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왜 전혈 대신 특정 백혈구에서 DNA를 추출합니까?

왜 전혈 대신 특정 백혈구에서 DNA를 추출합니까?


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내 연구실에서는 인간의 DNA가 전혈 샘플에서 추출됩니다.

나는 실제로 추출을 하지 않고 특정 프로토콜에 익숙하지 않지만 혈소판과 적혈구에는 핵이 없으므로 DNA가 없다는 것을 이해하므로 샘플의 백혈구를 분리하는 것이 절차.

나는 또한 다른 유형의 백혈구에 다엽 핵이 있다는 것을 이해하지만 이것이 백혈구에서 추출할 수 있는 DNA에 어떤 영향을 미치는지 모르겠습니다.

나는 다음과 같은 몇 가지 논문을 보았습니다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15113441에서는 특정 유형의 백혈구에서 DNA를 추출했다고 명시하고 있습니다. 이 경우 림프구. 이 논문은 면역 기능에 초점을 맞추거나 심지어 다루지 않습니다.

한 종류의 백혈구에서만 DNA를 추출하는 이유는 무엇입니까?

림프구에는 다른 유형의 백혈구보다 환자의 게놈을 더 잘 나타내는 DNA가 포함되어 있습니까?

특정 유형의 백혈구는 다른 유형보다 더 쉽게 분리할 수 있습니까?

이것은 표준 혈액에서 DNA 추출 절차입니까, 아니면 연구 목표에 따라 선택할 수 있는 여러 옵션이 있습니까?


실험실에서 전혈 대신 림프구에서 DNA를 추출할 수 있는 몇 가지 이유가 있습니다. 모든 과잉 단백질(주로 적혈구의 헤모글로빈)을 어느 시점에서 제거해야 하기 때문에 전혈에서 게놈 DNA를 생성하는 것이 반드시 최선의 아이디어는 아닙니다. DNA가 있는 세포만 포함하도록 입력 범위를 좁히면 존재하는 DNA의 총량에 비해 추출해야 하는 단백질의 양이 줄어듭니다.

림프구에는 T 세포, B 세포 및 NK 세포가 포함되며, 특히 필요한 경험과 시약/장비가 있는 실험실에서 신속하게 정제하기가 비교적 쉽습니다. 이들은 결코 DNA를 정제할 수 있는 유일한 유형의 백혈구가 아닙니다. 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)도 사용할 수 있습니다. 그들은 림프구뿐만 아니라 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 등과 같은 다른 세포 유형을 포함합니다. (내 경험에 따르면 몇 번의 세척으로 본질적으로 단일 단계 프로토콜이기 때문에 림프구보다 전혈에서 정제하는 것이 훨씬 더 간단합니다. 이후.) 최종 결과는 동일하지만 림프액의 DNA는 PBMC, 과립구 또는 호중구의 DNA와 동일해야 합니다.

신체의 모든 체세포 유핵 세포에는 다음이 포함됩니다. "대표" DNA는 각각 T 및 B 세포 수용체를 형성하기 위해 게놈 재배열을 겪는 T 및 B 세포와 같은 몇 가지 특수 세포 유형을 제외하고 개인의 모든 세포는 동일한 게놈 DNA 서열을 포함합니다. 혈액은 환자와 임상 연구 참가자로부터 비교적 쉽게 얻을 수 있기 때문에 피부 펀치나 구강 면봉 대신 연구를 위한 DNA의 출처인 경우가 많습니다.


전혈 샘플에서 게놈 DNA를 추출하는 방법: 현재 관점

추상적 인: 디옥시리보핵산(DNA) 추출은 1869년에 처음 수행된 이후로 상당히 발전했습니다. 이는 분자 생물학 분야에서 사용되는 많은 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 첫 번째 단계입니다. 전혈 샘플은 DNA를 얻는 데 사용되는 주요 소스 중 하나이며 이러한 샘플에서 핵산 추출을 수행하는 데 사용할 수 있는 다양한 프로토콜이 있습니다. 이러한 방법은 매우 기본적인 수동 프로토콜에서 자동화된 DNA 추출 프로토콜에 포함된 보다 정교한 방법까지 다양합니다. 사용 가능한 다양한 옵션을 기반으로 비용 효율성 및 시간 효율성 측면에서 가장 잘 수행되는 옵션을 결정하는 것이 이상적입니다. 우리는 DNA 추출 이력과 전혈 샘플에서 DNA 추출에 가장 일반적으로 사용되는 방법을 검토하여 개별 장점과 단점을 강조했습니다. 또한 현재 과학 문헌을 검색하여 다양한 핵산 추출 방법을 비교한 연구를 찾아 사용 가능한 최상의 선택을 결정했습니다. 우리의 연구를 바탕으로 우리는 전혈 샘플에서 특정 DNA 추출 방법을 뒷받침할 과학적 증거가 충분하지 않다고 결정했습니다. 적합한 방법을 선택하는 것은 여전히 ​​많은 다른 요소를 고려해야 하는 과정이며 전 세계 시설에서 선택한 선택을 검증하기 위해 더 많은 연구가 필요합니다.

키워드: genomic DNA 추출, 전혈 시료, 용액 기반 DNA 추출, 고체상 DNA 추출, 비용 효율성, 시간 효율성

분자 생물학 분야의 인체 건강 연구에는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 단백질 샘플의 사용이 필요합니다. 사용 가능한 다운스트림 응용 프로그램을 성공적으로 사용하면 고품질 DNA를 사용할 수 있습니다. 따라서 핵산 추출은 추가 분자 연구 응용 프로그램을 수행하는 데 필요한 실험실 절차의 핵심 단계입니다. 적절한 추출 방법을 선택하는 것이 중요하며 사용 가능한 옵션을 평가할 때 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 여기에는 기술적 요구 사항, 시간 효율성, 비용 효율성, 사용할 생물학적 표본, 수집 및 보관 요구 사항이 포함될 수 있습니다. 1

전혈은 게놈 DNA(gDNA)를 얻을 수 있는 다양한 소스 중 하나이며 전 세계 시설에서 널리 사용되었습니다. 따라서 우리는 전혈 샘플을 사용하는 DNA 추출 프로토콜에 중점을 둘 것입니다. 인간 전혈 표본의 수집, 보관 및 수동 취급과 관련된 문제는 이 간행물의 범위를 벗어나므로 다루지 않습니다. 그러나 선택한 DNA 추출 기술의 성능과 성공에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있으므로 중요하며 고려해야 합니다.

DNA 추출 기술의 초기 개발

프리드리히 미셔(Friedrich Miescher)는 세포의 화학적 구성을 연구하면서 DNA를 분리한 최초의 과학자였습니다. 1869년에 그는 샘플에서 채취한 백혈구를 신선한 수술용 붕대에 감아 이 세포에 포함된 단백질을 정제하고 분류하는 실험을 했습니다. 실험을 하는 동안 그는 핵에서 새로운 물질을 확인했으며 이를 "핵"이라고 불렀습니다. 그런 다음 그는 세포질에서 세포핵을 분리하고 단백질 및 기타 세포 물질과 다른 오늘날 DNA로 알려진 이 새로운 화합물을 분리하는 두 가지 프로토콜을 개발했습니다. 이 과학적 발견은 사용된 격리 프로토콜과 함께 그의 멘토인 Felix Hoppe-Seyler와 공동으로 1871년에 출판되었습니다. 2,3 그러나 Meselson과 Stahl 3,4이 DNA 추출을 위한 일상적인 실험실 절차를 개발한 것은 1958년이었습니다. 그들은 박테리아 샘플에서 DNA 추출을 수행했습니다. 대장균 염 밀도 구배 원심분리 프로토콜을 사용합니다. 그 이후로 DNA 추출 기술은 다양한 유형의 생물학적 소스에서 추출을 수행하도록 조정되었습니다.

DNA 추출 방법은 세포의 효과적인 파괴, 핵단백질 복합체의 변성, 뉴클레아제 및 기타 효소의 비활성화, 생물학적 및 화학적 오염물질의 제거, 최종적으로 DNA 침전을 달성하기 위한 몇 가지 일반적인 절차를 따릅니다. 5 그들 대부분은 유사한 기본 단계를 따르며 유기 및 비유기 시약의 사용과 원심 분리 방법을 포함합니다. 마지막으로 다양한 자동화 절차와 상업적으로 이용 가능한 키트로 발전했습니다. 1,5𔃅

처음에 우리는 전혈 샘플에서 DNA를 추출하는 동안 유사한 절차 및/또는 시약이 필요한 세포 용해, 세포 효소 비활성화, 세포 복합체의 변성 및 DNA 침전을 달성하기 위한 프로토콜 및 단계에 대해 논의할 것입니다. 생물학적 및 화학적 오염물 제거를 목표로 하는 단계의 주요 차이점은 각 프로토콜에 대해 자세히 논의할 때 강조될 것입니다.

앞서 언급했듯이 세포 용해는 대부분의 DNA 추출 프로토콜에서 일반적인 단계이며 일반적으로 세제와 효소를 사용하여 수행됩니다. Sodium dodecyl sulfate(SDS) 및 Triton™ X-100(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)은 세포막을 가용화하는 데 사용되는 인기 있는 세제의 예입니다. 효소는 또한 세제와 결합되어 세포 표면 또는 세포질 성분을 표적으로 합니다. Proteinase K는 당단백질을 절단하고 RNase 및 DNase를 비활성화하기 위해 다양한 프로토콜에 사용되는 일반적으로 사용되는 효소입니다. 요소, 구아니디늄 염 및 화학적 카오트로프와 같은 다른 변성제도 세포를 파괴하고 세포 효소를 비활성화하는 데 사용되었지만 품질과 핵산 수율에 영향을 줄 수 있습니다. 1,7𔃇

DNA 침전은 아세트산 암모늄과 같은 염의 양이온이 인산염 백본의 음전하로 인한 반발을 상쇄하기 때문에 DNA 함유 용액에 고농도의 염을 첨가함으로써 달성됩니다. 에탄올(최종 농도 70%󈞼%) 또는 이소프로판올(최종 농도 40%󈞞%)과 같은 용매가 있는 상태에서 DNA와 염의 혼합물은 핵산을 침전시킵니다. 일부 프로토콜에는 DNA에서 과도한 염을 제거하기 위해 70% 에탄올로 세척하는 단계가 포함됩니다. 마지막으로 핵산을 물 또는 TE 완충액(10mM 트리스, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA])에 재현탁합니다. 7𔃇 TE 버퍼는 뉴클레아제, 부적절한 pH, 중금속 및 자유 라디칼에 의한 산화에 의해 손상되는 것을 방지하기 때문에 장기간 DNA 저장에 일반적으로 사용됩니다. Tris는 7𔃆의 안전한 pH를 제공하며 EDTA는 뉴클레아제 활성에 사용되는 2가 이온을 킬레이트하고 중금속으로 인한 산화 손상을 방지합니다. 9

인간 전혈 샘플에서 DNA 추출 방법의 주요 유형

표 1은 전 세계적으로 연구 시설에서 일반적으로 사용되는 전혈 시료의 DNA 추출 방법의 주요 범주 및 하위 범주를 보여줍니다. 핵산 추출 프로토콜의 각 단계에 일반적으로 사용되는 실험실 시약은 유사점과 차이점을 강조하기 위해 이 표에 포함되어 있습니다.

표 1에 포함된 DNA 추출 기술은 기술 역사 및 배경에 대한 간략한 요약과 함께 다음 섹션에서 더 자세히 논의될 것입니다. 최근 몇 년 동안 이러한 프로토콜 중 일부는 소형 전체 화학 분석 시스템 또는 미세유체 유전 분석 마이크로칩을 개발하는 마이크로 장치에 적용되었습니다. 7,10 그러나 우리는 거시적 규모의 핵산 추출에 사용할 수 있는 기술로 검토 범위를 제한할 것입니다.

표 1 전혈 샘플에서 일반적으로 사용되는 DNA 추출 방법
약어: DNA, 데옥시리보핵산 N/A, 해당 없음 SDS, 나트륨 도데실 설페이트.

솔루션 기반 DNA 추출 방법

앞서 언급했듯이 솔루션 기반 프로토콜에는 1) 유기 용매를 사용하는 솔루션 기반 방법과 2) 염석 기술을 기반으로 하는 두 가지 주요 접근 방식이 있습니다. 두 가지 방법에 대한 자세한 설명은 다음과 같습니다.

유기용매를 이용한 용액 기반 DNA 추출법

일련의 관련 RNA 추출 방법에서 유래한 유기 용매를 사용한 DNA 추출 프로토콜. 이러한 방법에 사용되는 주요 단계 중 일부는 다음과 같습니다. 1) SDS 또는 N-라우로일 사르코신을 포함한 세제/카오트로픽 함유 용액을 추가하여 수행되는 세포 용해 2) 일반적으로 유기 용매를 사용하여 DNase 및 RNase의 비활성화 3) DNA 정제 및 RNA, 지질 및 단백질 제거 및 4) 추출된 핵산의 재현탁. 1,5,11

이 방법은 1977년 Ullrich et al12이 플라스미드 DNA를 분리하기 위해 구아니듐 이소티오시아네이트를 사용한 RNA 추출 기술을 사용했을 때 처음 개발되었습니다. 이 기술은 나중에 1979년 Chirgwin et al13에 의해 수정되었습니다. 이 기술은 guanidium thiocyanate의 사용과 염화세슘 쿠션을 통한 초원심분리의 긴 시간이 필요했습니다. 이 방법을 개선하기 위한 노력으로 Chomczynski와 Sacchi 14,15는 1987년에 guanidium thiocyanate–phenol–클로로포름과 훨씬 짧은 원심분리를 사용한 RNA 추출 프로토콜을 개발했습니다. 이 마지막 RNA 추출 프로토콜은 RNA, DNA 및 단백질을 분리할 수 있었지만 DNA 추출 기술로 사용하기 위해 구아니듐 티오시아네이트–페놀–클로로포름은 나중에 페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올의 혼합물로 대체되었습니다. 전자의 용매는 RNase 활성을 완전히 억제하지 않았습니다. 11 페놀은 단백질을 빠르게 변성시키는 탄수화물이지만 부식성, 독성 및 인화성이 높습니다. 이 유기 용매는 일반적으로 샘플에 첨가된 다음 원심력을 사용하여 2상 에멀젼을 얻습니다. 상부 친수성 층은 희석된 DNA를 포함하고 하부 소수성 층은 유기 용매, 세포 파편, 단백질 및 기타 소수성 화합물로 구성됩니다. 그런 다음 2:1 또는 1:1 비율로 아세트산 나트륨과 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 고농도 염을 첨가하여 원심분리 후 DNA를 침전시킵니다. 70% 에탄올을 추가하여 과도한 염을 제거할 수 있으며, 그런 다음 샘플을 원심분리하여 DNA 펠릿을 수집하고, 이는 멸균 증류수 또는 TE 완충액(10mM Tris 1mM EDTA pH 8.0)에 재현탁될 수 있습니다. 1,5

이러한 기술에는 독성 및 부식성 유기 용매의 사용이 포함되기 때문에 안전이 주요 관심사입니다. 개인 보호 장비, 생물학적 위험 후드 사용과 관련된 안전 조치 및 교육이 필요합니다. 페놀–클로로포름은 적절한 pH로 평형화되어야 하며 프로토콜 조건은 최적화되어야 합니다. 7 이러한 프로토콜의 안전성과 사용 편의성을 개선하기 위해 용매와의 물리적 접촉을 피하기 위해 특정 수정 사항이 도입되었습니다. 여기에는 실리카겔 중합체 16을 통합하거나 용매를 벤질 알코올과 같은 다른 물질로 교체하는 것이 포함됩니다. 17

염석을 이용한 용액 기반 DNA 추출 방법

유기 용매의 사용을 피하는 일부 핵산 추출 기술도 수년에 걸쳐 개발되었습니다. 1,6,11 1988년에 Miller et al18은 높은 염 농도에서 단백질 침전을 통해 DNA 정제를 달성하는 프로토콜을 발표했습니다. 전통적인 프로토콜은 SDS–프로테이나제 K를 사용한 초기 세포 파괴 및 소화에 이어 고농도의 염(보통 6M 염화나트륨)을 첨가하는 것을 포함합니다. 그런 다음 혼합물을 원심분리하여 단백질이 바닥으로 침전되도록 하고 상층액에 DNA가 포함된 다음 새 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 유기 용매 방법에 대해 설명한 것과 동일한 방식으로 에탄올 또는 이소프로판올을 사용하여 DNA를 침전시킵니다. 1,18󈞀

그러나 proteinase K의 사용은 다른 솔루션 기반 접근 방식에 사용되는 다른 시약과 비교할 때 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있으므로 DNA의 단백질 제거를 위한 대체 시약을 찾기 위한 몇 가지 시도가 있었습니다. 21󈞄 1991년에 Lahiri와 Nurnberger 21은 유기 용매를 사용하지 않고 proteinase K를 사용한 장기간 배양을 제거한 혈액 샘플에서 DNA 추출 프로토콜을 개발했습니다. 그들의 프로토콜은 Nonidet™ P-40(NP-40 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 혈액 세포와 고염 완충액을 용해하고 10% SDS를 사용하여 오염 물질을 비활성화하고 제거합니다. 또 다른 프로토콜은 2005년 Nasiri et al에 의해 출판된 수정된 염석법으로, 이는 단백질분해효소 K 소화를 세탁 분말의 사용으로 대체했습니다. 이 수정된 기술은 전 세계 많은 시설에서 DNA 추출 프로토콜로 성공적으로 사용되었습니다. 26󈞎

고체상 DNA 추출 방법

액체/고체상 접근 방식을 사용한 DNA 정제는 Vogelstein과 Gillespie 35가 프로토콜에서 유리 분말 형태의 실리카를 사용하여 이전에 아가로스 겔 전기영동으로 분리된 DNA 단편을 정제한 1979년으로 거슬러 올라갈 수 있습니다. 혈액 샘플에서 DNA 추출을 위한 고체상 추출 방법은 1989년 McCormick에 의해 처음 기술되었습니다. McCormick은 페놀과 화학적으로 유사한 규산질 기반의 불용성 입자를 사용하는 기술을 발표했으며, 이 입자는 단백질과 상호작용하여 DNA 정제를 가능하게 합니다. 그 이후로 액체/고체 DNA 추출 접근법을 사용하는 다양한 절차가 개발되었으며 대부분의 상업적으로 이용 가능한 추출 키트에 사용됩니다.

이러한 기술은 다음 원리 중 하나를 통해 특정 pH 및 염 함량 조건에서 DNA를 흡수합니다. 친화성 및 크기 배제 메커니즘. 5,7 이러한 방법의 대부분은 세포 파괴, DNA 흡착, 핵산 세척 및 최종 용출을 달성하기 위해 일련의 유사한 단계를 따릅니다. 대부분의 고체상 기술은 원심력 하에서 핵산을 결합하기 위해 스핀 컬럼을 사용합니다. 스핀 컬럼은 실리카 매트릭스, 유리 입자 또는 분말, 규조토 또는 음이온 교환 운반체로 만들어지며 이러한 화합물은 일반적으로 특정 pH에서 완충 용액을 사용하여 필요한 화학적 형태로 전환되도록 조절해야 합니다. 특정 용해 완충액을 사용하여 이전에 분해된 혈구를 컬럼에 적용하고 원심분리하고, 결합 용액에 의해 제공되는 pH 및 염 농도 조건에 의해 DNA가 컬럼에 결합합니다. 일부 단백질 및 기타 생화학적 화합물도 컬럼에 결합할 수 있으며, 이들은 나중에 일련의 세척 단계 동안 경쟁 물질이 포함된 세척 완충액을 사용하여 제거됩니다. DNA는 최종적으로 멸균 증류수 또는 TE 완충액에서 용출됩니다. 1,5,7

실리카 및 실리카 매트릭스를 사용한 DNA 추출 방법

실리카 매트릭스는 DNA 결합에 대한 고유한 특성을 가지고 있습니다. 그들은 양전하를 띠고 DNA 백본의 음전하와 친화력이 높습니다. 높은 염분 조건과 pH는 DNA의 인산염 백본에 있는 음으로 하전된 산소에 단단히 결합하는 나트륨 양이온을 사용하여 달성됩니다. 일련의 세척 단계로 오염 물질을 제거한 다음 TE 완충액 또는 멸균 증류수를 사용하여 낮은 이온 강도(pH 𕟹)에서 DNA 용출을 수행합니다. 실리카 기반 접근 방식을 사용하는 상업적으로 이용 가능한 키트는 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재한 Clontech Laboratories, Inc.(NucleoSpin™) MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA(UltraClean ® BloodSpin ® ) QIAGEN Pty Ltd, 호주 빅토리아(QIAamp ®), 미국 위스콘신주 Fitchburg에 소재한 Promega Corporation(Wizard ®) 미국 텍사스주 미주리 시 소재 Epoch Life Science(EconoSpin ®) 및 Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스(GenElute™) 등. 이 프로토콜에서 혈액 샘플은 용해 완충액과 함께 몇 분 동안 배양됩니다. 대부분의 프로토콜은 완료하는 데 약 40분에서 1시간이 걸리므로 최소한의 오염으로 높은 수율의 DNA를 생성합니다. 1,5,7

규조토, 규조토 또는 규조토로 알려진 다량의 실리카(최대 94%)를 함유한 물질도 DNA 정제에 사용되었습니다. 1990년 Boom et al 8에 의해 처음 기술되었습니다. 카오트로픽제(chaotropic agent)가 있는 상태에서 DNA에 결합한 다음 알코올이 포함된 완충액으로 세척하고 마지막으로 저염 완충액 또는 멸균 증류수에서 DNA를 용출합니다. Quantum Prep ®(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)는 규조토를 사용하여 개발된 DNA 추출 제품의 예입니다. 7

DNA 추출 키트도 진화했으며 샘플 용해에서 BioRobot EZ1 ® Advanced(QIAGEN) 및 Biomek과 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 일부 다운스트림 응용 프로그램에 이르기까지 프로토콜을 수행할 수 있는 반자동 및 완전 자동화 장비에 통합되어 있습니다. ® 4000 실험실 자동화 워크스테이션(Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA) 등. 피펫팅 오류 위험 감소, 샘플 전송 횟수 감소, 프로토콜 시간 단축은 이러한 장치의 장점 중 하나입니다. 그러나 사용 가능한 일부 장비 선택의 높은 비용을 감안할 때 신중하게 고려해야 합니다. 그들은 또한 DNA 정제 분리 및 검출이 달성되는 실리콘 마이크로칩인 소형 전체 화학 분석 시스템에 통합되었습니다. 7

음이온 교환 수지를 이용한 DNA 추출

음전하를 띤 핵산이나 오염 물질 또는 뉴클레아제와 같은 효소에 결합할 수 있는 양전하를 띤 화학 물질을 음이온 교환 수지라고 하며 혈액 샘플에서 DNA 추출 프로토콜의 일부로 사용되기도 합니다. 9

Chelex ® 100 수지(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)는 쌍을 이루는 이미노디아세테이트 이온을 포함하는 스티렌 디비닐벤젠 공중합체로 만들어집니다. 그것은 법의학 샘플에서 DNA 추출에 일반적으로 사용되는 뉴클레아제와 같은 다가 금속 이온을 결합하는 킬레이트 이온 교환 수지로 DNA 추출 프로토콜에 사용됩니다. 혈액을 생물학적 공급원으로 사용하는 초기 실험실 프로토콜은 1991년 Walsh et al 37에 의해 설명되었습니다. 이 초기 접근 방식을 기반으로 전혈 샘플에서 핵산 추출을 수행하기 위한 다른 프로토콜이 개발되었습니다. 소량의 샘플(혈액 1mL 미만)이 필요하며 일반적으로 다양한 단계와 시약이 포함된 단일 튜브 반응으로 수행됩니다. 혈액 샘플은 프로테이나제 K 및/또는 고온 배양을 사용하여 용해될 수 있으며, 침전물을 침전시키는 Chelex ® 100 수지를 추가하여 오염 물질을 제거합니다. 단일 가닥 DNA가 얻어지고 상층액에 현탁된 상태로 남아 있어 다운스트림 적용에 즉시 사용할 수 있거나 장기 보관을 위해 새 바이알로 옮길 수 있습니다. 37󈞓

Seligson et al 40은 전혈 샘플을 포함한 다양한 출처에서 핵산 샘플을 분리하기 위해 발명의 일부로 음이온 교환 물질을 사용했습니다. Seligson et al’s 프로토콜은 표면에 양으로 대전된 디에틸아미노에틸 셀룰로오스 그룹이 있는 수지를 포함하는 컬럼을 사용하여 DNA 백본의 음으로 대전된 인산염에 결합합니다. RNA 및 기타 불순물뿐만 아니라 컬럼에 결합하는 DNA의 강도는 이 핵산 분리 프로토콜에 사용되는 완충액의 염 농도 및 pH 조건을 통해 변경할 수 있습니다. 단백질 및 RNA와 같은 오염 물질은 중간 염 완충액을 사용하여 DNA 함유 컬럼에서 세척할 수 있습니다. 5,40

마그네틱 비드를 이용한 DNA 추출 방법

자기 분리를 이용한 핵산 추출 기술은 1990년대 초반부터 등장했습니다. 그들은 원래 1994년 Hawkins et al 41 및 2006년 Saiyed et al, 42,43에 의해 박테리아 세포 용해물에서 플라스미드 DNA를 추출하는 데 사용되었으며, 이들은 전혈 샘플에서 게놈 DNA 추출을 위한 네이키드 자성 나노입자를 사용하는 프로토콜을 개발하고 검증했습니다.

자성 입자는 자철광(Fe3O4) 또는 마그헤마이트(감마 Fe2O3)와 같은 하나 또는 여러 개의 자기 코어로 만들어지며 말단 작용기가 있는 폴리머, 실리카 또는 수산화인회석의 매트릭스로 코팅됩니다. Saiyed et al이 개발한 프로토콜에서 42,43 30 μL의 전혈을 동일한 부피의 1%(중량/부피[w/v]) SDS 용액과 혼합합니다. 튜브를 2~3회 뒤집어서 혼합하고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 10 마이크로리터의 자성 나노입자를 이 혼합물에 첨가한 다음 75μL의 결합 완충액(1.25M 염화나트륨 및 10% 폴리에틸렌 글리콜 6000)을 첨가합니다. 용액을 뒤집어서 혼합하고 상온에서 3분간 방치한 후 외부자석을 이용하여 자성펠렛을 고정화하여 상층액을 버린다. 자성 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 건조합니다. 자성 펠릿을 50μL의 TE 완충액에 재현탁하고 DNA에 결합된 자성 입자를 65°C에서 계속 교반하면서 배양하여 용출합니다. 42,43

적절한 프로토콜 선택

이상적인 추출 방법은 다음과 같은 기준에 맞아야 합니다. 민감하고, 일관되고, 빠르고, 사용하기 쉬워야 하며, 사용되는 국가에 따라 전문 장비나 생화학적 지식을 최소화하는 것이 중요할 수 있습니다. 또한 사용자에게 최소한의 위험을 초래하고 샘플의 교차 오염 가능성을 방지해야 합니다. 마지막으로, 그리고 가장 중요한 것은 선택된 DNA 추출 기술이 다운스트림 분자 응용 분야에서 사용할 준비가 된 순수한 DNA 샘플을 전달할 수 있어야 한다는 것입니다. 7,8,44

혈액 샘플에서 추출한 게놈 DNA의 품질과 양은 대부분의 시설에서 프로토콜을 선택할 때 고려하는 핵심 기능입니다. 다양한 파장(230nm, 240nm, 260nm, 280nm)에서 분광광도법을 사용하여 자외선 흡광도를 측정하는 것은 핵산 샘플의 순도와 농도를 결정하는 빠르고 효율적인 초기 방법입니다. 농도는 일반적으로 Beer–Lambert 법칙을 사용하여 260nm에서의 DNA 흡광도 판독값에서 계산됩니다. 핵산 샘플의 순도는 260/280 흡광도 비율로 평가되며 1.8𔃀.0 범위의 값이 일반적으로 허용되는 것으로 간주됩니다. 2.0과 2.2 사이의 260/230 흡광도 비율도 DNA 순도의 2차 척도로 적절한 것으로 간주됩니다. 11,45󈞛

Lahiri 등은 1991년에 전혈을 소스로 사용하여 DNA 추출을 위한 10가지 용액 기반 추출 방법을 비교한 연구를 발표했습니다. 그들은 이전에 유기 용매나 효소 소화를 필요로 하지 않는 그룹에서 이전에 개발한 프로토콜(방법 10a 및 10b)을 혈액에서 DNA 추출에 사용되는 이전에 발표되고 사용된 다른 9가지 방법과 비교했습니다. 그들의 연구에서 Lahiri 등은 앞서 언급한 방법을 사용하여 5명의 개인에게서 전혈 샘플을 세 번 추출했습니다. 그들은 260 nm에서 분광광도법 흡광도 판독을 사용하여 샘플에서 DNA 농도를 결정하고 260/280 흡광도 비율과 아가로스 겔 전기영동, 효소 분해 제한 및 서던 블롯을 통해 품질을 평가했습니다. 일부 프로토콜 기능과 결과에 대한 요약이 표 2에 나와 있습니다.

표 2 Lahiri 등의 DNA 추출 방법 비교 연구 요약 44
약어: DNA, 데옥시리보핵산 RNAse, 리보핵산.

테스트된 모든 프로토콜은 상대적으로 우수한 순도로 DNA를 분리할 수 있었지만(1.7에서 1.94까지의 260/280 비율), 방법 2, 5 및 6으로 얻은 DNA는 겔 전기영동에서 입증된 분해의 다른 양을 보여주었습니다. 테스트된 프로토콜 중 7개(방법 3𔃇)에서는 유기 용매 및/또는 페놀–클로로포름 또는 클로로포름과 같은 유해 물질을 사용해야 했습니다. 방법 1과 2는 유기 화합물을 사용하지 않았지만 방법 1이 가장 시간이 많이 소요되었습니다. 그것은 프로테이나제 K와 RNase A 모두와 함께 샘플을 30분 동안 배양하여 DNA 추출 시간을 5시간으로 줄임으로써 프로토콜 2에서 해결된 문제인 프로테이나제 K와 함께 밤새 배양해야 했습니다. 방법 10(버전 a 및 b)은 모든 DNA 분리 방법(1시간) 중 가장 빠르며 효소 분해 및 유기 용매/유해 물질 사용을 제거했습니다. 이 프로토콜의 두 버전은 약 260/280 비율로 테스트된 다른 프로토콜보다 유사하거나 더 높은 DNA 수율을 복구할 수 있었습니다. 그들의 연구 결과에 기초하여 Lahiri et al 44는 그들이 개발한 DNA 추출 방법이 테스트된 용액 기반 방법 중 가장 빠르고 안전한 것으로 결론지을 수 있었고 비슷한 품질과 양의 DNA를 회수할 수 있었습니다.

Abd El-Aal et al 48은 전혈 샘플에서 DNA 추출을 위한 수동 및 자동 추출 방법의 조합을 비교했습니다. 그들의 연구에는 페놀–클로로포름 정제, 마이크로파 열 충격을 사용한 DNA 추출, Wizard Genomic DNA 정제 키트(Promega Corporation)를 사용한 DNA 추출, 자기 분리(LC MagNA Pure Compact Instrument Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임)의 6가지 기술이 포함되었습니다. Biotek Instruments(미국 버몬트)의 Precision™ XS 마이크로플레이트 샘플 프로세서를 사용하여 부분적으로 자동화되었으며 마지막으로 MagNA Pure 정제 방법을 사용하여 자기 분리와 결합하여 Wizard SV 96 Genomic DNA Purification Kit(Promega Corporation)를 수정했습니다. 그들은 96개의 혈액 샘플을 추출하고 100μL을 초기 부피로 사용했습니다. 그러나 그들은 각 방법을 사용하여 얼마나 많은 샘플을 추출했는지, 수행한 실험 반복 횟수에 대해서는 언급하지 않았습니다. 그들의 결과는 0.50 μg/μL에서 0.98 μg/μL 범위의 최종 농도로 각 프로토콜에 대해 추출된 DNA를 보여주었습니다. 페놀–클로로포름, 수동 자기 분리, 결합된 Promega–MagNA Pure 방법은 상대적으로 유사한 DNA 농도를 나타내었지만(0.72𔂾.79 μg/μL), 자기 분리 및 전자 레인지 기술은 최고 및 최저 DNA 농도를 달성했으며, 각각 0.98 μg/μL 및 0.50 μg/μL. 그들의 비교에서 그들은 추출의 단순성을 위해 5가지 범주를 설정했습니다: 극도로 단순함, 단순함, 덜 단순함, 더 단순함, 어려움. 그러나 그들의 시스템은 각 범주에 사용되는 기준을 제시하지 못해 혼란을 줄 수 있습니다. 그러나 그들은 앞서 언급한 카테고리 시스템을 사용하여 페놀–클로로포름을 어려운 것으로 분류하고 자동화된 MagNA Pure를 매우 간단한 것으로 분류했습니다. 또한 자동화된 MagNA Pure 기술이 가장 비싸고 전자레인지가 가장 저렴한 방법으로 각 프로토콜의 비용에 대해 5가지 범주가 있습니다. 비용 범주도 정의되지 않았으며 연구에서 각 방법에 대한 특정 비용에 대한 실제 언급도 없었습니다. 앞서 언급한 연구 결과를 바탕으로 자동화 프로토콜을 사용한 자기 분리가 가장 비용이 많이 드는 방법임에도 불구하고 추출의 단순성, 추출된 DNA의 순도 및 속도 측면에서 가장 잘 수행된다는 결론을 내렸습니다. 그들은 또한 선택한 방법을 최적화하는 것이 필수적이라고 결론지었고 최소한의 출발 물질이 필요하고 비용 효율적이고 사용자 친화적이기 때문에 자기 분리 사용을 권장했습니다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이 비용 효율성이 어떻게 결정되었는지에 대한 언급은 없습니다. 48

Lee 등은 3개의 자동 추출 시스템을 사용하여 22개의 전혈 샘플에서 DNA를 추출했습니다. 비교된 3가지 프로토콜은 모두 고체상 추출 기술을 기반으로 했습니다. 자기 기반 DNA 분리 기술을 기반으로 하는 기타 프로토콜 MagNA Pure LC가 포함된 MagNA Pure LC 핵산 분리 키트 I(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 및 Magtration-Magnazorb DNA Common Kit-200N with Magtration System 12GC(Precision System Science) Co, Ltd, 도쿄, 일본). DNA 농도는 분광광도법으로 측정하고 순도는 260/280 비율, 아가로스 겔 상에서 DNA 전기영동 및 PCR로 평가하였다. 연구 결과를 검증하기 위해 통계적 분석을 수행하였으며, 이를 Table 3에 정리하였다.

표 3 Lee et al의 DNA 추출 기술에 대한 비교 연구 결과 요약 49
약어: DNA, 디옥시리보핵산 최소, 최소 최대, 최대 SD, 표준 편차.

Results showed no statistical difference between DNA concentrations obtained among the three commercial methods, but DNA purity was slightly lower for the Magtration-Magnazorb DNA Common Kit-200N when compared with the other two methods. DNA extracted was of similar quality based on results from PCR and electrophoresis on agarose gel. Therefore, they concluded that effectiveness for all systems was equivalent and that they all produced acceptable nucleic acid isolation. 49

Table 4 was adapted from a review published by Carpi et al 1 in 2011, where they reviewed DNA extraction methods used in a wide range of biological sources, including six methods used on whole blood samples. A summary of the three evaluated features for nucleic acid isolation methods, such as use of toxic compounds, cost per sample, and time required, is shown in Table 4.

Table 4 Summary of features evaluated for deoxyribonucleic acid (DNA) extraction methods reviewed by Carpi et al 1

Based on the methods included in Table 4, it can be noted that the magnetic bead-based method is the quickest DNA extraction protocol, requiring over 30 minutes to be performed, whereas all the other protocols require more than 3 hours. Also, the magnetic bead-based method is the most expensive one, costing more than ŭ per sample extracted. However, there is no mention in this review of the differences when comparing quality and quantity of nucleic acid isolated for each method. 1

Chacon-Cortes et al 50 evaluated cost-effectiveness and time efficiency of three available DNA extraction techniques from whole blood samples: a traditional salting out method, a modified salting out method, and a commercially available kit based on a solid-phase DNA extraction method QIAamp ® DNA blood maxi kits (QIAGEN ® Pty Ltd, Clifton Hill, VIC, Australia). The modified salting out protocol 25 replaced the sample overnight incubation step from the traditional salting out method, 18 required for contaminant removal using proteinase K, with the use of laundry detergent to reduce time of extraction to about 1 hour. Five microliters of whole blood from six breast cancer patients was manually extracted using each protocol, and techniques were compared in terms of quality and quantity of DNA extracted, as well as cost and time required. DNA quantity was measured using spectrophotometry, and DNA quality was assessed by both 260/280 ratio and agarose gel electrophoresis of PCR product. A summary of findings is presented in Table 5. 50

Table 5 Summary of results from comparative study of DNA extraction methods by Chacon-Cortes et al 50
Abbreviations: AUD, Australian dollars gDNA, genomic deoxyribonucleic acid.

As shown in Table 5, QIAGEN QIAamp DNA Blood Maxi Kits produced the highest yield and 260/280 ratio from all methods evaluated, with an average measure of 61.86 μg and 2.02, respectively, but traditional and modified salting out protocols both produced similar results in terms of DNA yield and 260/280 ratios. However, statistical analysis using analysis of variance showed that DNA yield and 260/280 ratio results were not significantly different for all three methods (NS-value of 0.110 and 0.05, respectively). On the other hand, the traditional salting out method required an overnight incubation step, and the QIAGEN QIAamp DNA Blood Maxi Kit was the most expensive of all the methods included, costing about 12.30 Australian dollars, almost seven times the modified salting out protocol. Therefore, based on these findings, the modified salting out protocol developed by Nasiri et al 25 proved to be the most cost-effective and time-efficient technique to isolate gDNA from whole blood samples. 50 Unfortunately, no other solid-phase extraction methods for DNA extraction were included in this study.

DNA extraction has evolved for the past 145 years and has developed into a diversity of laboratory techniques. This review highlights the currently available methods for DNA extraction from whole blood samples, and it summarizes comparison studies using different nucleic acid extraction approaches published to date. DNA extraction has evolved from solution and solid-phase manual techniques initially performed manually into incorporating these into automated methods. There is no consensus on a gold standard method for DNA extraction from whole blood samples, and they all differ in many different aspects. Studies comparing extraction techniques and highlighting their strengths and weaknesses are limited, and to our knowledge there is no publication that evaluates all approaches in terms of all possible features. Therefore, it is very difficult to determine the best choice available. Facilities around the world usually choose a method based on the availability of equipment, samples, and reagents, as well as considering speed, extraction efficiency and quality, technical requirements, and cost, but based on our review findings there is not enough scientific evidence to support these choices.

The authors of this publication certify that there are no conflicts of interest with any financial or scientific organization regarding the material discussed in the manuscript.

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A universal, rapid, and inexpensive method for genomic DNA isolation from the whole blood of mammals and birds

There is no ‘one’ procedure for extracting DNA from the whole blood of both mammals and birds, since each species has a unique property that require different methods to release its own DNA. Therefore, to obtain genomic DNA, a universal, rapid, and noncostly method was developed. A very simple biological basis is followed in this procedure, in which, when the blood is placed in water, it rapidly enters the RBCs by osmosis and causes cells to burst by hemolysis. The validity of extracting genomic DNA was confirmed by several molecular biological experiments. It was found that this method provides an efficient and versatile alternative for extracting bulk amounts of highly-qualified DNA from the blood of a wide range of species. This is the first manuscript that describes use of distilled water as the only eliminator of RBCs among all other known DNA extraction techniques.

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Step 3: Some Protease.

Now that we've busted open the cells, they've spilled their guts all over the place in our saliva solution. in this step we try and get rid of as much of the protein part of those guts as we can.

A protease is a type of enzyme that can break down other enzymes. Meat tenderizer, pineapple juice, and soft contact lens cleaning solution all contain (different) proteases. A tiny bit of any of those should reduce the amount of protein that precipitates out with our DNA later on.


Option 1: Most Realistic Looking Blood Model

5A. To make a model that looks a bit more like blood than the below two models,

  • pour 1/2 cup of corn syrup into a clear plastic cup (or use a jar with a lid if you want the children to keep it). This will be the plasma.
  • Add a scant 1/2 cup of red Fruit Loops for the red blood cells. If you are doing this for a large group, you could instead use Cheerios dyed red.
  • Add 1 cotton ball for the white blood cell.
  • Add a sprinkle of Fruit Loop crumbs for the platelets.

YOU WILL NEED PER CHILD: 1 clear plastic cup or jar, 1 plastic spoon, 1/2 cup of corn syrup,scant 1/2 cup of red Fruit Loops or Cheerios dyed red, 1 cotton ball, and a sprinkle of Fruit Loop or Cheerio crumbs


The extraction of DNA is pivotal to biotechnology. It is the starting point for numerous applications, ranging from fundamental research to routine diagnostic and therapeutic decision-making. Extraction and purification are also essential to determining the unique characteristics of DNA, including its size, shape and function.

DNA was first isolated by the Swiss physician, Friedrich Miescher, in 1869 while working in the laboratory of the biochemist Felix Hoppe-Seyler. This he did as part of a project to determine the chemical composition of cells which he saw as the means to unravelling the fundamental principles of the life of cells. Initially, he began this research by using lymphocytes drawn from lymph nodes but was unable to get sufficient quantities for analysis so switched to using leucocytes, white blood cells, which he gathered from pus found on fresh surgical bandages collected from a nearby surgical clinic. In the course of his work on leucocytes he noticed the precipitation of a substance when acid was added and that this dissolved following the addition of alkali. Mierscher decided to call the new substance 'nuclein' by virtue of its presence in the nuclei of the cell. Upon further analysis, Miescher noted that the chemical composition of the substance differed from proteins and other known molecules. He speculated that it played a central role in cells and was involved in the division of cells. Following this, Miescher developed a method for isolating nuclein from salmon sperm. Many advances have been made to the methods for extracting and purifying DNA since Miescher's time. From the 1950s routine laboratory extraction of DNA became reliant on the use of density gradient centrifuges. Until very recently most methods for extracting DNA remained complex, labour-intensive and time-consuming. They also provided only small quantities of DNA. Today there are many specialised extraction methods. These are generally either solution-based or column-based. The extraction of DNA has become much easier with the emergence of commercial kits and the automation of the process. Such changes have both sped up production and increased the yield of DNA.


Monocytes can be further separated from lymphocytes using density gradient centrifugation because they are less dense and slightly larger. In other words, monocytes are faster to float during centrifugation in a density gradient than lymphocytes. This separation can be done with either the combination of two different density layers 3 or one layer 4 . Following centrifugation, the monocytes should be found in a layer above the leukocytes and any other components of the whole blood that was included.

A few tips for isolating mononuclear cells:

  1. Avoid too much vortexing. This may activate or kill the cells.
  2. There may be residual RBCs following centrifugation. Use hypotonic lysis to remove these RBCs.

1. Get a sample of DNA

DNA is found in most cells of the body, including white blood cells, semen, hair roots and body tissue. Traces of DNA can also be detected in body fluids, such as saliva and perspiration because they also contain epithelial cells. Forensic scientists and Police officers collect samples of DNA from crime scenes. DNA can also be collected directly from a person using a mouth swab (which collects inner cheek cells). Find out more in the article Crime scene evidence.

2. Extract the DNA

DNA is contained within the nucleus of cells. Chemicals are added to break open the cells, extract the DNA and isolate it from other cell components.

3. Copy the DNA

Often only small amounts of DNA are available for forensic analysis so the STRs at each genetic locus are copied many times using the polymerase chain reaction (PCR) to get enough DNA to make a profile. Find out more in the article What is PCR?

Specific primers are used during PCR that attach a fluorescent tag to the copied STRs.

4. Determine the size of the STRs

The size of the STRs at each genetic locus is determined using a genetic analyser. The genetic analyser separates the copied DNA by gel electrophoresis and can detect the fluorescent dye on each STR. This is the same piece of equipment used in the lab for DNA sequencing.

5. Is there a match?

The number of times a nucleotide sequence is repeated in each STR can be calculated from the size of the STRs. A forensic scientist can use this information to determine if a body fluid sample comes from a particular person.

If two DNA profiles from different samples are the same, the chance that the samples came from different people is low. This provides strong evidence that the samples have a common source.


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수혈 시 기증자의 DNA는 어떻게 됩니까?

연구에 따르면 수혈 대상자의 기증자 DNA는 며칠 동안, 때로는 더 오래 지속되지만 그 존재가 유전자 검사를 크게 변경하지는 않을 것 같습니다. 수혈의 주성분인 적혈구에는 핵과 DNA가 없습니다. 그러나 수혈된 혈액에는 상당한 양의 DNA 함유 백혈구 또는 혈액 단위(약 1파인트)당 약 10억 개의 백혈구가 있습니다. 기증자 백혈구를 제거하기 위해 여과된 혈액 성분조차도 단위당 수백만 개의 백혈구가 있을 수 있습니다.

수사관은 특정 유전자의 검출 및 식별을 위해 극소량의 유전 물질을 증폭하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)이라는 과정을 통해 수혈 후 기증자 DNA를 검출했습니다. 남성 기증자로부터 수혈을 받은 여성 수용자의 남성 유전자를 증폭하기 위해 PCR을 사용한 연구에 따르면 기증자 DNA가 수용자에게서 최대 7일 동안 지속되는 것으로 나타났습니다. 그리고 대량 수혈을 받은 여성 외상 환자에 대한 연구에서는 최대 1년 반 동안 기증자 백혈구가 존재하는 것으로 나타났습니다.

그러나 이러한 모든 결과는 기증자 DNA가 보다 풍부한 수용자 DNA에 대해 선택적으로 증폭되는 매우 민감한 기술을 사용하여 발견되었습니다. 기증자와 수혜자 모두에게 공통적인 유전자가 증폭된 연구에서, 그 결과는 수혈받는 사람 자신의 DNA의 우세를 반영하여 기증자의 DNA가 상대적으로 중요하지 않은 침입자임을 보여줍니다.

참고: 이 질문은 W. McFarland, Winter Springs, FL에서 제출했으며 2009년 2월호에 인쇄되었습니다. 사이언티픽 아메리칸


비디오 보기: Leukocyte. leukocyte maturation process. leftward transition. rightward transition (칠월 2022).


코멘트:

  1. Cheney

    지금은 토론에 참여할 수 없습니다 - 매우 바쁩니다. Osvobozhus- 반드시 그들의 관찰.

  2. Joran

    미안하지만 실수를하고 있다고 생각합니다. 내 입장을 방어 할 수 있습니다. PM에 이메일을 보내 주시면 이야기하겠습니다.

  3. Eddie

    관심있는 주제에 대한 많은 양의 정보가있는 웹 사이트가 있습니다.



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