은 책을 읽고 있고 같은 유기체를 연구하고 있다고 확신할 수 있습니다!

속 및 기타 상위 수준 분류는 일반적으로 하나 이상의 특성을 다른 것보다 더 중요한 것으로 간주하는 결정을 기반으로 합니다. 특성에 특정 값을 할당하는 것은 임의적으로 보일 수 있습니다. 예를 들어 늑대와 코요테를 포함하는 Canis 속과 여우를 포함하는 Vulpes 속을 고려해 보겠습니다. 이 두 그룹의 구별은 Canis에 비해 Vulpes의 더 작은 크기와 더 평평한 두개골을 기반으로 합니다. 이제 일반 집고양이인 Felis 속과 호랑이, 사자, 재규어, 표범을 포함하는 Panthera 속을 살펴보겠습니다. 이 두 속은 두개골의 특징과 포효 능력이 있는지(Pathera) 또는 없는지(Felix)로 구분됩니다. 그렇다면 우리는 이러한 구별을 어떻게 해야 합니까? 그것들이 별개의 그룹을 정당화하기에 정말 충분합니까, 아니면 Canis와 Vuples(그리고 Felix와 Panthera)가 함께 병합되어야 합니까? 이 그룹 간의 차이가 생물학적으로 의미가 있습니까? 대답은 종종 고차 분류의 기초가 생물학적으로 의미가 없다는 것입니다. 이러한 생물학적 중요성의 일반적인 결여는 유기체의 고차 분류가 변경될 수 있다는 사실에 의해 강조됩니다. 속은 가족이 될 수 있고(그 반대의 경우도 마찬가지입니다) 한 종에서 한 속으로 이동할 수 있습니다. 일반적으로 곰으로 알려진 유기체의 유형을 고려하십시오. 곰과 같은 유기체에는 여러 가지 유형이 있으며 Linnaeus의 분류 체계가 인정한 사실입니다. 모든 곰과 같은 유기체를 살펴보면 8가지 유형을 인식합니다.59 우리는 현재 이 네 가지, 즉 불곰(Ursus arctos), 아시아흑곰(Ursus thibetanus), 미국곰(Ursus americanus), 북극곰(Ursus maritimus)이 서로 훨씬 더 유사한 것으로 간주합니다. 다른 유형의 곰보다 다양한 특성이 있습니다. 따라서 우리는 그들을 자신의 속인 Ursus로 분류했습니다. 안경곰(Tremarctos ornatus), 나무늘보곰(Melurus ursinus), 태양곰(Helarctos mayalanus), 자이언트 판다(Ailuropoda melanoleuca)와 같은 다른 유형의 곰과 유사한 유기체를 각각 따로 배치했습니다. 과학자들은 이 종들이 Ursus 속의 구성원들보다 서로 더 다르다고 생각하기 때문입니다. 여기서 문제는 새로운 속을 보증하기 위해 이러한 차이가 얼마나 커야 하는가입니다.

그래서 우리는 어디로 떠나는가? 여기서 진화론과 세포(생명의 연속성) 이론이 합쳐집니다. 우리는 (진화적으로) 더 밀접하게 관련된 두 종이 더 많은 형질을 공유할 것이며 새롭고 생물학적으로 중요한 형질의 발달이 그룹을 다른 그룹과 구별하는 것이라는 가정에 따라 작업합니다. 합리적인 분류 체계의 기초가 되는 특성을 synapomorphies(기술 용어)라고 합니다. 기본적으로 이들은 가계도의 한 가지 또는 다른 가지 지점에 나타나며 한 가지에 있는 유기체가 다른 가지에 있는 유기체와 구별되는 "자연적인" 그룹의 일부가 되도록 해당 가지 지점을 정의하는 역할을 합니다. . 시공간의 왜곡이 만유인력의 법칙이 존재하는 이유를 제공한 것과 마찬가지로 유기체 간의 조상 관계는 유기체가 린네의 계층 구조로 배열될 수 있는 이유를 제공합니다.

따라서 남은 질문은 조상이 수천 년, 수백만 년 또는 수십억 년 전에 살았을 때 조상을 결정하는 방법입니다. 우리는 과거로 돌아갈 수 없기 때문에 살아있는 유기체와 화석화된 유기체에 대한 비교 연구에서 관계를 추론해야 합니다. 여기에서 생물학자인 Willi Hennig가 핵심적인 역할을 했습니다.60 그는 공유되고 경험적으로 측정 가능한 특성을 사용하여 조상 관계를 재구성하기 위한 규칙을 설정하여 각 그룹에는 단일 공통 조상이 있어야 합니다. 나중에 알게 되겠지만 오늘날 현대 연구에서 일반적으로 사용되는 특성 중 하나는 유전자(DNA) 서열과 게놈 조직 데이터입니다. 오늘날의 유기체.


비천연 아미노산이 포함된 파지 디스플레이 시스템

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1. 소개

단백질은 합성 세포 네트워크의 필수 구성 요소입니다. 기능적 인공 세포를 만드는 것을 궁극적인 목표로 하는 세포 경로의 합성은 효과적으로 조절될 수 있는 바람직한 특성을 가진 단백질의 생성으로부터 큰 이점을 얻을 수 있습니다. 숙주 유기체의 내인성 회로와 독립적으로 기능할 수 있는 단백질은 "부분" 설계의 추가 개발이 필요합니다.

유전자 코드를 비천연 아미노산(UAA) 12,14-16에 재할당하는 최근의 발전은 단백질 "부분"의 분자 도구 상자를 확장합니다. 사실, UAA의 도입은 광유도 스위칭, 17 IR 프로브 활성 18 및 산화환원 민감성 19 단백질과 같은 천연 20개 아미노산 빌딩 블록으로 구성된 단백질로 생성하기 어렵거나 불가능한 새로운 기능을 부여할 수 있습니다. 또한 UAA를 포함하는 단백질은 과안정성 20,21 및 단백질 분해효소 저항성과 같은 특성을 개선할 수 있습니다. 22 이러한 특징은 합성 생물학적 네트워크의 맥락에서 직교 단백질을 조정하는 데 유용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 단백질 공학에 초점을 맞추고 인공 단백질 생성을 위한 UAA 통합으로 합성 생물학 방법을 잠재적으로 확장할 수 있는 접근 방식에 대해 논의합니다.


배우게 될 생물학 기술

  • 자연 세계에 대한 이해를 뒷받침하는 광범위한 개념을 탐색합니다.
  • 가설 테스트, 실험 설계, 과학 문헌 접근 및 이해, 데이터 분석을 포함한 과학적 방법을 구현하는 경험을 얻으십시오.
  • 졸업 후 탁월한 경력 기회를 얻기 위해 경쟁이 치열하거나 대학원 학위를 계속 받는 데 필요한 지식과 실용적인 기술을 습득합니다.

비천연 핵산의 주형 합성

1980년대 초에 개발된 고체상 DNA 합성에 대한 포스포라미다이트 접근법[38, 39]은 수많은 응용 분야에서 합성 DNA의 주류 사용으로 이어졌습니다. 유사하게, XNA 합성의 개선은 향후 수십 년 동안 사용량을 늘리고 새로운 응용 프로그램의 잠금을 해제할 것으로 예상할 수 있습니다. XNA 합성은 효소적 접근법과 비효소적 접근법으로 크게 나눌 수 있습니다. 널리 사용되는 일부 XNA(예: 2'OMe, LNA, PS, 2'MOE)는 화학적으로 합성할 수 있지만 가장 합성적으로 접근 가능한 XNA의 수율은 약 150bp로 제한됩니다[40]. 다른 XNA 화학의 경우 신뢰할 수 있는 고체상 합성 경로가 알려져 있지 않습니다[41]. 또한, 고체상 합성은 합성되는 시퀀스에 대한 명시적 지식에 의존합니다. 대조적으로, 주형 합성은 일반적인 정보 전달을 가능하게 하고 기능적 올리고뉴클레오티드의 진화에 필수적입니다.

비효소 주형 합성

비효소 주형 합성은 전통적으로 염기쌍 상호작용을 통해 주형에서 자가 구성하고 중합 반응하는 활성화된 뉴클레오티드 또는 짧은 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록을 사용합니다. 1970년대에 개척된 이러한 템플릿 복사[42,43,44]는 종종 프리바이오틱 핵산의 맥락에서 여러 XNA 화학[45,46,47,48,49,50,51,52,53]으로 확장되었습니다. 산 복제. 예를 들어, 환원성 아민화를 사용하여 PNA 오량체[54, 55]의 템플릿 복제를 위한 시스템은 모델 선택 실험[56]을 허용할 만큼 충분히 효율적입니다. 올리고뉴클레오티드의 구리 촉매 클릭 결찰[57, 58] 및 포스포라미데이트 결찰[59]을 통해 핵산을 조립하기 위해 유사한 전략이 이용되었으며, 생성된 백본은 일부 생체 적합성을 보여주었습니다[60]. 이 연구의 흥미로운 확장에서 핵산 주형은 프로그래밍된 반응에 대한 근접성에 의해 화학 물질을 구성하는 데에도 사용되었습니다[61,62,63]. 특히, Liu 그룹은 DNA 주형에 의해 정의된 정확한 서열에서 다양한 비핵산 개체를 화학적으로 결찰하기 위해 이러한 주형 합성 접근법을 확장했습니다[64]. 이러한 주형화된 화학 합성은 폴리머라제 또는 기타 핵산 변형 효소의 기질 역할을 하는 구성 모노머의 능력에 의해 폴리머 다양성을 제한하지 않고 점점 더 다양한 화학을 합성 및 복제할 수 있게 합니다.

XNA의 효소적 결찰 및 변형

여러 DNA 리가아제가 비천연 기질을 수용하는 것으로 나타났으며 단독으로 또는 XNA 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 XNA 중합효소와 함께 사용되었습니다. 앞서 언급한 화학적 결찰 전략과 마찬가지로 템플릿에 미리 구성된 올리고머의 효소적 결찰을 통해 정의된 유전자좌에서 여러 개의 다른 변형을 포함한 변형된 뉴클레오티드의 위치를 ​​지정할 수 있습니다. 최근 몇 가지 상업적으로 이용 가능한 리가제가 2'OMe, HNA, LNA, TNA 및 FANA를 포함한 XNA 기질의 결찰을 촉매할 수 있다는 것이 밝혀졌습니다[41, 65]. 더욱이, 합리적인 설계 및 분자 모델링 접근법은 이제 최초의 XNA-템플릿 XNA 리가제를 초래했습니다[66]. Liu와 Hili 그룹은 또한 다양하게 기능화된 DNA 3- 또는 5-mer[67, 68]로부터 변형된 DNA의 리가제 매개 합성과 함께 광범위하게 작업하여 소수성, 지방족, 방향족, 산 및 이러한 짧은 "quasicodon"을 사용하여 통합되는 기본 모이어티. SOMAmer(Slow Off-rate Modified Aptamer) 선택[22]으로 얻은 결과와 일치하여 비극성 부분을 사용한 기능화가 더 빠른 선택 수렴과 더 강한 압타머 결합을 촉진하는 것으로 보입니다[21]. 단백질(예: 할로겐화 잔기)에서 발견되는 것 이상의 화학적 다양성을 통합하여 이 그룹은 PCSK9 및 인터루킨-6에 대한 고친화성 앱타머를 분리했습니다[69]. 위의 전략은 확장된 화학 치환체 세트와 결합된 핵산의 고유한 특성(즉, 암호화된 합성, 진화성)을 활용하여 치료 가능성이 있는 기능적 분자를 생성하는 패러다임을 요약합니다.

XNA의 중합효소 합성

핵산의 효소 중합은 화학적 복사나 합성보다 훨씬 빠르고 정확하며, 현재 포스포라미다이트 기술을 대체하기 위해 차세대 DNA 올리고뉴클레오티드 합성[70, 71]을 위해 추구되고 있습니다. 유사하게, 효소적 XNA 합성은 XNA 올리고뉴클레오티드의 생산을 촉진할 수 있습니다. 화학적으로 보존적으로 변형된 XNA는 천연 중합효소에 의해 기질로 받아들여지는 반면, 더 넓은 범위의 XNA 기질을 수용하도록 중합효소를 조작하는 것도 성공을 거두었다[72, 73]. 실제로 일부 중합효소는 새로운 기질에 매우 잘 적응하는 것으로 입증되었습니다. 호열성 B-계열 중합효소, 특히 파이로코커스 그리고 열구균 속은 XNA 기질에 대한 엔지니어링에 특히 적합한 것으로 입증되었습니다[33, 74,75,76,77,78,79,80,81]. 이 기능적 가소성은 높은 열안정성에 의해 도움이 될 수 있으며, 이는 그렇지 않으면 과도하게 불안정해질 돌연변이에 대한 더 큰 내성을 촉진합니다. 그러나 A-패밀리[82,83,84,85,86,87,88,89,90]와 Phi29[91, 92]와 같은 중온성 폴리머라제와 RNA 폴리머라제[93,94,95,96,97] ] 또한 성공적으로 XNA 기질을 수용하도록 설계되었습니다(표 1). 그러나 XNA 기질에 대한 조작된 중합효소의 효율성, 충실도 및 동역학은 일반적으로 천연 효소 및 천연 기질에 비해 손상됩니다. 종종 합성 수율을 높이려면 "강제" 조건(예: 초화학량론적 중합효소 농도 또는 Mn 2+ 의 존재, 결과적으로 충실도 감소)이 필요합니다[106].

천연 중합효소의 난잡함 활용

엄격한 기질 특이성과 정확성에 대한 요구를 감안할 때 천연 중합효소가 변형된 뉴클레오티드를 전혀 통합할 수 있다는 것은 놀라운 일입니다. 그러나 뉴클레오티드의 일부 위치에서는 변형이 쉽게 허용됩니다. 예를 들어, 피리미딘의 C5 위치와 N7-데아자-퓨린의 C7 위치에서의 변형은 이중체의 주요 홈으로 투영되고 Watson-Crick 염기 쌍을 방해하지 않습니다. 따라서 이러한 위치에 있는 부피가 큰 부가물도 일반적으로 중합효소에 의해 잘 견딥니다[22, 107,108,109,110,111,112]. 이러한 위치에서 반응성 기가 있는 뉴클레오티드의 효소적 합성(예: 구리 촉매 클릭 화학의 경우)은 정교한 합성 후 변형을 허용할 수 있습니다[113,114,115,116,117].

중합효소의 가소성은 또한 연구자들이 천연 염기를 가까운 화학적 유사체로 대체할 수 있게 해주었습니다[118, 119]. 어떤 경우에는 합성이 최대 1.5kb의 변형된 PCR 산물을 생산할 만큼 충분히 효율적입니다[119]. 또한 새로운 수소 결합 패턴[105, 120], 소수성[121, 122] 및 모양 상보성[123,124,125]을 기반으로 완전히 새로운 비천연 염기쌍(UBP)이 개발되었습니다. 이러한 UBP는 조작된 천연 폴리머라제에 의해 복제될 수 있으며, 이는 유전자 코드의 성공적인 확장을 보여주고 최근에는 전례 없는 8글자 유전자 알파벳으로 정보 인코딩을 달성했습니다[120].

생체 내 XNA 합성

생체 내에서 XNA의 합성 및 복제는 "방화벽" 합성 생물학을 위한 비천연 아미노산의 안정적인 인코딩 및 유전적 직교성과 같은 목표를 향한 XNA 연구의 중요한 경계선을 나타냅니다. 이를 위해 박테리아 게놈에서 시티딘 및/또는 티미딘을 5-치환된 피리미딘 유사체로 완전히 대체하는 것은 신중한 대사 공학 및 진화에 의해 달성되었습니다[126,127,128,129].

놀랍게도 Romesberg와 동료들은 대장균 플라스미드 [130] 및 게놈 [131] 컨텍스트 모두에서 비천연 NaM-TPT3 염기쌍을 복제하고 유지할 수 있는 능력을 가진 균주. 이를 달성하기 위해 그들은 뉴클레오사이드 삼인산 수송체를 조작하고[132], Cas9를 호출하여 UBP를 잃은 서열을 분해하고, 대장균 DNA 합성 및 수리 기계. 그들은 또한 비천연 아미노산을 부위 특이적으로 인코딩하기 위해 번역 기계와 UBP의 호환성을 입증했습니다[133, 134]. 대체된 게놈 또는 UBP를 전파하는 능력을 가진 추가 반합성 유기체는 이러한 초기 성공을 따를 가능성이 높습니다[135, 136].

XNA 중합효소 엔지니어링을 위한 진화

염기 변형 및 심지어 완전히 새로운 염기쌍도 천연 중합효소에 의해 다양한 정도로 허용되지만, 당 및 골격에 대한 변형은 일반적으로 특히 완전 치환에서 더 어려운 것으로 판명됩니다. 이러한 비천연 기질의 활성을 개선하기 위해 구조적 통찰력 또는 컴퓨터 분석에 의해 주도되는 합리적인 엔지니어링에서 스크리닝 및 유도 진화에 이르기까지 폴리머라제 엔지니어링 접근 방식이 종종 사용됩니다. 이 중 에멀젼 기반 방법과 파지 디스플레이가 특히 유용했습니다[137, 138].

다양한 방향성 진화 전략이 현장에서 사용되었습니다. Compartmentalized self-replication(CSR)[139,140,141]은 중합효소가 에멀젼 구획 내에서 자신의 유전자를 PCR 증폭하도록 요구합니다. 활성 변이체의 단순한 분할과 대조적으로 활성이 높은 클론의 기하급수적 농축은 CSR을 강력한 방법으로 만듭니다. 그러나 이는 중합효소 성능에 대한 엄격한 요구를 가하는데, 이는 증폭이 중합효소 유전자의 짧은 부분에만 국한되는 짧은 패치 CSR(spCSR)[85]에서 다소 완화됩니다. Nested CSR은 CSR 증폭 단계에서 이러한 특징을 가진 out-nesting 프라이머를 사용하여 중합효소 유전자 자체에 존재하지 않는 서열 또는 특징(예: 신규 염기쌍, XNA 템플릿의 역전사)을 선택할 수 있습니다[79, 86]. 구획화된 파트너 복제(CPR)라고 하는 추가 확장은 파트너 유전자의 적합성에 의해 선택 가능한 PCR 반응을 제한함으로써 핵산 중합 이외의 효소 활성을 선택하는 데 사용할 수 있습니다[86, 142]. 최근에 CSR은 고온[143]과 저온에서 비열안정성 효소[91]의 발생을 위한 등온 증폭 반응(iCSR)에도 적용되었습니다. Compartmentalized self-tagging (CST) [144]은 훨씬 더 어려운 기질에 대한 선택을 가능하게 하거나 선택이 인코딩 플라스미드에 의해 템플릿화된 프라이머 확장을 기반으로 합니다. 충분한 프라이머 확장에 의해 "포착"된 플라스미드와 함께 비오틴화된 프라이머는 스트렙타비딘 비드에 분할됩니다. CST는 다양한 XNA[78], 가장 최근에는 dxNA[145]에 대한 중합효소를 생성했습니다. 벌크 유화 방법과 대조적으로 미세유체 장치는 매우 균일한 에멀젼 액적을 생성하는 데 사용되어 단계적 선택에서 중요한 작은 점진적 개선을 정확하게 구별하는 능력을 향상시킵니다[146, 147]. 또 다른 유도 진화 전략은 파지 디스플레이로, 파지 입자에 표시된 폴리머라제가 분리 가능한(예: 비오틴화된) 뉴클레오티드로 프라이머를 확장하도록 도전됩니다[80, 89, 148]. 중합효소 진화를 위한 파지 디스플레이의 주목할만한 최근 사용에서 Chen et al. 높은 생체 안정성과 뉴클레아제 저항성으로 인해 치료제에 특히 관심이 있는 XNA인 2'OMe RNA를 합성하고 역전사할 수 있는 여러 Taq 변이체를 확인했습니다.

XNA 중합효소의 합리적인 공학: 구조적 통찰력

중합효소는 촉매 주기 동안 들어오는 뉴클레오티드 삼인산 및 프라이머 가닥과 많은 주요 접촉을 합니다[149]. 따라서 변형된 기질과 복합체를 이루는 중합효소의 구조는 XNA 중합효소의 합리적인 공학과 소급적 이해 모두에 도움이 될 수 있습니다. 최근 Kropp et al. 촉매 주기의 6개의 연속적인 위치 각각에서 C5-변형된 시티딘으로 KlenTaq 중합효소의 삼원 구조를 해결하여 중합효소의 활성 부위를 통한 변형된 기질의 이동을 요약하고 변형된 두 뉴클레오티드 모두에서 놀라운 수준의 유연성을 드러냈습니다. 및 변형을 수용하기 위한 상호작용 중합효소 잔기.

XNA 중합에 대한 추가 구조적 통찰력은 Singh et al.에 의해 보고되었습니다. [151] 비천연 염기 쌍 dZ:dP가 있는 이진 사전 통합 및 삼원 사후 통합 복합체의 엔지니어링된 KlenTaq 구조가 있습니다. 돌연변이된 아미노산 중 어느 것도 프라이머, 주형 또는 유입되는 dZTP와 직접 접촉하지 않지만, 구조는 특히 엄지 하위 도메인에서 증가된 유연성 및 손가락 하위 도메인에서 증가된 폐쇄 각도가 비천연 염기와의 프라이머 신장을 촉진함을 시사합니다. 쌍.

Chim et al. 최근 보고된 고온성 B-계열 중합효소, 조작된 KOD 돌연변이, 중합 TNA의 삼원 구조[152]. 폴리머라제 공학에서 B-패밀리 하이퍼호열체의 일반적인 사용을 감안할 때, 아포, 이원 및 삼원 폴리머라제 복합체의 구조는 이 분야에서 추가 작업을 위한 가설을 개발하는 데 유용할 것입니다. 이후에 발표된 KOD 및 9°N의 3원 구조(DNA 프라이머 및 주형 및 유입되는 dNTP[149, 153])는 공학에 대한 고온성 고세균 B-계열 중합효소의 소인에 대한 가능한 설명을 제안합니다: 손가락 사이에 비정상적으로 넓고 양전하를 띤 채널 엄지 서브도메인은 템플릿에 대한 강한 결합과 높은 가공성을 유지하면서 기질 수정을 위한 공간을 허용할 수 있습니다. 또한, 프라이머 템플릿 듀플렉스는 A-패밀리 중합효소의 활성 부위에서 A-형태를 채택하는 반면, KOD에서는 B-형태를 채택하여 B-형태 듀플렉스의 더 넓은 주요 홈에서 뉴클레오티드 변형의 수용에 기여할 수 있습니다.

XNA 중합효소의 합리적 조작: 기질과 중합효소에 걸친 돌연변이 번역

XNA 기질과 중합효소에 걸쳐 전이 가능한 돌연변이의 수많은 예가 있습니다. 최근 보고서 [154]는 2' 변형 XNA를 더 잘 통합하기 위해 이전에 기술된 Taq 돌연변이의 조작을 자세히 설명합니다. 상이한 2' 변형된 뉴클레오티드의 혼입에 대한 동역학 데이터로부터, 속도 제한 단계가 변형된 프라이머 가닥의 인식일 수 있다는 가설에 기초하여 문헌의 관련 돌연변이가 선택되었습니다. 몇몇 돌연변이체는 2'F 및 2'OMe의 향상된 합성 및/또는 2'OMe RNA의 역전사를 보여주었다. 다른 예에서, 컴퓨터 분석, 진화적 보존 및 문헌 선례에 의해 선택된 8개의 "특이성 결정 잔기"에서의 다양화는 RNA 및 TNA에 대한 개선된 중합효소를 산출했습니다[75]. 또한, 다른 상동 B-패밀리 폴리머라제의 맥락에서 상위 돌연변이 세트를 테스트하는 것은 그들의 일반적인 유용성을 입증할 뿐만 아니라 그들이 가장 잘 기능하는 구조적 맥락을 드러냈습니다. 유사하게, 점점 더 다양한 XNA의 중합효소 합성은 중합효소와 호환되는 것으로 알려진 염기 변형과 TNA 당을 결합함으로써 TNA 중합효소로 달성되었습니다[31, 32]. 일반적으로 보존된 잔기의 돌연변이는 매우 해롭다고 믿어져 왔지만, 이러한 돌연변이가 비천연 기질에 대한 활성을 허용하는 데 핵심이 될 수 있다는 것이 이 연구와 다른 연구를 통해 점점 더 분명해지고 있습니다[75, 155].

Liu et al. 최근에 보고된 폴리머라제의 엔지니어링은 새로 기술된 XNA인 tPhoNA를 설탕과 백본 변형을 모두 포함하여 합성하기 위한 것입니다[33]. 인상적으로, 중합효소 공학 전략은 다른 XNA 기질에 대한 합성에 영향을 미치는 것으로 알려진 위치에서 돌연변이를 연속적으로 도입하고 평가하는 것으로만 구성되었습니다. 그들의 성공은 중합효소 공학 분야에서 축적된 지식 기반과 확장된 기질 스펙트럼을 부여하는 소수의 특정 핵심 돌연변이의 탁월한 능력에 대한 증거입니다.

RNA 중합효소는 또한 XNA를 합성하도록 조작되었습니다. T7 RNAP는 Ds-Pa UPB뿐만 아니라 추가로 변형된 Pa 염기를 포함하는 DNA에서 내용 확장된 RNA를 전사할 수 있는 것으로 나타났습니다[103]. 이전에 확인된 돌연변이의 작은 화면을 통해 Kimoto et al. 는 2'-F 우라실과 시티딘 삼인산을 통합하고 어려운 서열 상황에서 Pa 뉴클레오티드와 그 유사체의 개선된 통합을 보여주는 T7 RNAP 돌연변이를 확인했습니다[93]. 놀랍게도, 압타머 및 리보자임 선택을 위한 화학적 다양성을 확장하도록 설계된 Pa 뉴클레오티드의 여러 부피가 큰 변형은 원래의 Pa 트리포스페이트보다 훨씬 더 나은 기질인 것으로 보입니다. 유사하게, HNA를 합성하기 위해 이전에 진화된 Tgo 중합효소 돌연변이는 최근 우리딘 염기에 다양한 방향족 변형을 갖는 HNA 뉴클레오티드를 통합하는 것으로 나타났습니다[35]. 여기에서도 일부 더 부피가 큰 기본 수정이 우수한 통합을 보여주었습니다.

XNA의 역전사

XNA를 역전사할 수 있는 효소의 식별은 유전 물질로서 이러한 다양한 화학의 가능성을 보여주며 시험관 내 선택에 중요합니다[156]. 일부 XNA는 천연 중합효소에 의해 역전사될 수 있습니다(예: Bst 중합효소에 의한 TNA 및 FANA [157,158,159]). 또는 엔지니어링 접근 방식을 취해야 합니다[79, 88]. 소수의 돌연변이 트고 중합효소는 여러 XNA를 DNA로 역전사할 수 있는 일반적으로 확장된 기질 스펙트럼을 가진 역전사효소를 생성했습니다[29, 78].

XNA 및 XNA 중합효소 분석

XNA 작업의 한 가지 어려움은 제한 효소 및 시퀀싱 기술과 같은 기존의 핵산 조작 또는 분석 방법과 종종 호환되지 않는다는 것입니다. 따라서 XNA 및 XNA 중합효소의 개발과 병행하는 중요한 노력은 이를 분석하는 도구의 개발입니다. 예를 들어, 설명된 많은 XNA 중합효소에 대해 충실도가 자세히 평가되지 않았습니다. 충실도를 분석하는 최근 방법은 비교적 작고 자연적인 RNA 변형이라도 중합효소 오류율을 크게 증가시킬 수 있다는 발견을 보고했습니다[160]. Deep sequencing은 백본 변형이 있는 템플릿의 오류 프로필과 중합효소 read-through를 조사하는 데에도 사용되었으며 [161] 포스포로티오에이트와 같이 일반적으로 사용되는 일부 등배체 변형이 심각한 복사 오류를 유발한다는 것을 발견했습니다. 이 충실도 데이터는 효소적 XNA 합성의 중요한 한계를 예고하며, 이는 필드가 발전함에 따라 해결해야 할 가능성이 있습니다. 한편, 중합효소의 난잡한 행동은 변형에서 잘못된 "서명" 통합을 통해 후성유전적 DNA 및 RNA 변형의 존재를 읽고 기록하는 데 활용되었습니다[162,163,164,165,166,167,168,169,170]. 또한, XNA의 직접적인 시퀀싱의 첫 번째 사례가 최근에 보고되었습니다. FANA는 비교적 짧은 판독 길이를 가지고 있지만 나노포어 기술을 사용하여 시퀀싱되었습니다[171].

도구의 부족으로 인해 특히 제한된 XNA는 L-DNA입니다. 이러한 "거울 이미지" DNA는 화학적 수준에서 DNA와 동일한 특성을 유지하면서 거대분자 규모의 기능 및 상호 작용에서 완전한 직교성을 제공합니다. 따라서 L-DNA의 효소적 합성에는 D-아미노산으로 만들어진 거울상 중합효소가 필요합니다. Zhu와 동료들은 먼저 알려진 가장 작은 중합효소인 아프리카 돼지열병 바이러스 중합효소 X의 D형을 만들어 L-DNA를 합성하는 데 사용하여 중합효소가 D-뉴클레오티드 삼인산으로부터 교차 억제 없이 엄격하게 거울상 특이적이라는 것을 보여주었습니다. 102]. 이 그룹은 이후에 L-DNA 산물의 PCR 증폭을 가능하게 하는 D-아미노산으로 더 큰 열안정성 Dpo4 중합효소 돌연변이체의 합성을 보고했습니다[99, 100]. Klussmann과 동료들은 또한 유전자 길이의 L-DNA 서열을 조립하는 데 사용되는 D-Dpo4 돌연변이[101]의 합성을 보고했습니다. 미러 이미지 리가아제도 보고되었습니다[172]. 거울상 핵산은 치료제 분야에서 큰 관심을 받고 있으며 연구 및 임상 개발에 활발히 진행되고 있다[173]. 그러나 D-중합효소를 합성하는 힘든 과정과 L-DNA와 전통적인 핵산 조작 도구의 비호환성으로 인해 사용이 제한적입니다.


생체 시스템의 화학

복잡한 세포 과정을 해부하려면 생체 분자가 고유 서식지 내에서 기능할 때 추적하는 능력이 필요합니다. GFP와 같은 유전적으로 인코딩된 태그는 개별 단백질을 모니터링하는 데 널리 사용되지만 단백질 구조에 상당한 교란을 일으킬 수 있으며 글리칸, 지질, 핵산 및 이차 대사 산물과 같은 다른 종류의 생체 분자로 직접 확장되지 않습니다. 최근 몇 년 동안 생물 분자에 태그를 지정하기 위한 대안 도구인 생물 직교 화학 리포터가 화학 생물학 커뮤니티에서 등장했습니다. 원형 실험에서, 종종 단일 작용기만큼 작은 독특한 화학적 모티프가 세포 자체의 생합성 기계를 사용하여 표적 생체 분자에 통합됩니다. 그런 다음 화학적 리포터는 외인성으로 전달된 프로브를 사용하여 매우 선택적인 방식으로 공유적으로 수정됩니다. 이 리뷰는 생체 직교 화학 리포터 및 반응의 개발과 살아있는 시스템에서의 적용을 강조합니다.


3.2: 자연 및 비자연 그룹 - 생물학

인류학

과거와 현재의 사람과 문화

고고학

고대의 사람과 유물

천문학

우주와 그 안에 있는 모든 것

생물다양성

지구상의 다양한 생명체

두개골 내부의 장기

기후 변화

지구 온도의 장기적인 변화

지구

우리가 집이라고 부르는 역동적인 행성

유전학

유전자가 세대에 어떻게 전달되는지

해양 생물학

미생물학

박테리아, 바이러스 및 기타 미생물

고생물학

오래 전에 살았던 공룡과 다른 것들

물리학

시간과 공간을 통한 물질과 운동

지구 생명체를 가능하게 하는 액체

동물학

곤충부터 포유류까지 모든 동물

오늘의 OLogy 카드: 알고 계셨나요?

코알라는 곰이 아닙니다. 그들은 유대류이며 캥거루와 더 밀접한 관련이 있습니다.

일부 운석은 달의 작은 조각입니다.

녹으면 남극 대륙을 덮고 있는 빙상이 지구 해수면을 거의 70미터(230피트) 높일 수 있습니다.

박쥐는 진정으로 날 수 있는 유일한 포유류입니다.

반딧불이는 전혀 파리가 아닙니다. 딱정벌레야!

남극은 바다로 둘러싸인 대륙입니다. 북극은 그 반대이며 대륙으로 둘러싸인 광대한 바다입니다.

"별똥별"은 실제로 유성입니다.

많은 용각류는 오래된 치아가 마모됨에 따라 한 달에 한 번 새 이빨이 자라났습니다.

일부 운석은 태양계만큼 오래되었습니다.

자궁에서 처음 5개월 동안 매분 50만 개의 뉴런이 형성됩니다.

일란성 쌍둥이는 똑같은 유전자를 가지고 있지만 지문은 독특합니다.


인공선택이란

인공 선택은 바람직하고 유전 가능한 특성을 가진 자손을 생산하기 위해 동물과 식물을 선택적으로 번식하는 것입니다. 인공선택은 인간이 원하는 캐릭터를 선택하는 과정으로 주로 가축 및 개량작물에 사용된다. 농부들은 다윈이 유전학을 발견하기 전부터 인공 육종을 사용해 동식물 모두에서 원하는 유전 형질을 유지했습니다. 소에서 더 많은 우유를 생산할 수 있는 능력, 마른 근육 성장 가속화, 사바나 고양이와 같은 이국적인 애완동물, 치와와와 같은 작은 개와 같은 유익한 특성은 인공 교배를 통해 생산됩니다. 벨기에 젖소는 근육량이 증가하기 때문에 선택적 육종으로 유지됩니다.

그림 3: 벨기에 소

더욱이 인공 선택은 식물에서 말할 수 없는 다양성을 생산하는 데 사용됩니다. 옥수수, 밀, 대두 균주는 농업에서 유익한 형질을 인위적으로 선택하여 개발되었습니다. Broccoli, Brussels sprouts, cabbage, cauliflower, collards, and kale are produced by the careful selective breeding of wild mustard. Roses and orchids are also cultivated by selective breeding. Artificial selection can also produce various colors in carrot roots.

Figure 4: Carrots with multiple colored roots


2. Kin Selection and Inclusive Fitness

The basic idea of kin selection is simple. Imagine a gene which causes its bearer to behave altruistically towards other organisms, e.g. by sharing food with them. Organisms without the gene are selfish&mdashthey keep all their food for themselves, and sometimes get handouts from the altruists. Clearly the altruists will be at a fitness disadvantage, so we should expect the altruistic gene to be eliminated from the population. However, suppose that altruists are discriminating in who they share food with. They do not share with just anybody, but only with their relatives. This immediately changes things. For relatives are genetically similar&mdashthey share genes with one another. So when an organism carrying the altruistic gene shares his food, there is a certain probability that the recipients of the food will also carry copies of that gene. (How probable depends on how closely related they are.) This means that the altruistic gene can in principle spread by natural selection. The gene causes an organism to behave in a way which reduces its own fitness but boosts the fitness of its relatives&mdashwho have a greater than average chance of carrying the gene themselves. So the overall effect of the behaviour may be to increase the number of copies of the altruistic gene found in the next generation, and thus the incidence of the altruistic behaviour itself.

Though this argument was hinted at by Haldane in the 1930s, and to a lesser extent by Darwin in his discussion of sterile insect castes in 종의 기원, it was first made explicit by William Hamilton (1964) in a pair of seminal papers. Hamilton demonstrated rigorously that an altruistic gene will be favoured by natural selection when a certain condition, known as Hamilton's rule, is satisfied. In its simplest version, the rule states that NS > /NS, 어디 is the cost incurred by the altruist (the donor), b is the benefit received by the recipients of the altruism, and r is the co-efficient of relationship between donor and recipient. The costs and benefits are measured in terms of reproductive fitness. The co-efficient of relationship depends on the genealogical relation between donor and recipient&mdashit is defined as the probability that donor and recipient share genes at a given locus that are &lsquoidentical by descent&rsquo. (Two genes are identical by descent if they are copies of a single gene in a shared ancestor.) In a sexually reproducing diploid species, the value of r for full siblings is ½, for parents and offspring ½, for grandparents and grandoffspring ¼, for full cousins 1/8, and so-on. The higher the value of r, the greater the probability that the recipient of the altruistic behaviour will also possess the gene for altruism. So what Hamilton's rule tells us is that a gene for altruism can spread by natural selection, so long as the cost incurred by the altruist is offset by a sufficient amount of benefit to sufficiently closed related relatives. The proof of Hamilton's rule relies on certain non-trivial assumptions see Frank 1998, Grafen 1985, 2006, Queller 1992a, 1992b, Boyd and McIlreath 2006 and Birch forthcoming for details.

Though Hamilton himself did not use the term, his idea quickly became known as &lsquokin selection&rsquo, for obvious reasons. Kin selection theory predicts that animals are more likely to behave altruistically towards their relatives than towards unrelated members of their species. Moreover, it predicts that the of altruism will be greater, the closer the relationship. In the years since Hamilton's theory was devised, these predictions have been amply confirmed by empirical work. For example, in various bird species, it has been found that &lsquohelper&rsquo birds are much more likely to help relatives raise their young, than they are to help unrelated breeding pairs. Similarly, studies of Japanese macaques have shown that altruistic actions, such as defending others from attack, tend to be preferentially directed towards close kin. In most social insect species, a peculiarity of the genetic system known as &lsquohaplodiploidy&rsquo means that females on average share more genes with their sisters than with their own offspring. So a female may well be able to get more genes into the next generation by helping the queen reproduce, hence increasing the number of sisters she will have, rather than by having offspring of her own. Kin selection theory therefore provides a neat explanation of how sterility in the social insects may have evolved by Darwinian means. (Note, however, that the precise significance of haplodiploidy for the evolution of worker sterility is a controversial question see Maynard Smith and Szathmary 1995 ch.16, Gardner, Alpedrinha and West 2012.)

Kin selection theory is often presented as a triumph of the &lsquogene's-eye view of evolution&rsquo, which sees organic evolution as the result of competition among genes for increased representation in the gene-pool, and individual organisms as mere &lsquovehicles&rsquo that genes have constructed to aid their propagation (Dawkins 1976, 1982). The gene's eye-view is certainly the easiest way of understanding kin selection, and was employed by Hamilton himself in his 1964 papers. Altruism seems anomalous from the individual organism's point of view, but from the gene's point of view it makes good sense. A gene wants to maximize the number of copies of itself that are found in the next generation one way of doing that is to cause its host organism to behave altruistically towards other bearers of the gene, so long as the costs and benefits satisfy the Hamilton inequality. But interestingly, Hamilton showed that kin selection can also be understood from the organism's point of view. Though an altruistic behaviour which spreads by kin selection reduces the organism's personal fitness (by definition), it increases what Hamilton called the organism's 포함한 fitness. An organism's inclusive fitness is defined as its personal fitness, plus the sum of its weighted effects on the fitness of every other organism in the population, the weights determined by the coefficient of relationship r. Given this definition, natural selection will act to maximise the inclusive fitness of individuals in the population (Grafen 2006). Instead of thinking in terms of selfish genes trying to maximize their future representation in the gene-pool, we can think in terms of organisms trying to maximize their inclusive fitness. Most people find the &lsquogene's eye&rsquo approach to kin selection heuristically simpler than the inclusive fitness approach, but mathematically they are in fact equivalent (Michod 1982, Frank 1998, Boyd and McIlreath 2006, Grafen 2006).

Contrary to what is sometimes thought, kin selection does not require that animals must have the ability to discriminate relatives from non-relatives, less still to calculate coefficients of relationship. Many animals can in fact recognize their kin, often by smell, but kin selection can operate in the absence of such an ability. Hamilton's inequality can be satisfied so long as an animal behaves altruistically towards other animals that are 사실은 its relatives. The animal ~ 할 것 같다 achieve this by having the ability to tell relatives from non-relatives, but this is not the only possibility. An alternative is to use some proximal indicator of kinship. For example, if an animal behaves altruistically towards those in its immediate vicinity, then the recipients of the altruism are likely to be relatives, given that relatives tend to live near each other. No ability to recognize kin is presupposed. Cuckoos exploit precisely this fact, free-riding on the innate tendency of birds to care for the young in their nests.

Another popular misconception is that kin selection theory is committed to &lsquogenetic determinism&rsquo, the idea that genes rigidly determine or control behaviour. Though some sociobiologists have made incautious remarks to this effect, evolutionary theories of behaviour, including kin selection, are not committed to it. So long as the behaviours in question have a genetical 요소, i.e. are influenced to some extent by one or more genetic factor, then the theories can apply. When Hamilton (1964) talks about a gene which &lsquocauses&rsquo altruism, this is really shorthand for a gene which increases the probability that its bearer will behave altruistically, to some degree. This is much weaker than saying that the behaviour is genetically &lsquodetermined&rsquo, and is quite compatible with the existence of strong environmental influences on the behaviour's expression. Kin selection theory does not deny the truism that all traits are affected by both genes and environment. Nor does it deny that many interesting animal behaviours are transmitted through non-genetical means, such as imitation and social learning (Avital and Jablonka 2000).

The importance of kinship for the evolution of altruism is very widely accepted today, on both theoretical and empirical grounds. However, kinship is really only a way of ensuring that altruists and recipients both carry copies of the altruistic gene, which is the fundamental requirement. If altruism is to evolve, it must be the case that the recipients of altruistic actions have a greater than average probability of being altruists themselves. Kin-directed altruism is the most obvious way of satisfying this condition, but there are other possibilities too (Hamilton 1975, Sober and Wilson 1998, Bowles and Gintis 2011, Gardner and West 2011). For example, if the gene that causes altruism also causes animals to favour a particular feeding ground (for whatever reason), then the required correlation between donor and recipient may be generated. It is this correlation, however brought about, that is necessary for altruism to evolve. This point was noted by Hamilton himself in the 1970s: he stressed that the coefficient of relationship of his 1964 papers should really be replaced with a more general correlation coefficient, which reflects the probability that altruist and recipient share genes, whether because of kinship or not (Hamilton 1970, 1972, 1975). This point is theoretically important, and has not always been recognized but in practice, kinship remains the most important source of statistical associations between altruists and recipients (Maynard Smith 1998, Okasha 2002, West . 2007).

2.1 A Simple Illustration: the Prisoner's dilemma

The fact that correlation between donor and recipient is the key to the evolution of altruism can be illustrated via a simple &lsquoone shot&rsquo Prisoner's dilemma game. Consider a large population of organisms who engage in a social interaction in pairs the interaction affects their biological fitness. Organisms are of two types: selfish (S) and altruistic (A). The latter engage in pro-social behaviour, thus benefiting their partner but at a cost to themselves the former do not. So in a mixed (S,A) pair, the selfish organism does better&mdashhe benefits from his partner's altruism without incurring any cost. However, (A,A) pairs do better than (S,S) pairs&mdashfor the former work as a co-operative unit, while the latter do not. The interaction thus has the form of a one-shot Prisoner's dilemma, familiar from game theory. Illustrative payoff values to each &lsquoplayer&rsquo, i.e., each partner in the interaction, measured in units of biological fitness, are shown in the matrix below.

선수 2
Altruist Selfish
Player 1 Altruist 11,11 0,20
Selfish 20,0 5,5
Payoffs for (Player 1, Player 2) in units of reproductive fitness

The question we are interested in is: which type will be favoured by selection? To make the analysis tractable, we make two simplifying assumptions: that reproduction is asexual, and that type is perfectly inherited, i.e., selfish (altruistic) organisms give rise to selfish (altruistic) offspring. Modulo these assumptions, the evolutionary dynamics can be determined very easily, simply by seeing whether the NS 아니면 그 NS type has higher fitness, in the overall population. The fitness of the NS 유형, (NS), is the weighted average of the payoff to an NS when partnered with an NS and the payoff to an NS when partnered with an NS, where the weights are determined by the probability of having the partner in question. 그러므로,

(The conditional probabilities in the above expression should be read as the probability of having a selfish (altruistic) partner, given that one is selfish oneself.)

Similarly, the fitness of the NS type is:

From these expressions for the fitnesses of the two types of organism, we can immediately deduce that the altruistic type will only be favoured by selection if there is a statistical correlation between partners, i.e., if altruists have greater than random chance of being paired with other altruists, and similarly for selfish types. For suppose there is no such correlation&mdashas would be the case if the pairs were formed by random sampling from the population. Then, the probability of having a selfish partner would be the same for both NS 그리고 NS types, i.e., P(NS partner/NS) = P(NS partner/NS). Similarly, P(NS partner/NS) = P(NS partner/NS). From these probabilistic equalities, it follows immediately that (NS) is greater than (NS), as can be seen from the expressions for (NS) 그리고 (NS) above so the selfish type will be favoured by natural selection, and will increase in frequency every generation until all the altruists are eliminated from the population. Therefore, in the absence of correlation between partners, selfishness must win out (cf. Skyrms 1996). This confirms the point noted in section 2&mdashthat altruism can only evolve if there is a statistical tendency for the beneficiaries of altruistic actions to be altruists themselves.

If the correlation between partners is sufficiently strong, in this simple model, then it is possible for the condition (NS) > (NS) to be satisfied, and thus for altruism to evolve. The easiest way to see this is to suppose that the correlation is perfect, i.e., selfish types are always paired with other selfish types, and ditto for altruists, so P(NS partner/NS) = P(NS partner/NS) = 1. This assumption implies that (NS)=11 and (NS)=5, so altruism evolves. With intermediate degrees of correlation, it is also possible for the condition (NS) > (NS) to be satisfied, given the particular choice of payoff values in the model above.

This simple model also highlights the point made previously, that donor-recipient correlation, rather than genetic relatedness, is the key to the evolution of altruism. What is needed for altruism to evolve, in the model above, is for the probability of having a partner of the same type as oneself to be sufficiently larger than the probability of having a partner of opposite type this ensures that the recipients of altruism have a greater than random chance of being fellow altruists, i.e., donor-recipient correlation. Whether this correlation arises because partners tend to be relatives, or because altruists are able to seek out other altruists and choose them as partners, or for some other reason, makes no difference to the evolutionary dynamics, at least in this simple example.


3.2: Natural and un-natural groups - Biology

Graduate School of Pharmaceutical Science, Tokushima University

Graduate School of Pharmaceutical Science, Tokushima University

2018 Volume 66 Issue 2 Pages 132-138

  • Published: February 01, 2018 Received: August 29, 2017 Released on J-STAGE: February 01, 2018 Accepted: - Advance online publication: - Revised: -

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In this review, we have summarized the research effort into the development of unnatural base pairs beyond standard Watson–Crick (WC) base pairs for synthetic biology. Prior to introducing our research results, we present investigations by four outstanding groups in the field. Their research results demonstrate the importance of shape complementarity and stacking ability as well as hydrogen-bonding (H-bonding) patterns for unnatural base pairs. On the basis of this research background, we developed unnatural base pairs consisting of imidazo[5′,4′:4.5]pyrido[2,3-NS]pyrimidines and 1,8-naphthyridines, 즉., Im : Na pairs. Since Im bases are recognized as ring-expanded purines and Na bases are recognized as ring-expanded pyrimidines, Im : Na pairs are expected to satisfy the criteria of shape complementarity and enhanced stacking ability. In addition, these pairs have four non-canonical H-bonds. Because of these preferable properties, ImN N : NaO O , one of the Im : Na pairs, is recognized as a complementary base pair in not only single nucleotide insertion, but also the PCR.

Recently, work by the Human Genome Project-Write, which focuses on synthesizing human genomes, has started. 1) Rewriting entire human genomes will deepen our understanding of the genetic code and have an impact on human health. In this manner, synthetic biology is a bottom-up-type research field that deals with the preparation of materials that comprise life systems. As only two base pairs have been selected during the evolution of life, 즉., adenine (A) : thymine (T) and guanine (G) : cytosine (C) pairs, these represent ideal genetic polymers. The specific formation of hydrogen bonds (H-bonds) in the A : T pair (two H-bonds) and G : C pair (three H-bonds) is the most fundamental rule of genetic information. In 1962, with surprising foresight, Rich proposed the possibility of an extra artificial base pair, 즉., isoguanine (isoG, 6-amino-2-oxopurine) and isocytosine (isoC, 2-amino-4-oxopurine), representing fifth and sixth DNA nucleobases. 2) The artificially designed isoG : isoC pair has three H-bonds with the specific proton donor (D) and proton acceptor (A) geometry [DDA : AAD], which is different from those in the A : T pair ([DA : AD]) and the G : C pair ([ADD : DAA]) (Fig. 1). If an extra base pair can function selectively in replication, transcription, and translation alongside natural Watson–Crick (WC) base pairs, it could potentially allow expansion of the genetic code. Thus, the creation of unnatural base pairs is a challenging and ideal research theme in synthetic biology. Herein, research into the development of unnatural base pairs and their applications are described.

Prior to presenting our unnatural base pair studies, the work of four famous and pioneering groups focusing on unnatural base pairs is introduced.

2.1. Unnatural Base Pairs with Non-standard H-Bonding Geometries Benner’s Group

In 1989, Benner and colleagues synthesized isoG 그리고 isoC nucleosides and their triphosphates with the goal of expanding the genetic alphabet 3) (Fig. 1). NS isoG : isoC pair was recognized as a complementary base pair by polymerases both in 시험관 내 replication and transcription systems. 4) They also designed other unnatural base pairs with different H-bonding patterns, such as the NS : κ 쌍. 5) Additionally, they succeeded in incorporating the unnatural amino acid 3-iodotyrosine into a peptide by using a pair of 54-mer mRNA comprising isoC and tRNA with an isoGUC anticodon in 시험관 내 translation systems. 6) These were the first studies to succeed in artificially rebuilding the central dogma using unnatural base pairs, indicating that the alteration of H-bonding geometries in base pairs is a promising strategy for creating a new unnatural base pairs. However, the selectivity of the isoG : isoC pair in enzymatic replication was unsatisfactory. 이 때문입니다 isoG has a problem with tautomerism, in that the enol form of isoG has a [DAD] H-bonding pattern that is complementary to that of T. 4) In 2005, to address this drawback of isoG, they replaced natural T with 2-thioT (T s ). 7) Because of the bulkiness and H-bonding properties (weak proton acceptability) of the thione, T s is less likely to mispair with the tautomer of isoG than natural T. Fidelity per doubling of the isoG : isoC pair along with the A : T s pair in the PCR was improved by around 98%, although that with natural A : T was 93%. 7) However, when using an unnatural base pair with 98% replication fidelity, the retention of the unnatural base pair in its amplified DNA fragment after a 20-cycle PCR is decreased to 67% (즉., 0.98 20 =ca. 0.67). Because the error rate for natural WC pairing in replication is ca. 10 −6 errors/bp, highly exclusive selectivity of unnatural base pairs is required. Thus, they also created another unnatural base pair comprising 2-aminoimidazo[1,2-NS]-1,3,5-triazin-4(8시간)-one (NS) and 6-amino-5-nitro-2(1시간)-pyridone (). 8) The NS : pair, which has [AAD : DDA] H-bonding geometry, exhibits up to 99.8% fidelity per doubling without using the A : T s pair because, unlike isoG, does not tautomerize. 9) Recently, they applied the six-letter genetic system with the NS : pair to the cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) system and succeeded in obtaining highly active aptamers against HepG2 liver cancer cells. 10)

2.2. Non-hydrogen-Bonded Unnatural Base Pairs Kool’s Group

During the same decade as Benner’s pioneering works, Kool et al. have explored the possibility of non-H-bonded unnatural base pairs. In 1998, they created an unnatural base pair comprising 4-methylbenzimidazole () 11) and 2,4-difluorotoluene (NS) as steric isosteres of the natural A : T pair 12,13) (Fig. 2A). 에서 시험관 내 replication system, 그리고 NS were equally replaced with natural A and T but not G and C, demonstrating the importance of shape complementary and stacking interactions in addition to H-bonding in base pairing. Additionally, they designed a modified base, 9-methyl-1시간-imidazo[4,5-NS]pyridine (NS), that has a proton acceptor corresponding to the N3 atom. 14) Because the incorporation efficiency of NS by Klenow fragment (KF) DNA polymerase is superior to that of , the importance of proton acceptors in the minor groove for unnatural base pair design is also demonstrated.

To further evaluate the importance of shape complementarity in base pairing, they also created size-expanded (benzo-fused) WC-like base pairs, such as xA : T and A : xT pairs (termed xDNA), that have the same H-bonding geometry as natural WC base pairs but with their pairing edges shifted outward by 2.4 Å (즉., the width of benzene) 15,16) (Fig. 2B). KF polymerase incorporated natural nucleoside triphosphate (dNTP) opposite xDNA bases in a DNA template with an efficiency ca. 1000-fold lower than that of natural pairs, 16) and endogenous 대장균 (대장균) enzymes accurately transcribed xDNA to encode the bacteria phenotype. 17)

2.3. Creation of a Semi-synthetic Organism with an Unnatural Base Pair Romesberg’s Group

Romesberg and colleagues have also developed various kinds of non-H-bonded unnatural base pairs. In 1999, they reported the self-complementary 7-propynylisocarbostyril (PICS) : PICS pair 18) (Fig. 3). 언제 PICS : PICS base pairs are incorporated into DNA, the resulting duplex shows high thermal stability, and KF polymerase recognizes the PICS : PICS pair as a complementary base pair. However, further replication reactions after PICS : PICS base pairing are terminated because PICS bases overlap with each other, indicating structural change in the DNA duplex. Consequently, they explored more than 100 kinds of unnatural base pairs 19–25) and succeeded in developing 5SICS : MMO2 그리고 5SICS : NaM pairs, which are replicable unnatural base pairs in the PCR. 26–28) In 2014, they reported the creation of a semi-synthetic organism containing the 5SICS : NaM base pair. In this work, an exogenously expressed nucleoside triphosphate transporter imported d5SICS and dNaM triphosphates efficiently into 대장균, and an endogenous replication system used them in the genetic codes. 29) This report had a great impact on synthetic biology, and some researchers consider the created organism to be “alien.”

2.4. Unnatural Base Pair as a Powerful Tool for Creating Highly Functional Nucleic Acids Hirao’s Group

Hirao et al. have also focused on the creation of unnatural base pairs that function in replication, transcription, and translation in the same way as natural WC base pairs. Their unnatural base pairs were developed by exploiting the concept of steric hindrance. In their 2-amino-6-(2-thienyl)purine (NS) : 2-oxo-1시간-pyridine (와이) pair, the purine-like NS has a bulky substituent at the major groove side 30,31) (Fig. 4). 그래서 NS : 와이 pair is selectively recognized as a complementary base pair by KF polymerase in 시험관 내 replication systems. Furthermore, in 2002 they succeeded in synthesizing the Ras protein modified with 3-iodotyrosine from a DNA template containing the NS base by combining T7 polymerase transcription and 대장균 시험관 내 translation systems. 32) They also developed the Ds : Pa base pair, in which H-bonding atoms and substituents located at the base-pairing side are excluded. 33) The replication selectivity of the Ds : Pa pair is superior to that of the NS : 와이 pair, and the Ds : Pa pair can be amplified in the PCR with over 99% fidelity per doubling using γ-amino triphosphates of Ds and A. 33) Concerning selectivity in replication, their unnatural base pairs exhibit the best performances among the reported unnatural base pairs. The low misincorporation rate of the recently developed Ds : diol1-Px pair (5×10 −5 errors/bp) is close to the mispairing error rate of natural WC pairs (2×10 −5 errors/bp). 34,35) By making use of this superior property of the Ds : diol1-Px pair, they succeeded in obtaining a DNA aptamer containing the Ds base against human protein target, vascular endothelial cell growth factor-165 (VEGF-165). 36) Because the affinities of aptamers that have Ds bases are >100-fold improved over those of aptamers containing only natural bases, the potential of genetic alphabet expansion as a powerful tool for creating highly functional nucleic acids is demonstrated.

In contrast to the research described above, we began our unnatural base pair studies to address the simple question : why did WC base pairs come to contain two or three H-bonds during the evolution of life? To answer this, we have explored four H-bonding base pairs. 37–41) As purine-type nucleobases, a series of imidazo[5′,4′:4.5]pyrido[2,3-NS]pyrimidines (Im) were designed, 37) while 1,8-naphthyridines (Na) were designed as their complementary pyrimidine nucleobases. 38) For the first generation of our four-H-bonding unnatural base pairs, two Im : Na pairs, 즉., ImN O : NaO N 그리고 ImO N : NaN O , which have alternate H-bonding geometries, were developed. As can be seen in Fig. 5a, these pairs have four non-canonical H-bonds and expanded aromatic surfaces, and they satisfy the shape complementarity criterion like WC base pairs. Because of the contributions of these effects, DNA duplexes containing these pair(s) are significantly thermally stabilized (ca. +8°C/pair). 38) In addition, both pairs are recognized by KF polymerase as complementary in single nucleotide insertion. However, the kinetic parameters determined for their 5′-triphosphates revealed that the efficiencies of incorporation for ImN O : NaO N 그리고 ImO N : NaN O pairs are 1–2 orders of magnitude lower than those of natural A : T and G : C pairs. Furthermore, misincorporation of natural dNTP, for example, that of 2′-deoxyadenosine 5′-triphosphate (dATP) against NaN O in the template was clearly observed at the same efficiency as that of ImO N TP 에 맞서 NaN O in the template owing to the possible formation of an A : NaN O pair with two H-bonds 42,43) (Fig. 5b).

To improve efficiency and selectivity, a new Im : Na pair, 즉., ImN N : NaO O , has been envisioned 39,44) (Fig. 5c). This pair has a [DAAD : ADDA] H-bonding geometry, and thus is expected to avoid the misincorporation of natural A and G (Fig. 5d). The chemistry and enzymatic behavior of the ImN N : NaO O pair is described below.

3.1. Synthesis of the Nucleoside Units for the ImN N : NaO O Pair

The most straightforward synthesis of ImN N nucleoside 1 is thought to be through intramolecular cyclization of the 5-pyrimidinylimidazole nucleoside, which can be prepared ~을 통해 Stille coupling between the 5-iodoimidazole nucleoside 2 and (tributylstannyl)pyrimidine 3 (Chart 1). When a mixture of 2 prepared from 2′-deoxyinosine and 3 prepared from 2,4-dichloropyrimidine is heated in N,N-dimethylformamide (DMF) in the presence of tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0)-chloroform adduct (dba3Pd2·CHCl3), a mixture of coupling product 4 and a spontaneously cyclized tricyclic product 5 is obtained. Subsequent treatment of the mixture under basic conditions converges the mixture to the tricyclic product 5. Finally, treatment of 5 with a mixture of 1,4-dioxane and NH4OH gives the desired ImN N nucleoside 1 in good yield. 37) The resulting 1 is then converted into the corresponding phosphoramidite unit and 5′-triphosphate under the appropriate conditions. 44,45)

Reagents and conditions: (a) dba3Pd2·CHCl3, DMF, 100°C (b) Na2CO3, aq. EtOH, 80°C (c) NH4OH/1,4-dioxane, 100°C.

For the synthesis of NaO O nucleoside 6, which is an unusual C-nucleoside, the palladium-catalyzed Heck reaction was envisioned. As illustrated in Chart 2, 3-iodo-1,8-naphthyridine derivative 7 prepared from 2-amino-7-hydroxy-1,8-naphthyridine and glycal 8 are prepared. Then, Heck coupling of 7 ~와 함께 8 in the presence of palladium acetate and triphenylarsine followed by deprotection and stereoselective reduction affords 1,8-naphthyridine C-nucleoside 9. After protection of the hydroxyl groups with silyl groups to give 10, the substituent at the 2-position is converted into an acetoxy group ~을 통해 11. Finally, treatment of the resulting 12 with methanolic ammonia at 60°C in a sealed tube gives the desired NaO O nucleoside 6 in good yield. In a similar manner as for 1, 6 is converted into the corresponding phosphoramidite unit and 5′-triphosphate for enzymatic evaluation. 39,45)

Reagents and conditions: (a) Pd(OAc)2, AsPh3, Bu3N, DMF, 60°C (b) TBAF, THF (c) NaBH(OAc)3, AcOH, CH3CN (d) TIPSCl, imidazole, DMF, 55°C (e) NH3/MeOH, 80°C (f) NaNO2, AcOH (g) NH3/MeOH, 80°C.

3.2. Investigation of Single Nucleotide Insertion with the ImN N : NaO O Pair

To investigate the efficiency and selectivity of the newly designed ImN N : NaO O pair in 시험관 내 replication systems, we examined single nucleotide insertion using KF polymerase, and the kinetic parameters, such as the Michaelis constant (케이미디엄), the maximum rate of the enzyme reaction (Vmax), and the incorporation efficiency (Vmax/케이미디엄), for the ImN N : NaO O pair were determined and compared with those of the two previous Im : Na pairs 45) (Fig. 6). As discussed above, the values of Vmax/케이미디엄 위해 ImN O : NaO N pair are 1–2 orders of magnitude lower than those of the natural A : T pair (6.0×10 7 –9.0×10 7 % min −1 M −1 ), as presented in the first row of Fig. 6. This result is thought to be due to the fact that the NaO N base lacks a proton acceptor corresponding to the O2 atom of the natural pyrimidine base. 를 위해 ImO N : NaN O pair, the Vmax/케이미디엄 values are better than those for the ImN O : NaO N pair (second row in Fig. 6). However, as well as the desired ImO N , undesired A is incorporated against NaN O in the template with a comparable Vmax/케이미디엄 value (Fig. 5b).

a) Incorporation of dYTP against a series of Im bases in the template. b) Incorporation of dYTP against a series of Na bases in the template. a n.d.=not determined.

Concerning incorporation efficiencies, the Vmax/케이미디엄 values for the ImN N : NaO O pair are superior to those for the ImN O : NaO N 그리고 ImO N : NaN O pairs because the ImN N 그리고 NaO O bases have proton acceptors at positions corresponding to the N3 of a purine and the O2 of a pyrimidine, respectively. 또한, ImN N : NaO O pair has higher thermal stability than the two previous Im : Na pairs owing to the [DAAD : ADDA] H-bonding pattern. 39) The preferable base-pairing properties of the ImN N : NaO O pair lead to it having the highest incorporation efficiency among the three Im : Na pairs. With respect to specificity, misincorporations of natural A and/or G against ImN N in the template are controlled by the [DAAD : ADDA] H-bonding pattern of the ImN N : NaO O 쌍. The efficiency of ImN N TP incorporation against NaO O is at least ten-times higher than those of natural dATP and 2′-deoxyguanosine 5′-triphosphate (dGTP) incorporations. Thus, as expected from Fig. 5d, formation of both A : NaO O and G : NaO O should be negligible owing to the NH proton repulsion between the 6-amino group of A and N8 of NaO O , and that between N1 of G and N1 of NaO O , 각각.

3.3. PCR Amplification with ImN N : NaO O Pair

To apply the newly developed ImN N : NaO O pair to synthetic biology research like that reported by the four aforementioned groups, this pair should be viable in PCR amplification. Thus, according to the method reported by Hirao et al., 34) PCR involving the ImN N : NaO O pair was examined under various dNTP conditions (Fig. 7a).

(a) Schematics of the template and primers, and the resulting amplicon. Gel electrophoresis of PCR products obtained using Taq DNA polymerase (b), Deep Vent exo − DNA polymerase (c), Deep Vent exo + DNA polymerase (d), and Pfx 50 DNA polymerase (e) under different dNTP conditions.

First, when Taq DNA polymerase, which is a standard thermophilic DNA polymerase for routine PCR, is used, a 75 base-pair amplicon in the presence of ImN N TP and NaO O TP along with all four kinds of dNTPs is successfully obtained (Fig. 7b, lane 4). However, similar PCR products are observed under the conditions lacking ImN N TP (lane 3), indicating that inaccurate amplification occurs, presumably owing to misincorporation of natural A and/or G against NaO O in the resulting DNA fragment. Thus, we screened suitable thermophilic DNA polymerases, and typical results are shown in Figs. 7c–e. Exonuclease-deficient Deep Vent (Deep Vent exo − ) DNA polymerase gives the full-length amplicon in both the presence and absence of NaO O TP (Fig. 7c). Conversely, the same polymerase with 3′→5′ exonuclease activity (Deep Vent exo + ) preferentially affords the PCR product in the presence of all 5′-triphosphates (Fig. 7d), suggesting that the proofreading activity identifies mismatched base pairs with natural nucleobases and corrects them to the ImN N : NaO O 쌍. It has been reported that the proofreading activity of DNA polymerases improves the accuracy of incorporating unnatural base pair analogs, 32,33) and the benefits of this activity are apparent in our case.

To further evaluate the fidelity of the ImN N : NaO O pair in PCR amplification, we sequenced the resulting PCR product according to methods reported by the groups of Benner 26) and Hirao. 34) As a result, the lowest total mutation rates of the ImN N : NaO O pair is observed when using Pfx 50 DNA polymerase, and it is estimated to be ca. 6% after 15 PCR cycles (fidelity ≈0.995 per doubling) (the analysis of PCR products by gel electrophoresis is shown in Fig. 7d). Although the replication fidelity of the ImN N : NaO O pair is slightly inferior to those of other unnatural base-pair analogs, 8,9,26,28,34,46,47) it is strongly indicated that the ImN N : NaO O pair acts as an orthogonal base pair for WC base pairs during PCR amplification.


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