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특정 DNA 서열이 있는 세포를 분리할 수 있습니까?

특정 DNA 서열이 있는 세포를 분리할 수 있습니까?


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세포 하위 집단에 다른 세포 하위 집단에는 존재하지 않는 특정 DNA 서열이 게놈 내에 있다고 가정합니다. 그러한 하위 집단을 분리하는 것이 기술적으로 가능합니까? 그렇다면 어떻게?

세포에 대한 몇 가지 추가 정보. 모든 다른 하위 집단은 B 세포입니다. 그러나 이러한 하위 집단 중 하나만 특정 DNA 서열을 보유하고 있습니다. 우리는 이 시퀀스가 ​​전사되었다고 생각하지 않으며, 만약 그렇다면 매우 낮은 표현 방식으로 전사됩니다. 우리는 또한 이 서열이 두 대립유전자 중 하나에만 존재한다는 것을 알고 있습니다. 이 실험의 주요 아이디어는 다른 시점에서 이 하위 집단을 추적하는 것입니다. 전체 B 세포 집단과 비교하여 이 하위 집단의 상대적인 풍부도가 낮기 때문에 우리는 그들을 연구하기 위해 그들을 분리하고 싶었습니다(DNA 돌연변이, RNA 발현 등…).

감사 해요


강의 16: 재조합 DNA, 복제 및 편집

오늘 강의에서는 복제를 시작으로 중합효소연쇄반응(PCR), 마지막으로 게놈 편집으로 이어지는 순수 유전학에서 분자 유전학으로 초점을 이동합니다.

강사: 아담 마틴

강의 1: 소개를 환영합니다.

강의 2: 화학적 결합.

강의 3: Am의 구조.

강의 4: 효소와 메타.

강의 5: 탄수화물

강의 9: 염색질 개조.

강의 11: 세포, 단순.

강의 16: 재조합 DNA.

강의 17: 게놈과 DNA.

강의 18: SNP와 인간 .

강의 19: 세포 인신매매.

강의 20: 세포 신호 전달 .

강의 21: 세포 신호 전달 .

강의 22: 뉴런, 동작.

강의 23: 세포 주기 및 .

강의 24: 줄기 세포, Apo.

강의 27: 생명의 시각화.

강의 28: 생명의 시각화

강의 29: 세포 이미징 Te.

강의 32: 전염병.

강의 33: 박테리아와 An.

강의 34: 바이러스와 개미.

강의 35: 생식 Cl.

ADAM MARTIN: 좋습니다. 그래서 우리는 오늘 다시 기어를 바꿀 것입니다. 그리고 우리는 일종의 순수한 유전학에서 벗어나 분자 유전학에 대해 이야기하기 시작할 것입니다. 그리고 저는 개념으로 시작하고 싶습니다. 예를 들어 DNA 조각을 식별하고 정제하고 전파하여 나중에 사용할 수 있도록 한다고 가정해 보겠습니다. 그래서 이것을 하는 과정을 복제라고 합니다. 그리고 그것은 유기체에서 DNA 조각을 정화하고 전파하는 과정입니다.

그래서 이 강의의 목적은 여러분이 DNA 조각을 확인하고 싶다면 어떻게 해야 하는지를 알아보는 것입니다. 아마도 주어진 유전자를 포함하는 DNA 조각에 관심이 있을 것입니다. 계속해서 전파될 수 있는 상태에서 그 DNA를 얻는 방법은 무엇입니까? 원하는 DNA 조각을 어떻게 식별할 수 있습니까?

그래서 우리가 사용할 도구 중 하나는 유기체 박테리아를 도구로 사용하는 것입니다. 샘플 박테리아 세포를 여기에 그립니다. 대장균과 같은 것일 수 있습니다. 단지 일부 박테리아일 뿐입니다. 제가 몇 주 전에 세포에 대해 이야기했을 때 박테리아와 원핵 세포는 내부에 존재하는 핵양체라는 염색체를 가지고 있음을 기억하실 것입니다. 이것이 박테리아 염색체입니다.

그러나 박테리아는 또한 세포질에 존재하는 플라스미드라고 하는 여분의 염색체 DNA 조각을 가질 수 있습니다. 이들은 플라스미드입니다. 그리고 이 여분의 DNA 조각은 염색체와 독립적으로 복제됩니다. 그리고 그것들은 세균 세포에 남아 세균 세포가 분열할 때 이 세균 세포의 딸들에게 전달될 수 있습니다.

따라서 개별 플라스미드에 초점을 맞추면 플라스미드가 어떻게 생겼는지에 대해 종종 항생제 내성을 부여하는 카세트나 유전자가 있습니다. 그리고 그것이 종종 이 박테리아가 이 플라스미드를 품고 있는 이유입니다. 왜냐하면 그들이 포식자 유기체의 특정 항생제에 노출되면 일종의 이점을 주기 때문입니다. 그래서 이것은 항생제 내성을 부여할 것입니다.

한 가지 일반적인 예는 암피실린 저항성이며, 옆에 R이 있는 amp로 축약하겠습니다. 그러나 이러한 플라스미드가 세균 세포에서 세균 세포로 전파되기 위해서는 복제를 겪을 수 있어야 합니다. 따라서 그들은 또한 복제 기점(origin of replication)으로 알려진 것을 가지고 있으며, 이는 종종 ori로 약칭되는데, 기본적으로 이 플라스미드가 복제되어 혈장의 사본이 다음 세대의 박테리아에게 전달되도록 합니다.

그리고 우리는 박테리아에서 이 플라스미드 시스템을 이용할 수 있습니다. 왜냐하면 우리가 외래 DNA 조각을 취할 수 있기 때문입니다. 그리고 이 외래 DNA는 진핵생물 기원일 수 있습니다. 진핵생물의 DNA 조각을 이 플라스미드 내부에 삽입할 수 있습니다. 그리고 우리는 기본적으로 플라즈마를 일종의 플랫폼이나 벡터로 사용하여 우리가 관심을 가질 만한 DNA 조각을 운반하고 박테리아를 사용하여 해당 DNA를 복제하고 그 후손에게 전달하여 본질적으로 클론을 가질 수 있습니다. 그리고 당신은 주어진 박테리아 집단에서 이 DNA의 클론을 가지고 있습니다.

다시 말하지만, 이것은 기원과 아마도 그것에 대한 암피실린 내성을 가질 것입니다. 그렇다면 박테리아에 플라스미드가 있는지 여부를 어떻게 결정할 수 있습니까? 박테리아에 이 플라스미드가 있는지 여부를 결정하기 위해 할 수 있는 실험을 생각해 볼 수 있습니까? 스티븐?

청중: 암피실린을 추가할 수 있습니다. 그러면 플라스미드와 함께 살아남을 것입니다.

아담 마틴: 맞습니다. 그래서 Stephen이 제안한 것은 이 박테리아에 플라스미드가 있는지 여부를 알고 싶다면 배지에 암피실린을 추가할 것이라는 것입니다. 그리고 박테리아에 플라스미드가 없으면 성장할 수 없습니다. 그러나 혈장이 있으면 암피실린 내성을 부여하는 이 유전자를 암호화하므로 성장할 수 있습니다. 그래서 그것은 바로 맞습니다. 따라서 항생제가 포함된 배지에서 단순히 플라스미드를 성장시킴으로써 주어진 플라스미드를 가진 박테리아를 선택할 수 있습니다.

이제 DNA 조각을 복제하는 단계를 살펴보고 싶습니다. 프로세스가 어떻게 작동하는지 볼 수 있도록 일련의 순서화된 단계로 진행합니다. DNA를 자르는 단계부터 시작하겠습니다. DNA를 절단한 후 조각을 함께 섞습니다. 조각을 함께 섞으면 결찰이라는 작업을 하게 됩니다. 잠시 후에 설명하겠습니다. 그리고 마지막으로 우리가 원하는 외래 DNA 조각을 가진 플라스미드를 선택하는 것으로 끝낼 것입니다. 그리고 이것은 재조합 DNA로 알려져 있습니다. 왜냐하면 한 유기체의 DNA 조각을 인간과 같은 진핵 유기체일 수 있기 때문입니다. 그리고 박테리아와 같은 원핵 세포에서 추출한 DNA 조각을 사용합니다.

그래서 우리는 일종의 선택 과정이 있습니다. 그래서 우리는 이것을 단계별로 진행할 것입니다. 그리고 DNA 절단부터 시작하겠습니다. 알겠죠? 그래서 DNA를 절단합니다. 우리는 어떤 종류의 효소가 DNA를 절단할 것이라고 생각합니까? 일반적으로 슬라이드의 내용만큼 구체적이지 않습니다. 어떤 종류의 효소가 DNA를 절단합니까? 효소의 이름이 어떻게 지정되는지 생각해 보십시오.

ADAM MARTIN: 네, 그래서 Stephen이 DNase를 제안했는데 정말 좋은 제안이죠? 따라서 DNA를 절단하는 효소는 DNase입니다. 이에 대한 다른 단어는 뉴클레아제입니다. 일종의 뉴클레아제입니다. 그리고 우리가 이야기할 뉴클레아제의 유형은 엔도뉴클레아제가 될 것입니다. 우리는 DNA 복제의 맥락에서 말단에서 DNA를 씹는 엑소뉴클레아제에 대해 이야기했습니다.

그러나 엔도뉴클레아제는 DNA의 한 조각을 인식하고 중간에서 절단하는 뉴클레아제라는 것입니다. 따라서 끝이 필요하지 않습니다. 중간에 잘게 썰어줍니다. 그리고 일종의 엔도뉴클레아제가 있는데, 이것을 제한 엔도뉴클레아제라고 합니다. 그들은 많은 다른 박테리아에 기본적으로 존재하는 뉴클레아제입니다. 그리고 이러한 제한 엔도뉴클레아제는 본질적으로 DNA 서열을 살펴보고 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하고 그 서열을 바로 절단합니다.

그래서 여기에 보여드릴 몇 가지 예가 있습니다. 첫 번째는 이 EcoR1 제한 엔도뉴클레아제입니다. E. coli의 EcoR1은 GAATTC 서열을 인식합니다. 그래서 그것은 이 6개의 뉴클레오타이드를 인식합니다. Sequence와 그것은 G와 A 사이의 상단 가닥과 G와 A 사이의 하단 가닥에 있는 이중 가닥 DNA를 절단합니다. 알겠습니다. 그리고 두 컷이 엇갈린 것을 볼 수 있습니다. 그래서 이 절단이 이루어지면 DNA에는 두 개의 끝이 남게 되고 끈적끈적해집니다. 각 끝에 5개의 프라임 돌출부가 있기 때문입니다.

따라서 각 끝은 이 TTAA 시퀀스를 갖습니다. 그리고 이러한 뉴클레오티드 염기는 상보적 서열과 염기쌍을 이룰 수 있습니다. 따라서 이 시퀀스는 끝 AATT가 있는 시퀀스와 염기쌍을 이룰 수 있습니다. 그래서 제가 여기서 생성한 이 두 끝은 서로 달라붙을 수도 있고, TTAA 시퀀스가 ​​있는 다른 끝이 붙어 있을 수도 있습니다.

또 다른 예는 이 Kpn1 엔도뉴클레아제입니다. 그리고 이것은 다른 박테리아에서 나온 것입니다. 그러나 다시 두 가닥의 DNA를 절단합니다. 그리고 이번에는 맨 위 가닥을 시퀀스 아래로 더 잘랐습니다. 그리고 그것은 3중 돌출부로 알려진 것을 생성합니다. 그러나 다시, 당신은 오버행이 있습니다. 그래서 이것은 끈적 끈적한 끝이 있다고 알려진 것입니다. 다시 말하지만, 이러한 뉴클레오티드는 상보적 서열과 염기쌍을 형성할 수 있습니다.

마지막으로 말씀드릴 제한효소의 종류는 E.coli와는 다른 효소인 EcoR5입니다. 그리고 이것은 브레이크를 생성하지만, 이번에는 두 DNA 가닥의 같은 위치에서 자릅니다. 그리고 그것은 무딘 끝으로 알려진 끝을 생성합니다. 왜냐하면 돌출부가 없고 기본적으로 끈적한 끝이 하는 것처럼 상보적인 끝을 인식하는 뉴클레오티드가 없기 때문입니다. 알겠죠?

따라서 이들은 광범위한 박테리아에 존재하는 매우 다양한 유형의 제한 엔도뉴클레아제 중 몇 가지입니다. 이제 DNA를 절단할 수 있는 도구가 있으므로 두 가지 다른 소스에서 DNA를 절단할 수 있습니다. 그리고 저는 여기에 그것을 설명했습니다. 벡터는 플라스미드 DNA가 일반적으로 언급되는 것입니다. 그래서 우리는 일반적으로 플라스미드의 이 원핵생물 부분, 벡터 DNA, 그리고 우리가 삽입하려고 하는 부분인 외래 DNA인 삽입물을 참조합니다. 그것은 현장에서 사용되는 일종의 용어입니다.

그래서 여기에 플라스미드가 있습니다. 플라스미드처럼 보입니다. 복제의 기원이 있습니다. 암피실린 저항성이 있습니다. 그리고 그것은 이 EcoR1 부위를 가지고 있습니다. 이것은 이 DNA 서열이 GAATTC를 가진다는 것을 의미합니다. 알겠죠? 그래서 이것은 이 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식될 것입니다. 그리고 이 효소를 EcoR1으로 자르면 선형 조각으로 시작하죠? 그래서 저는 오전 6시에 여기에서 엔지니어링을 시작했습니다.

제 플라스미드 DNA가 있고 EcoR1 사이트에서 절단했다고 가정해 보겠습니다. 그런 다음 나는 그것을 쪼갠다. 원을 자르면 이제 선형 DNA 조각이 생깁니다. 알겠죠? 하지만 끈적 끈적한 끝이 있습니다. 그리고 이 끈적끈적한 끝은-- 그래서 이것이 외부 DNA 조각인 척합니다. 이것은 제 진핵생물의 DNA입니다. 엘라스틴 유전자를 가지고 있다고 가정해 봅시다. 그리고 이것도 끝이 있습니다. 그리고 그것들이 EcoR1 말단이라면 플라스미드의 끈적끈적한 말단에 달라붙을 수 있을 것입니다.

그리고 만약 당신이 단지 하나의 스틱을 얻는다면, 이제 당신은 나란히 있는 두 개의 다른 조각인 이 DNA 조각을 갖게 됩니다. 그러나 그것은 세포질의 공간에서 움직일 것입니다. 그리고 어느 시점에서 인식되어 다른 EcoR1 끝에 붙을 수 있습니다. 그리고 나서 여러분은 이제 원형의 DNA 조각을 갖게 되었습니다. 그러나 이제 여러분의 원형 DNA 조각에는 벡터 내부에 존재하는 외래 DNA 조각이 있습니다. 이것은 일종의 포스터 테이프입니다.

그래서 보여드리고 싶었습니다. 분자 생물학을 할 때 끝이 서로 달라붙는 것과 최종 제품을 위해 어떻게 연결되는지를 상상해야 합니다. 자, 여러분이 DNA를 얻었다고 가정해 봅시다. 그리고 여러분의 DNA는 인간이나 파리 또는 여러분이 가장 좋아하는 진핵생물의 진핵생물 DNA일 수 있습니다. 그리고 그 유기체의 게놈에는 많은 제한 부위가 있을 것입니다. 하지만 잘게 자르면 양쪽에 EcoR1용 끈적끈적한 끝이 있는 다양한 조각을 얻을 수 있습니다.

그런 다음 벡터와 삽입물을 함께 혼합하면 해당 삽입물이 벡터에 통합될 가능성이 있습니다. 그리고 이것이 존재하고 함께 연결되면 이것을 박테리아에 넣을 수 있습니다. 그러면 복제됩니다. 그래서 우리는 자르기에 집중했지만, 테이프에서 보여드린 것처럼 이것들을 함께 섞으면 끝이 끈적끈적하게 붙어 서로 달라붙게 됩니다.

그리고 결국에는 삽입물을 갖게 되는 상황이 발생합니다. 따라서 관심 유전자와 벡터 DNA가 있을 수 있는 삽입물이 여기에 있습니다. 그러나 이러한 것들이 처음에 서로 붙을 때 모든 것이 공유적으로 부착된 단일 분자가 없습니다. 그렇죠? 염기쌍 상호작용을 통해 서로 달라붙기 때문에 두 돌출부 사이에 이러한 염기쌍 상호작용이 있습니다.

여기에서 무슨 일이 일어나고 있는지 생각해보면, 처음에 EcoR1에 대해 생각하고 있다면 다음과 같은 서열을 갖게 됩니다. 아, 죄송합니다. 이것은 C여야 합니다. 이것은 뉴클레오티드 서열이지만 고정될 때 함께, 상단 가닥은 이 아데노신에 자유 5-프라임 포스페이트를 가질 것이고, 이 아데노신과 이 구아노신 사이에는 공유 결합이 없을 것입니다. 그래서 그것이 상단 가닥이 보일 것입니다. 맨 아래 가닥은 DNA 백본을 따라 공유 결합이 있는 다음과 같이 보일 것입니다. 죄송합니다. 거기에 돌연변이가 있었다.

그리고 이것은 더 넓은 순서로 통합됩니다. 그리고 이 바닥 가닥은 여기에 자유 5-프라임 포스페이트가 있고 여기에는 자유 3-프라임 하이드록실이 있습니다. 하지만 여기에는 공유 결합이 없습니다. 여기에는 공유 결합이 없습니다. 맞죠? 그래서, 이 단계에서, 당신은 단 한 조각의 DNA도 가지고 있지 않습니다. 염기쌍 상호작용을 통해 서로 상호작용하는 두 개의 DNA 조각이 있습니다. 그래서 결국에는 단일 DNA 조각이 되기를 원합니다. 그래서 당신은 다음으로 알려진 단계를 수행해야 합니다. 죄송합니다. 제 인산염이 방해가 됩니다.

그러나 여러분은 연결이라고 알려진 것을 수행하고 싶습니다. 여기서 뉴클레오티드 염기쌍 상호작용을 통해 서로 달라붙는 것을 취하고 DNA 리가아제라고 하는 일종의 효소를 추가하여 여기와 여기에서 공유 결합의 형성을 촉매합니다. 그래서 DNA 리가아제는 여기에 3개의 5-프라임 포스페이트와 자유 3-프라임 히드록실이 있는 경우 이 두 염기와 DNA 사이의 포스포디에스테르 결합 형성을 촉매하는 효소입니다.

그래서 이 DNA 리가아제는 포스포디에스테르 결합을 형성합니다. 그리고 당신은 유대감이 없는 상태에서 유대감을 갖게 됩니다. 그러면 결국에는 각각의 염기쌍 사이에 공유 결합이 있는 이 서열을 얻게 될 것입니다. 여기 보이는 것은 EcoR1 사이트를 다시 만든 것입니다. 따라서 서로를 인식하고 서로 달라붙는 두 개의 EcoR1 끈적끈적한 끝을 얻은 다음 함께 연결하면 해당 뉴클레아제 부위를 재생성하여 EcoR1 효소로 다시 절단할 수 있습니다.

이제 계속 진행합니다. 바로 여기로 이동하겠습니다. 그래서 마지막 단계는 일단 우리가 이 삽입물을 가진 DNA 조각을 얻는 것입니다. 그리고 우리가 진핵 유기체에서 DNA 조각을 찾으려고 한다고 가정해 봅시다. 우리는 동물로 시작할 수 있습니다. 우리는 염색체 DNA를 추출하여 제한효소로 소화한 다음 동일한 제한효소로 벡터를 소화해야 합니다. 그리고 나서 우리는 이 DNA 조각을 무작위로 다른 벡터에 삽입하여 이 플라스미드 중 하나를 얻은 각 박테리아가 진핵생물 기원의 다른 DNA 조각을 복제하도록 할 것입니다.

그리고 이것은 DNA 라이브러리로 알려진 것입니다. 그래서 이것은 DNA 라이브러리를 만드는 것입니다. 그리고 DNA 라이브러리는 본질적으로 어떤 출처에서 온 서로 다른 DNA 조각들의 모음입니다. 알겠죠? 그러나 다른 박테리아 클론은 그 DNA의 다른 조각을 복제할 것입니다. 이제 과제는 건초 더미에서 바늘을 찾는 것입니다. 그렇죠? 당신은 당신이 관심 있는 DNA의 한 조각을 찾으려고 노력하고 있습니다.

그리고 관심 있는 DNA 조각을 찾는 데 사용할 수 있는 몇 가지 전략에 대해 이야기하겠습니다. 저는 선택에 중점을 둘 것입니다. 하지만 먼저 DNA 조각을 검색할 수 있는 두 가지 다른 유형의 방법을 구별하고 싶습니다. 화면을 만들 수 있습니다. 이것은 우리가 월요일에 이야기한 것과 비슷합니다. 여기에서 전체 개체군을 살펴보고 주어진 표현형을 찾습니다.

그래서 파리의 경우, 우리는 Morgan의 연구실이 눈 색깔의 차이를 찾는 방법에 대해 이야기했습니다. 그리고 그것은 그들이 원하는 것을 찾기 위해 수많은 일반 파리를 조사했기 때문에 화면이었습니다. 또 다른 전략은 유기체를 일종의 선택적 조건에서 자라게 하여 원하는 것이 아닌 모든 것을 제거하는 선택이라고 하는 것을 하는 것입니다. 그리고 나서 원하는 유기체만 자라도록 허용합니다. 그래서 이것을 선택이라고 합니다.

그리고 선택의 몇 가지 예를 보여드리겠습니다. 여러분이 이것이 어떻게 작동하는지 이해할 수 있도록 하기 위해서입니다. 그래서 제가 첫 번째로 예를 들겠습니다. 항생제 내성입니다. 그리고 Stephen이 강의 초반에 친절하게 지적했듯이 이 플라스미드를 차지하는 박테리아를 선택할 수 있는 방법은 항생제가 있는 곳에서 자라는 박테리아를 선택하는 것입니다. 따라서 박테리아 개체군이 있고 이것이 항생제에 민감해지기 시작했다고 가정해 봅시다. 내성이 있는 균주의 DNA로 그것들을 변형시킬 수 있습니다.

그리고 그 내성 균주에는 항생제 내성을 부여하는 유전자가 있는 플라스미드가 있을 수 있습니다. 이 경우 이 민감한 박테리아가 이를 흡수하고 항생제가 들어 있는 접시에서 배양하면 집락이나 관심 있는 DNA 조각을 차지한 세포의 클론, 이 경우에는 항생제 내성을 부여하는 DNA 조각입니다. 모두 어떻게 작동하는지 봅니까? 따라서 이 항생제 내성 유전자를 흡수한 세포만 여기에서 자라도록 선택하는 것입니다.

이제 효모의 다른 예를 사용하겠습니다. 여기에는 기능적 보완이 포함됩니다. 그리고 저는 필수 아미노산의 생합성과 관련된 것부터 시작하겠습니다. 그리고 나서 더 흥미로운 사례로 가겠습니다. 인간의 세포 분열의 주 조절자를 확인하는 것과 관련된 실험을 포함하는 사례입니다. 그러나 우리는 아미노산 생합성부터 시작할 것입니다.

그리고 영양요구성으로 알려진 효모의 돌연변이가 있습니다. 그리고 이들은 필수 영양소를 생산하지 못하는 돌연변이 효모 또는 돌연변이 미생물입니다. 따라서 영양요구성은 필수적인 영양소를 만들지 못하는 돌연변이입니다. 그래서 영양제를 만들지 못합니다. 그리고 영양요구성의 반대를 원영양체라고 합니다. 원시영양생물은 본질적으로 정상적인 기능을 하는 미생물로, 성장하고 생존하는 데 필요한 모든 필수 영양소를 생산할 수 있습니다. 알겠죠? 그래서 이것은 모든 영양소를 생산합니다.

그래서 당신이 류신에 대한 영양요구성을 가지고 있다고 가정해 봅시다. 그래서 당신은 류신을 제공하지 않으면 성장하지 못할 것이라는 긴장이 있었습니다. 그래서 우리는 류신 영양요구성으로 시작할 것입니다. 이 류신 영양요구성에 결함이 있는 유전자를 확인하고 싶다고 가정해 보겠습니다.

당신은 이와 유사한 전략을 수행할 것입니다. 여기서 당신은 변형되는 영양요구체를 갖게 될 것입니다. 그래서 당신의 영양요구성은 여기 아래에 있습니다. 그리고 그 균주를 어떤 유기체의 DNA로 변형하시겠습니까? 기능적 유전자를 확인하려는 경우 해당 유기체로 변형할 DNA를 생성하기 위해 어떤 유기체를 사용하시겠습니까?

아담 마틴: 하비에르의 말이 맞습니다. 프로토트로프를 사용하시겠죠? 그래서 이 경우에, 당신은 prototroph의 DNA를 사용할 것입니다. 왜냐하면 prototroph는 그 유전자의 기능적 사본을 가지고 있기 때문입니다. 류신을 첨가하지 않고도 자랄 수 있기 때문에 그렇습니다. 그리고 나서 원영양체의 DNA로 변형된 영양요구성 돌연변이체를 미디어에서 재생할 수 있습니다. 그리고 언론의 재산은 무엇이어야 합니까? 류신이 있어야 하나요 아니면 없어야 하나요? 카르멘?

아담 마틴: 그것은 없어야 합니다. 정확히 맞아요. 그래서 당신은 류신이 부족하거나 류신이 마이너스인 접시를 보게 될 것입니다. 그리고 갑자기 류신을 키울 수 있는 식민지를 선택합니다. 그래서 당신은 이 클론에서 류신 생합성의 기능을 회복시켰고 그것을 다시 원영양체로 만들었습니다.

좋습니다, 이것은 기능적 보완으로 알려진 것입니다. 왜냐하면 여러분은 어떤 기능에 결함이 있는 세포를 취하고 그것을 보완하고 있기 때문입니다. 당신은 표현형을 보완하거나 구하고 있습니다. 이제, 전직 효모 유전학자로서, 나는 류신의 맥락에서 아미노산 생합성과 기능적 보완을 그다지 흥미롭지 않다고 생각합니다. 그래서 저는 효모 세포 주기 돌연변이를 포함할 실험과 관련된 마지막 예를 하나 제시하고자 합니다.

그리고 저는 인간의 세포 분열의 마스터 레귤레이터의 복제로 이어진 실험에 대해 말씀드리겠습니다. 그리고 그것은 효모 돌연변이, 특히 효모 세포 주기 돌연변이를 포함합니다. 그리고 이러한 효모 세포 주기 돌연변이는 조건부 돌연변이로 알려진 것입니다. 그들은 조건부 돌연변이로 분리되어 이러한 돌연변이가 특정 조건에서는 성장할 수 있지만 다른 조건에서는 성장할 수 없음을 의미합니다. 그리고 구체적으로, 그들이 사용한 조건은 온도입니다. 그래서 그들은 온도에 민감한 돌연변이입니다.

효모 세포는 25도에서 자랄 수 있지만 37도에서는 자랄 수 없습니다. 그래서 이것은 온도에 민감한 돌연변이로 알려져 있습니다. 한 온도에서 돌연변이를 번식시킬 수 있지만 온도를 높이면 성장을 멈추는 것을 볼 수 있습니다. 정상적인 야생형 기능성 효모는 두 온도 모두에서 자랄 수 있기 때문에 돌연변이 표현형을 볼 수 있습니다. 이것은 돌연변이의 특별한 유형입니다.

그리고 저는 훌륭한 효모 유전학자인 Paul Nurse가 수행한 실험에 대해 말씀드리겠습니다. 그리고 그가 한 것은 이 효모 세포 주기 돌연변이를 사용하여 현재 사이클린 의존성 키나아제 또는 줄여서 CDK로 알려진 것에 대한 인간 유전자를 식별한 것입니다. 이것은 효모에서 인간에 이르기까지 모든 유기체에서 세포 분열의 마스터 레귤레이터입니다. 알겠죠? 그러나 그는 이 유전자를 식별하기 위한 모델 시스템으로 효모를 사용했습니다.

그리고 그 과정은 그가 효모 세포를 취하는 것이었습니다. 그리고 Paul Nurse는 막대 모양의 세포인 분열 효모 세포를 연구했습니다. 그리고 그는 효모 돌연변이를 확인했습니다. 효모 돌연변이체. 그리고 그는 효모의 CDK 유전자에 돌연변이가 있었습니다. 그는 그 당시에 그것을 정말로 몰랐습니다. 그러나 효모 CDK 돌연변이--그가 알고 있는 것은 이 돌연변이가 수많은 유형의 효모에서 세포 주기에 결정적으로 관여한다는 것입니다. 그래서 그는 이것이 중요한 유전자라는 것을 알았습니다.

그리고 그가 하고 싶었던 것은 인간이 같은 방식으로 기능할 수 있는 동등한 유전자를 갖고 있는지 확인하는 것이었습니다. 따라서 이 CDK 돌연변이가 있고 아무 것도 하지 않는다면 37도에서 자라지 않을 것입니다. 알겠습니다. 하지만 그가 한 일은 DNA 라이브러리를 가져오는 것이었습니다. 제가 전에 보여드린 것과 유사하게 유기체에서 DNA를 잘라낸 것입니다. 이 경우 그는 인간 DNA 라이브러리를 사용하고 있습니다. 그리고 그는 특정 유형의 라이브러리를 사용했지만 지금은 건너뛰고 나중에 다시 설명하겠습니다.

그래서 그는 인간 DNA 라이브러리를 사용했습니다. 그건 그냥 인간 출처의 DNA 조각 모음입니다. 알겠죠? 그래서 그는 인간 DNA를 취해서 효모 플라스미드에 넣고 그 인간 DNA로 효모를 변형시킵니다. 그리고 그는 CDK 돌연변이를 보완할 수 있는 DNA 조각을 찾고 있습니다. 즉, 효모 세포가 37도의 비허용 온도에서 성장할 수 있음을 의미합니다.

그래서 그는 접시에서 37도의 허용되지 않는 온도에서 자라는 효모 군체를 찾습니다. 따라서 이 돌연변이에 대해 아무 것도 하지 않고 DNA를 변형하지 않으면 아무 것도 자라지 않을 것입니다. 하지만 그는 이 돌연변이의 표현형을 구한 인간 DNA 조각을 확인했습니다. 알겠죠? 그래서 이들은 CDK에 대한 인간 유전자를 가지고 있는 효모이며 이제 자랍니다.

이것은 기능적 보완 실험입니다. 왜냐하면 이제 이 효모의 성장을 효모 유전자가 아니라 인간 유전자로 구하고 있기 때문입니다. 그리고 이 인간 CDK 유전자는 진핵생물 전체에서 매우 보존되어 있어 효모 세포에서 여전히 기능할 수 있습니다. 이것은 꽤 놀라운 일입니다. 여기에서는 실험을 간략하게 설명합니다. 25도에서 이 효모 돌연변이체는 성장하여 집락을 형성할 수 있습니다. 그리고 그 온도에서 효모를 다른 인간 DNA 조각으로 변형할 수 있습니다.

대부분의 인간 DNA는 원하는 대로 되지 않을 것입니다. 당신은 건초 더미에서 바늘을 찾고 있습니다. 그래서 이것들의 대부분은 37도에서 자라지 않을 것입니다. 하지만 당신은 인간 CDK를 얻고 이 돌연변이 균주의 성장을 회복시키는 이 사람을 찾고 있습니다. 자, 자라고 있는 세포 군집을 얻게 됩니다. 그리고 붐, Paul Nurse는 노벨상을 받았고 효모 분야의 다른 분야에서도, 또는 세포 주기 돌연변이에 대해 연구하는 많은 사람들을 얻었습니다. 이것은 많은 효모 세포 주기 유전학자들로 2001년 노벨상을 수상한 실험 중 하나입니다.

좋아요, 그래서 건초 더미에서 바늘을 찾는 방법에 대해 이야기했습니다. 그리고 이것은 유기체의 게놈 서열을 모를 때 더 일반적이었습니다. 하지만 이제 유기체의 게놈 서열을 아는 것이 시험관 내에서 DNA 조각을 복제하고 증폭하는 데 어떻게 도움이 되는지 말씀드리고 싶습니다. 그래서 저는 중합효소연쇄반응(PCR)으로 알려진 접근법에 대해 말씀드리겠습니다.

그리고 PCR은 시험관 내 방법입니다. 따라서 본질적으로 DNA를 증폭하기 위한 시험관 내 접근 방식입니다. 그리고 당신이 DNA 조각을 가지고 있다고 가정해 봅시다. 그것은 게놈에 있는 DNA 조각일 수 있습니다. 그리고 당신은 이 DNA의 서열을 알고 있습니다. 그리고 그것은 두 가닥 사이에 염기쌍을 가지고 있습니다. 따라서 일반적으로 DNA 복제가 발생하려면 무엇이 필요합니까? 여기서 무슨 일이 일어나야 합니까? 중합효소가 지금 들어갈 수 있습니까? 아니요? 왜 안 돼? 마일?

AUDIENCE: DNA는-- 그들이 서로에게서 [INAUDIBLE] 멀리 [INAUDIBLE] 하려고 할 것이기 때문에 당신은 [INAUDIBLE]해야 합니다.

아담 마틴: 응, 긴장을 풀어야 하지, 그렇지? 따라서 먼저 변성해야 합니다. 그래서 만약 당신이 그것을 자연적으로 한다면, 이제 당신은 두 개의 단일 가닥 DNA 조각을 갖게 된 것입니다. 그렇죠? 이제 중합효소는 그것을 복제하기 위해 무엇이 필요할까요? 그래, 제레미?

아담 마틴: 입문서. 바로, 맞죠? 그리고 만약 당신이 그 서열을 안다면, 당신은 회사가 여기에 있는 정확한 서열과 여기에 있는 염기쌍인 프라이머를 합성하도록 할 수 있습니다. 그리고 바로 거기에 프라이머의 5-프라임 끝을 그릴 것입니다. 그리고 이제 이 프라이머는 여기에 유리 3-프라임 하이드록실을 가지고 있습니다. 폴리머라제를 추가하면 여기에서 이 바닥 가닥을 합성합니다. 그래서 이것은 정방향 프라이머로 알려져 있습니다.

그리고 다른 가닥에서는 여기에서 이러한 염기를 보완하는 프라이머를 설계할 수 있습니다. 다시 말하지만, 다섯 프라이머 끝이 나왔습니다. 이것은 역 프라이머로 알려져 있습니다. 그리고 나서 DNA 중합효소가 반대 가닥을 합성하도록 할 수 있습니다.

좋습니다. 여기 단계는 먼저 변성하는 것입니다. 따라서 첫 번째 단계는 이중 가닥 DNA인 DNA를 녹이거나 변성시키는 것입니다. 따라서 이중 가닥 DNA를 변성시킵니다. 이것은 일반적으로 섭씨 90도 이상에서 수행됩니다. 그리고 다음 단계는 일단 이 단일 가닥 DNA 조각을 갖게 되면 반대 가닥에 어닐링하는 프라이머가 존재하도록 행동할 수 있습니다. 그래서 프라이머 어닐링을 할 수 있습니다.

그리고 이것은 일반적으로 섭씨 50도에서 60도 사이에서 이루어집니다. 프라이머가 이제 염기쌍을 형성하여 모든 것이 변성되지 않도록 냉각해야 합니다. 따라서 이 프라이머가 동족 서열과 염기쌍을 인식할 수 있도록 냉각시켜야 합니다. 그런 다음 프라이머가 템플릿에 어닐링되면 DNA 중합효소를 추가하여 새로운 가닥을 합성할 수 있습니다. 그래서 DNA는 새로운 가닥 합성을 위해 중합합니다. 그리고 이것은 일반적으로 약 섭씨 70도에서 수행됩니다.

그리고 이 과정을 계속 반복할 수 있습니다. 그리고 각 단계에서 이 두 프라이머 사이에 있는 DNA의 양을 두 배로 늘립니다. 그래서 제가 그냥-- 이것은 이것을 설명하는 그림일 뿐입니다. 유인물과 온라인에 있습니다. 기본적으로 원래의 이중 가닥 DNA 조각이 있습니다. 당신은 그것을 변성시키고 프라이머가 어닐링하도록 허용합니다. 새로운 가닥 합성.

그런 다음 이 새로운 이중 가닥 DNA 조각을 가져와 변성시킵니다. 프라이머는 그 새로운 가닥에 어닐링하고 이제 새로운 가닥을 얻습니다. 그리고 당신은 이 주기를 계속해서 계속 반복합니다. 그리고 당신은 본질적으로 두 프라이머 서열 사이에 있는 DNA 조각을 증폭합니다. 그래서 이것은 법의학에서 자주 사용됩니다. 왜냐하면 DNA가 매우 적을 수 있고 프라이머를 추가하는 것만으로도 이 두 조각 사이에 있는 DNA 조각의 수를 실제로 증폭할 수 있기 때문입니다. 그래서 당신은 아주 적은 양의 DNA에서 많은 양의 DNA를 갖게 됩니다.

알겠습니다. PCR에 대해 질문이 있으십니까? 다음으로 넘어가겠습니다. 알겠습니다. 저는 지금까지 발견에 집중했습니다. 하지만 여러분 중 상당수가 엔지니어라는 것을 알고 있으며 아마도 무언가를 엔지니어링하고 싶어할 것입니다. 그래서 저는-- 너무 빠르게 움직이는 분야에 대해 말하려고 합니다. 아마도 내년에는 제 강의를 완전히 수정해야 할 것입니다. 알겠죠? 그리고 게놈 편집에 대해 말씀드리겠습니다.

이 이야기의 마지막 부분인 게놈 또는 DNA 편집입니다. 그리고 저는 뉴스에 많이 나왔던 CRISPR-Cas9라는 특정 유형의 시스템에 대해 말씀드리겠습니다. 인간 게놈을 편집하고 유전 질환을 치료할 수 있다는 맥락에서 이 접근 방식에 대해 많은 흥분이 있습니다. . 여기 누가 CRISPR-Cas9에 대해 들어본 적이 있습니까? 그래 좋아. 좋아요. 우리 언론은 제 역할을 다하고 있습니다.

그래서 그것이 무엇인지 누가 압니까? 좋아, 우리 중 일부는 그것이 무엇인지 알고 있습니다. 저는 단지 그것이 무엇이며 왜 중요한지에 대한 매우 피상적인 개요를 제공하고 싶습니다. 그리고 저는 그것이 특히 줄기 세포의 맥락에서 많은 윤리적 문제를 제기한다고 생각하기 때문에 학기 동안 계속해서 그것에 대해 이야기할 것입니다. 정말 좋은 내용을 다루기 전에 기초를 알아야 합니다.

자, 봅시다. 그래서 우리는 무언가를 엔지니어링할 것입니다. 그래서 우리는 DNA 복구에 대해 이야기할 것입니다. 그리고 우리가 게놈을 편집하고 싶다면 이것이 가장 자주 수행되는 방법은 이중 가닥 휴식을 만드는 것입니다. 알겠습니다. 따라서 DNA 조각에 이중 가닥을 끊으면 두 가지 방법 중 하나로 복구할 수 있습니다. 하나는 비-상동 말단 결합에 의한 것으로, 두 개의 DNA 조각이 기본적으로 다시 함께 밀리는 것입니다. 그리고 이것은 종종 돌연변이로 이어집니다.

그래서 만약 당신이 무언가를 고치려고 한다면, 당신이 그것을 부수려고 하지 않는 한, 그것은 아마도 당신이 원하는 것이 아닐 것입니다. 그러나 유기체가 가지고 있는 DNA 복구에 대한 대안적인 접근법은 상동성 복구라고 불리는 것입니다. 이 경우 DNA 조각을 끊고 서열이 다른 DNA 조각을 추가할 수 있지만 이중 가닥 파손이 있는 곳 근처에 상동성이 있습니다. 그리고 그 경우에, 당신은 당신이 기증자 DNA로 제공한 것으로 원래의 서열을 바꿀 수 있습니다.

따라서 특정 유전자좌에서 DNA를 절단할 수 있다면 주어진 유전자좌에서 DNA 서열을 본질적으로 변경할 수 있는 능력을 제공합니다. 그래서 먼저 사고 실험부터 시작하고 싶습니다. 맞죠? 우리는 이중 가닥 DNA를 절단해야 한다고 생각하고 있습니다. 그리고 소년, 나는 당신에게 그것을 위한 완벽한 도구를 주었습니다. 이 모든 제한 엔도뉴클레아제를 줬죠, 그렇죠? 그럼 그것들의 문제는 무엇입니까?

글쎄, 인간 게놈에 대해 생각해 봅시다. 인간 게놈은 30억 염기쌍이다. EcoR1 사이트는 다음과 같습니다. GAATTC. 그래서 길이는 6개의 뉴클레오티드입니다. 30억 염기쌍의 무작위 시퀀스를 생각하면 이 시퀀스를 4번에서 6번 사이에 무작위로 얻을 수 있습니다. 그래서 그것은 4,096번마다 하나가 될 것입니다.

따라서 이것을 무작위 DNA 1에서 대략 4,000번마다 얻는다면 인간 게놈을 절단하는 데 사용하면 인간 게놈에서 수십만 곳을 절단할 것입니다. 따라서 질병을 유발하는 대립 유전자를 가지고 있는 주어진 유전자를 선택하고 그것을 고치려고 한다면 훨씬 더 많은 특이성이 필요합니다. 제한 엔도뉴클레아제를 사용하면 전체 게놈을 절단하기만 하면 되므로 좋지 않습니다.

여기서 특이성은 게임의 이름입니다. 이것은 구체적이지 않으며 더 구체적인 도구가 필요합니다. 그리고 그 도구는 CRISPR-Cas9가 될 것입니다. 그리고 CRISPR-Cas9는 본질적으로 RNA 유도 엔도뉴클레아제입니다. 그래서 이것은 RNA에 의해 유도되고 엔도뉴클레아제입니다.

제한효소, 맞습니다. RNA와는 아무 관련이 없습니다. 그들은 뉴클레오티드 서열을 인식하기 위해 RNA를 사용하지 않습니다. 그것은 단지 단백질이고 단백질은 뉴클레오티드 서열을 인식합니다. CRISPR-Cas9에는 Cas9인 엔도뉴클레아제가 있습니다. 이 문제를 해결해 보겠습니다.

그래서 엔도뉴클레아제는 -- Cas9가 단백질입니다. 그것이 엔도뉴클레아제입니다. 하지만 표적의 선택은 그것이 결합된 RNA 분자에 달려 있습니다. 알겠죠? 따라서 특이성은 적어도 부분적으로 가이드 RNA 또는 단일 가이드 RNA로 알려진 것에서 비롯됩니다. 그것이 게놈 편집에서 가장 자주 사용되는 것입니다.

따라서 이 가이드 RNA는 기본적으로 이 효소가 특정 서열을 찾을 수 있도록 합니다. 그리고 가이드 RNA는 20개 뉴클레오티드이거나 20개 염기쌍 서열에 대한 상동성을 찾습니다. 이미 우리가 6개의 염기쌍 인식 모티프보다 훨씬 더 잘 하고 있음을 알 수 있습니다. 우리는 20개의 뉴클레오티드를 가지고 있습니다. 그리고 특이성을 증가시키는 시스템의 다른 구성 요소가 있습니다.

그런 다음 파란색으로 표시된 Cas9, 엔도뉴클레아제, RNA, 가이드 RNA가 검정색으로 표시되고 템플릿이 회색으로 표시됩니다. 그리고 여러분이 보는 것은 이 표적 서열에 대해 상보성을 나타내는 일종의 RNA입니다. 그리고 RNA와 표적 사이에 상보성이 있는 경우에만 이 엔도뉴클레아제가 활성화되어 이 부위에서 절단됩니다. 따라서 RNA는 이 엔도뉴클레아제가 절단할 특정 위치로 안내하는 안내견과 같은 역할을 합니다.

따라서 아이디어는 게놈을 편집하려는 경우입니다. 오늘날 사람들이 이에 대해 열광하는 이유는 게놈의 특정 위치에서 이중 가닥 파손을 생성할 수 있는 시스템을 보유하고 있기 때문입니다. . 그리고 당신이 그렇게 할 수 있다면, 아마도 다른 서열을 가진 기증자 DNA를 제공한다면 -- 당신이 질병의 대립 유전자를 고려한다면, 맞습니까? 특정 대립 유전자가 있을 때 유전적 형태의 질병을 유발하는 유전자가 있다는 것을 알고 있다고 가정해 보겠습니다.

그런 다음 영향을 받지 않은 개인의 기증자 DNA를 취하고 영향을 받은 개인의 세포를 채취하여 문제가 있는 유전자좌를 절단하고 해당 유전자의 정상 대립 유전자를 사용하여 결함이 있는 대립 유전자를 복구할 수 있습니다. 그리고 그것이 환자에게 다시 도입된다면 그것은 본질적으로 그 유전자의 기능을 구출할 것입니다. 알겠죠? 이것이 어떻게 작동하는지 대략적으로 보이십니까?

이것은 이것이 어떻게 일어날 수 있는지에 대한 일종의 광범위하고 일반적인 개념적 틀입니다. 혈액 장애가 있는 사람이 있다고 가정해 봅시다. 겸상적혈구 빈혈이나 베타 지중해빈혈이라고 합시다. 그것들은 빈혈로 이어지는 유전성 혈액 장애입니다. 세포를 제거할 수 있으며 가장 좋은 것은 환자의 줄기 세포입니다. 그런 다음 그 줄기 세포를 가지고 세포 배양에서 CRISPR-Cas9를 사용하여 유전적 결함을 복구하기 위해 개인의 세포를 편집할 수 있습니다.

그런 다음 그것들을 환자에게 다시 도입할 수 있습니다. 줄기 세포라면 줄기 세포의 틈새를 다시 차지하고 기능적인 혈액 세포를 생산하여 본질적으로 질병을 치료할 수 있습니다. 이것이 오늘날 과학자들이 시스템의 사용에 대해 생각하는 방식입니다. 그리고 이것은 아직 성공적이지 않았지만 현재 진행 중인 여러 임상 실험이 있습니다. 사람들은 이것이 인간의 유전 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여주려고 노력하고 있습니다.

그래서 내년에 우리가 이 환자들 중 일부의 결과를 듣기 시작하면서 거의 의심할 여지 없이 이것에 대해 더 많이 듣게 될 것입니다. 이에 대한 우려도 있다. 나는 그것을 과장하고 싶지 않습니다. 확실히 우려가 있습니다. 우리는 이것이 효과가 있을지 모릅니다. 내 말은, 사람들은 20년 전 학생 때부터 이런 종류의 이야기를 해왔다. 하지만 저는 우리가 점점 더 발전하고 있고 도구도 더 발전하고 있다고 느낍니다. 그래서 저는 20년 전보다 오늘날 이것이 성공할 가능성이 훨씬 더 큰 지점에 도달하고 있다고 느낍니다.

저는 이 시스템이 어디에서 발견되었고 어디서 왔는지 지적하고 싶습니다. 그리고 저는 이것을 예로 들어 좋아합니다. 주요 신호 경로를 정의하는 파리 유전자와 마찬가지로 이것은 기본적으로 박테리아의 생태학에 대한 기초 연구에서 나온 발견입니다. 따라서 이 CRISPR-Cas9 시스템은 본질적으로 박테리아와 박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지 포식자 간의 군비 경쟁 형태로 박테리아에서 진화했습니다.

이것은 박테리아와 그들의 사악한 포식자, 박테리오파지 사이의 군비 경쟁입니다. 이 효소와 이 시스템이 진화한 CRISPR은 박테리아에 대한 적응 면역 시스템의 한 형태이며 그 자체로 매우 야생적입니다. 따라서 CRISPR는 박테리아에 대한 적응 면역 체계입니다. 독감 예방 주사를 맞지 않았다면 맞아야 합니다. 우리는 학기 후반에 인간 면역에 대해 이야기할 것입니다.

그러나 이것은 박테리아 면역의 종류--내가 그것을 몰래 하고 있습니다. 이것이 박테리아에서 작동하는 방식-- CRISPR이 의미하는 것은 Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats입니다. 그래서 당신은 그들이 그것에 약어를 준 것에 대해 이미 감사하다는 것을 알 수 있습니다. 그렇지 않으면 아무도 그렇게 말할 수 없기 때문에 거의 소문이 나지 않을 것입니다.

그래서 이 CRISPR이 많은 박테리아의 박테리아 염색체에 있는 곳에서 이 간격을 둔 짧은 회문 반복의 클러스터가 있으며 반복은 스페이서에 의해 중단됩니다. 그리고 연구자들이 발견한 것은 이 스페이서가 박테리오파지에서 유래한 서열과 서열 유사성과 동일성을 가지고 있다는 것입니다. 그래서 여기에 있는 각각의 착색된 서열은 어떤 종류의 박테리오파지에 대해 어떤 종류의 상보성을 가지고 있습니다.

그래서 파지가 박테리아나 어떤 박테리아를 감염시킬 때, 일어나는 일은 외부 유전 요소를 인식하고 그 일부를 게놈에 삽입하는 시스템이 있다는 것입니다. 그리고 그것은 박테리아가 특정 파지에 감염되었다는 것을 기억하는 기억 역할을 합니다. 그리고 나중에 박테리아가 하는 일은 이 영역을 전사하고 성숙한 CRISPR RNA를 형성하는 것입니다. 여기에서 외래 유전 요소를 인식할 수 있는 서열이 있다는 것을 알 수 있습니다.

따라서 미래에 이 파지가 다시 돌아오면 이 CRISPR RNA 중 하나가 염기쌍 상보성을 통해 외래 유전 요소를 인식하고 잘라낼 줄 알게 될 것입니다.그리고 표적이 잘린 후에는 박테리아 세포에 의해 분해됩니다. 그래서 이것은 박테리아가 자신을 감염시킨 바이러스를 기억하고 이에 대한 방어 메커니즘을 갖는 방법입니다. 그래서 꽤 멋진 시스템입니다.

이 시스템의 멋진 점은 적응 면역 시스템이라는 것입니다. 마치 우리가 외래 병원체를 인식하는 방식과 비슷합니다. 다른 점은 이것이 유전된다는 것입니다. 그것은 게놈에 통합됩니다. 그리고 이 박테리아의 후손이 더 많은 파지를 볼수록 이러한 반복을 더 많이 볼 수 있습니다. 이것은 불행히도 우리에게 없는 유전 가능한 면역 체계입니다.

따라서 여전히 독감 예방 주사를 맞아야 합니다. 예방 접종에 대해서는 나중에 이야기하겠습니다. 며칠 잘 보내시고 금요일에 뵙겠습니다.


무슨 일이야? 단일 세포 시퀀싱

생물학에서 가장 먼저 배우는 것 중 하나는 세포의 기본 구성 요소입니다. 세포가 어떻게 기능하고 특정 목적을 위해 전문화하거나 분화할 수 있는지 배웁니다. 심장 세포, 신장 세포, 뼈 세포 등이 있고 동일한 목적을 수행하기 때문에 거의 동일하지 않습니까? 이에 대한 도전은 같은 집단 내에서도 모든 세포가 다르다는 새로운 아이디어입니다(즉, 모든 심장 세포가 동일하지는 않습니다). 모든 유기체, 기관 시스템 및 조직은 실제로 개별적인 특성을 가진 세포의 모자이크입니다. 이러한 개별 세포 특성을 어떻게 측정합니까? 이번 "What's it all about?" 2013년 Nature Publishing Group의 올해의 방법인 단세포 염기서열 분석의 세계를 소개하는 것을 목표로 하고 있습니다.

단일 세포 시퀀싱이란 무엇입니까?

그림 1. 단일 셀 시퀀싱 워크플로. 크레딧: Amanda Haage

단일 세포 시퀀싱의 광범위한 정의는 매우 자명합니다. 단일 세포를 선택하고 유전 정보를 시퀀싱합니다. 이 분야의 핵심은 최소한의 출발 물질로 시퀀싱을 가능하게 하는 기술, 세포가 존재하는 컨텍스트의 보존, 이 고해상도 데이터를 관련 질문에 연결하는 분석으로 구성됩니다. 단일 세포 시퀀싱 실험은 그림 1에 요약된 것과 같은 일반적인 워크플로를 가지고 있습니다. 분류 또는 분리 단계는 종종 미세 유체 또는 레이저 보조 미세 해부와 같은 여러 다른 최첨단 기술과 함께 수행되지만 다음과 같은 더 간단한 기술로 구성될 수도 있습니다. 유세포 분석 또는 화학적/물리적 해리. 다양한 바이오마커를 기반으로 하는 드문 세포 소집단을 분리하려는 경우 유세포 분석 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)가 사용됩니다. 특정 기술로 단일 세포 또는 희귀 세포 하위 집단이 분리되면 시퀀싱할 물질이 추출됩니다. 단일 세포(또는 작은 세포 그룹)에서 추출한 물질은 가장 일반적으로 DNA 또는 RNA입니다. DNA 및 RNA 외에도 단일 세포 단백질체학, DNA 메틸화 및 다중 물질의 병렬 측정을 위한 기술이 지난 3년 동안 보고되었습니다. 추출된 각 유형의 재료에 대한 적용은 아래에서 설명하는 것처럼 다를 수 있습니다.

다음으로, 추출된 소량의 물질을 증폭해야 합니다. 단일 세포 DNA 시퀀싱의 경우 이를 전체 게놈 증폭(WGA)이라고 합니다. WGA 및 RNA 증폭을 위한 많은 방법이 있습니다(Guin & Oudenaarden은 여기에서 좋은 비교를 제공합니다). 증폭에 사용되는 방법의 주요 관심사는 재료 전체에 고르지 않은 적용 범위입니다. 구조적 및 분자적 변이는 DNA 또는 RNA의 일부를 증폭에 유리하게 하여 샘플에 편향을 유발할 수 있습니다.

차세대 시퀀싱 기술은 실제로 단일 세포 시퀀싱을 가능하게 만든 것입니다. "차세대"라는 용어는 기존의 Sanger 시퀀싱을 개선한 모든 기술을 의미합니다. 이러한 기술은 향상된 속도와 정확도, 수동 입력 감소, 라이브러리 준비 필요성으로 통합됩니다. 라이브러리는 조각화하고 조각을 다른 어댑터/마커로 태깅/결찰하여 증폭된 재료로 만들어집니다. 라이브러리 준비는 사용되는 차세대 시퀀싱 방법에 따라 다르지만 일반적으로 추출된 자료에 어댑터나 태그를 추가하면 많은 단편을 동시에 시퀀싱할 수 있습니다. 이것은 연구원들이 샘플을 보내거나 버튼을 누르기만 하면 되기 때문에 상대적으로 짧은 시간에 시퀀싱된 정보의 거대한 데이터세트를 생성합니다. 미래의 단일 세포 시퀀싱 실험의 실제 작업은 긴 수동 샘플 준비 대신 사려 깊은 설계 및 데이터 분석에 있다는 것이 점점 더 분명해집니다. 분리, 증폭 및 시퀀싱 기술의 선택과 마찬가지로 단일 세포 시퀀싱 데이터 분석 파이프라인의 변형에 대한 방대한 문헌이 나타나고 있습니다(아래 "자신의 연구에서 단일 세포 시퀀싱 사용" 참조).

응용 프로그램은 무엇입니까?

단일 세포 시퀀싱의 응용 프로그램은 거의 끝이 없습니다. 그것은 본질적으로 집단 내의 개별 세포가 서로 어떻게 다른지 묻는 세포 생물학의 모든 하위 분야 내에 하위 하위 분야를 만들었습니다. 그것은 생물학에서 "omic" 주제의 깊이와 수를 크게 증가시켰습니다. 전체 게놈 DNA를 추출하면 종양 생검에서와 같이 단일 세포 또는 작은 세포 집단에서 단일 염기 다형성 또는 후천 돌연변이를 검사할 수 있습니다. 메틸화 또는 염색질 상태를 기반으로 DNA를 추출하면 후성유전체에 대한 전반적인 그림을 얻을 수 있습니다. RNA 추출 및 시퀀싱을 통해 발현 프로파일링 및 스플라이스 변이체 분석을 포함한 세포 전사체를 검사할 수 있습니다. 이러한 모든 시퀀스를 함께 조사하면 세포가 여러 수준의 정보를 통합하는 방법을 엿볼 수 있습니다. 서로 다른 미세 환경 컨텍스트 또는 다른 시점에서 이 정보를 비교함으로써 과학자들은 "이 세포들이 어떻게 이질적인가?"라고 질문할 수 있습니다. "그 이질성은 어떻게 변하는가?" 단일 세포 시퀀싱의 궁극적인 적용은 시간 및 환경 신호와 같은 다양한 입력을 기반으로 하는 모든 세포 출력의 정량화입니다.

Pubmed 데이터를 사용하여 Amanda Haage가 만든 그림 2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=single+cell+sequencing의 녹색 데이터, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=의 파란색 데이터 단일+세포+RNA+시퀀싱.

지금 무슨 일이 일어나고 있고 이 분야는 어디로 가고 있습니까?

단일 세포 시퀀싱 접근 방식이 현재 세포 생물학에 널리 퍼져 있는 것처럼 보일 수 있지만(그림 2), 전체 분야는 이제 막 시작되었습니다. Human Cell Atlas의 사명을 고려하십시오.: "인간의 건강을 이해하고 질병을 진단, 모니터링 및 치료하기 위한 기초로서 모든 인간 세포(생명의 기본 단위)에 대한 포괄적인 참조 지도를 작성합니다." 이 야심찬 프로젝트는 다양한 재료의 단일 셀 시퀀싱에 기반을 두고 있습니다. 우리가 단일 세포의 분해능으로 측정할 수 있는 출력 유형을 확장함에 따라 개인화 의학에 대한 응용 프로그램은 분명한 다음 단계입니다.

단일 세포 시퀀싱이 밝혀냈듯이 각 조직은 특정 목적을 위해 설계된 세포 모자이크를 나타내지만 부인할 수 없는 개성을 가지고 있습니다. 이 이질성은 특히 종양 이질성이 암 치료 내성에 기여할 수 있기 때문에 다양한 질병에 대한 치료 결과에 중대한 영향을 미칩니다. 환자 유래 오르가노이드와 결합된 높은 처리량의 단일 세포 시퀀싱이 임상의에게 환자의 완전한 "omics"를 설명하는 자세한 정보를 제공하는 미래를 상상할 수 있습니다. 그런 다음 의사는 각 개인의 알려진 위험 요소 또는 약물 감수성에 따라 치료 계획을 조정할 수 있습니다.

자신의 연구에서 단일 세포 시퀀싱 사용

단일 세포 시퀀싱 실험을 구현하는 기능은 필요한 기술에 대한 액세스 권한에 따라 크게 달라집니다. 이러한 기술은 점점 더 자동화된 솔루션을 제공하는 생명 공학 회사의 하위 분야에 박차를 가했습니다. 단일 세포 시퀀싱을 고려하기 시작했다면 10X Genomics의 10X University를 확인하거나 illumina의 학습 기회를 살펴보십시오. 또한 여러 "실용 지침"이 출판되었습니다. Haque et al. 참조. 및 Lafzi et al. 단일 세포 RNA 시퀀싱 가이드에 대한 최근 일반 가이드를 참조하십시오. Ding et al. 빠르게 확장되는 사용 가능한 기술을 비교하고 대조하는 것은 초보 연구원이 단일 세포 시퀀싱 풀에 발을 담그는 데에도 필요합니다.

차세대 시퀀싱 데이터가 있으면 분석이 어려워 보일 수 있습니다. 운 좋게도 github에서 호스팅되는 이 전체 과정을 포함하여 스스로 학습할 수 있는 무료 리소스가 많이 있습니다. 모범 사례 가이드, 소프트웨어 분석 패키지 비교, R의 워크플로를 포함하여 단일 세포 RNA 시퀀싱에 특정한 여러 리소스가 있습니다. 또한 훈련된 생물정보학자를 팀에 통합하는 것도 고려하십시오. 세포 생물학과 학술 과학은 점점 더 협력하고 있으며 전문 팀 구성원이 있으면 연구를 더욱 강화할 수 있습니다. 위에서 언급한 많은 생명 공학 회사도 비용을 지불하고 생물 정보학 서비스를 제공합니다.


DNA 분리 및 제한 효소 분석

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DNA 추출은 세포에서 DNA를 제거하고 정제하는 것입니다. 첫째, 세포는 일반적으로 물리적 파괴와 세포 및 핵막을 용해시키는 세제와 같은 화학 물질 처리의 조합을 통해 용해됩니다. SDS 또는 나트륨 도데실 설페이트는 이러한 막을 구성하는 단백질과 지질을 가용화하여 작동하는 일반적으로 사용되는 세제입니다. 그러면 내용물이 주변 용액으로 자유롭게 떠다닐 수 있습니다.

다음으로, DNA는 존재하는 다른 분자로부터 분리되어야 합니다. 반응에 첨가된 프로테이나제 K는 펩타이드 결합을 분해하고 오염된 단백질을 소화합니다. 그런 다음 염을 샘플에 첨가하여 DNA 백본에 있는 음전하를 띤 인산기를 안정화시키고 얼음처럼 차가운 알코올을 첨가한 후 용액에서 DNA를 침전시킵니다. 흰색 침전물은 원심분리기에서 회전시켜 수집하여 튜브 바닥에 가라앉습니다. 세척 및 완충 용액에 재현탁한 후 추출된 DNA는 최종적으로 연구 또는 생명 공학 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

개인이나 개인에게 특정한 DNA의 새로운 패턴을 식별할 수 있는 DNA 지문과 같은 일부 생명 공학 응용 프로그램에는 제한 효소의 사용이 포함됩니다. 제한 효소는 DNA와 상호 작용하고 특정 서열을 인식하는 분자입니다. 특정 부위가 확인되면 DNA를 절단합니다. 이로 인해 가닥이 하나 이상의 선형 조각으로 절단됩니다. 추출된 DNA가 플라스미드(박테리아에서 가장 흔히 발견되는 원형 DNA 조각)인 경우 절단으로 인해 DNA가 선형 단편 또는 단편을 형성하게 됩니다. 다른 제한 효소는 다른 DNA 서열을 인식하므로 이들의 조합을 사용하면 별개의 단편이 생성될 수 있습니다.

DNA 핑거프린팅에서 우리는 DNA 또는 겔 전기영동이라는 기술을 사용하여 이러한 단편을 검사할 수 있습니다. 젤을 준비하기 위해 분말 아가로스를 완충액과 혼합하고 용해될 때까지 가열합니다. 그런 다음 뉴클레오티드 얼룩을 따뜻한 혼합물에 첨가한 다음 이 용액을 주형에 붓습니다. 빗을 삽입하여 우물을 형성합니다. 응고되면 겔을 완충액이 채워진 겔 박스로 옮기고 빗을 제거한다. 알려진 길이의 염색된 DNA 단편의 참조 혼합물인 DNA 사다리를 하나의 웰에 추가하고 관심 있는 염색된 DNA 샘플을 나머지 웰에 로드합니다. 상자는 전원에 연결되어 있고 전원을 켜면 DNA 뉴클레오티드의 음으로 하전된 인산염 그룹이 젤을 통해 양극인 양극 쪽으로 이동하게 됩니다. 더 작은 조각은 더 큰 조각보다 더 빨리 움직이며 어렵게 이동합니다.

실행이 완료되면 젤을 자외선에 노출시켜 DNA 샘플의 뉴클레오티드 얼룩을 시각화합니다. 그들의 존재는 사다리 밴드에 대한 상대적 위치를 기반으로 확인할 수 있습니다. 상이한 서열을 갖는 DNA는 상이한 위치에 절단 부위를 가질 것이기 때문에, 이것은 개인 또는 변이 DNA 프로파일을 구별하는 데 사용할 수 있는 새로운 밴드 패턴 또는 지문을 생성할 수 있습니다.

이 실습에서는 SDS가 있거나 없는 완충액을 사용하여 DNA 추출을 수행하여 DNA 분리에서 세제의 중요성을 평가한 다음 다른 제한 효소로 플라스미드 DNA를 분해하여 결과 DNA 프로필을 조사합니다.

모든 유기체의 유전 분자로서의 DNA의 계시는 엄청난 과학적, 의학적 돌파구를 가져왔고 우리 자신과 다른 유기체에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다. DNA 분리 및 프로파일링은 유전자 기능의 식별에서 농업 및 법의학의 혁명에 이르기까지 지난 세기의 많은 발전을 위한 기본적인 첫 번째 단계였습니다.

세포에서 DNA 분리

DNA 분리는 세포 수확, 용해, 단백질 분해 및 최종적으로 DNA 침전과 같은 몇 가지 필수 단계를 필요로 하는 상당히 간단한 절차입니다. 일반적으로 DNA는 식물의 단일 잎, 동물의 모낭 또는 간단한 식염수 용액으로 입안에서 쉽게 벗겨질 수 있는 상피 세포와 같은 소량의 조직에서 수확할 수 있습니다. DNA는 핵 또는 진핵 세포 내의 미토콘드리아 내부에 구획화되어 있기 때문에 과학자들은 먼저 세포와 핵막을 분해하여 DNA를 노출시킵니다. 이것은 용해 단계에서 완료됩니다. 그러나 일단 DNA가 노출되면 중금속 이온과 극한의 pH에 ​​의해 분해될 수 있습니다. 따라서 세제가 포함된 완충용액은 세포막을 용해할 뿐만 아니라 용액 내에서 분해되는 요소로부터 DNA를 보호하기 위해 사용됩니다. 더욱이 DNA는 히스톤이라는 특수 단백질 주위에 단단히 포장되어 핵 내부에 응축되어 있는 비정상적으로 긴 분자입니다. 따라서 단백질의 펩타이드 결합을 분해하는 Proteinase K라는 효소를 첨가하여 히스톤 및 기타 단백질로부터 DNA를 분리합니다. 다음으로 과학자들은 화학적 특성을 사용하여 나머지 세포 추출물에서 DNA를 분리합니다. 핵산의 음전하 구조로 인해 염화나트륨 용액의 Na + 이온은 얽힌 DNA 가닥에 결합하여 통합됩니다. DNA가 덩어리지면 육안으로 관찰할 수 있습니다. DNA는 알코올에 불용성이며 저온에서 쉽게 침전되므로 과학자들은 DNA를 침전시키기 위해 차가운 ​​알코올을 첨가합니다. 마지막으로, 침전된 DNA는 사용할 때까지 핵산을 분해할 수 있는 효소가 없는 탈이온수 또는 순한 완충액에 용해 및 보관할 수 있습니다.

DNA 정량화

DNA를 사용하는 반응은 종종 높은 순도와 정확한 양의 DNA가 필요합니다. 따라서 DNA 분리 후 과학자들은 분광 광도계를 사용하여 시료의 DNA 양과 시료의 DNA 순도를 정량화합니다. 분광 광도계는 샘플을 통과한 광선의 강도를 파장의 함수로 측정합니다. 핵산은 260nm에서 빛을 흡수하는 반면 단백질은 280nm에서 빛을 흡수합니다. 과학자들은 260nm에서 광선의 강도를 측정하여 DNA 농도를 결정할 수 있습니다. 또한, 260 nm와 280 nm 모두에서 광도를 평가하여 DNA 함량의 순도를 결정할 수 있습니다. 순수한 DNA 샘플에서 260/280 nm 비율은 2 값에 접근해야 합니다.

제한 효소

클로닝, 시퀀싱, DNA 단편 및 게놈 매핑과 같은 많은 분석을 위해 분리된 DNA는 제한 효소를 사용하여 특정 서열에서 절단해야 합니다. 이 효소는 침입하는 바이러스 DNA에 대한 타고난 면역의 메커니즘으로 박테리아에 의해 생성되고 분자 가위로 기능합니다. 따라서 제한 효소는 바이러스 DNA를 식별한 후 인식하는 특정 뉴클레오티드 서열에서 단편으로 절단하여 분리하기 시작합니다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 종종 6개에서 12개의 뉴클레오티드 길이이며 일반적으로 회문형입니다. 이는 3’-5’ 및 5’-3’ 방향으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다는 것을 의미합니다. 예를 들어, 제한 효소 EcoRI는 서열 3’에서 DNA를 절단합니다. GAATTC…-5’, 5’-3’ 방향에서 동일하게 읽습니다. EcoRI와 마찬가지로 많은 별개의 회문 서열에 해당하는 수백 개의 효소가 있습니다. 일단 DNA가 이 효소에 의해 절단되면 과학자들은 DNA를 전기영동 챔버의 겔에 로드하고 겔을 통해 전류를 전달할 수 있습니다. DNA는 음전하를 띠기 때문에 DNA 조각이 양극으로 이동합니다. 그러나 겔의 기공은 더 작은 DNA 서열에 비해 더 큰 DNA 단편을 느리게 하므로 조각이 크기에 따라 분리됩니다. 전기영동이 완료된 후 DNA 조각은 DNA 분자에 특이적으로 결합하는 염료를 사용하여 시각화할 수 있습니다.

제한 효소로 DNA를 절단하고 전기 영동으로 DNA 단편을 분리하면 연구자가 표준 사다리와 비교하여 알려지지 않은 단편의 크기를 식별할 수 있습니다. 그런 다음 관심 있는 이러한 단편을 추가로 분리하고 유전자 복제를 위해 플라스미드 벡터에 결찰할 수 있습니다. 유전 공학 및 실험실 분석은 이러한 방법으로 크게 향상되었습니다. DNA 프로파일링을 통해 과학자들은 게놈의 염기서열을 분석하여 유기체의 작동을 더 잘 이해할 수 있고 특정 유전자를 식별하고 특성화할 수 있습니다 1 .

DNA 분리 및 프로파일링은 일상 생활에 직접적인 영향을 미치는 사건에도 실용적입니다. 예를 들어, 법의학 과학자들은 일상적으로 DNA 샘플을 분석하여 형사 및 민사 사건에 대한 증거를 제공합니다 2 . 마찬가지로 의료 종사자는 친자 및 유전 질환을 확인하기 위해 DNA를 추출하고 분석합니다. 최근에는 사용자가 자신의 유전적 혈통을 확인하고, 친척을 찾고, 다양한 건강 상태에 대한 유전적 소인까지 발견할 수 있도록 함으로써 DNA 조상 분석 키트가 대중화되었습니다 3 . 마지막으로, 생명 공학 및 유전 공학의 발전으로 개인의 유전 데이터를 사용하여 치료법을 개발하기 위해 임상 연구원들 사이에서 맞춤 의학이 주목을 받고 있으며, 이는 유해한 부작용 없이 환자를 효과적으로 치료할 수 있는 길을 열어줍니다 4.

참고문헌

  1. Chambers, GK, et al. 동물학에서의 DNA 지문: 과거, 현재, 미래. Genet을 조사하십시오. 2014, Vol. 5, 3 도이: 10.1186/2041-2223-5-3.
  2. 로워, L. 법의학에서의 DNA 지문: 과거, 현재, 미래. Genet을 조사하십시오. . 2013, Vol. 4, 22 도이: 10.1186/2041-2223-4-22.
  3. Kirkpatrick, BE 및 Rashkin, MD. 가계 검사와 유전 상담의 실천. 제이젠 상담. 2016, Vol. 26, 1 (6-20).
  4. 매사추세츠주 함부르크 및 FS 콜린스. 맞춤 의학으로 가는 길. N 영어 J Med . 2010, Vol. 363, 301-304.

통합 시스템에서 규제 정보의 비선형 확장

이전 논문에서 세포 또는 컴퓨터에 관계없이 통합된 복잡한 시스템에서 내인성 통신 및 규제 정보에 대한 요구 사항은 기능에 따라 선형보다 빠르게 확장되므로 한계에 도달해야 함을 보여주었습니다(Gagen 및 Mattick, 2005 Mattick 및 Gagen, 2005). 이 제한은 제어 아키텍처의 물리적 기반과 효율성을 변경함으로써만 완화되고 높일 수 있습니다. 다른 영역에서 이 한계는 기호 또는 시퀀스 특정 문자열을 사용하여 시스템 내에서 정보를 저장하고 전송하는 디지털 통신 및 제어 시스템의 중첩으로 인해 높아졌습니다. 이것은 더 높은 정보 밀도와 개선된 전송 정확도를 모두 허용하며, 후자는 아날로그 계산 고유의 증폭된 잡음(의도하지 않은 누화) 문제를 극복하여 더 높은 연산 정교함과 복잡성을 달성합니다(예: Collen, 1994 참조). 좋은 예는 아날로그에서 디지털 컴퓨팅으로의 전환(Weinstein and Keim, 1965)과 순수한 기계 장치에서 현대적인 여객기 또는 군용기로 항공기의 진화입니다. 여기서 정보와 비용의 상당 부분이 컴퓨팅 및 소프트웨어 시스템에 수반됩니다. , 수백 킬로미터의 광섬유를 포함합니다(Csete and Doyle, 2002). 1970년대 후반에 인트론이 발견된 것과 유사한 상황인 자전거 엔지니어 또는 심지어 항공 엔지니어가 예기치 않은 상황에 직면했을 때 후자를 어떻게 만들었는지 상상해 보십시오(아래 참조).

디지털 통신 및 제어 시스템의 강력함과 정확성은 분자 생물학의 중심 교리가 개발되고 인트론이 도입된 후인 지난 20-30년 동안 인간의 지적 및 기술적 경험에서 광범위하게 확립되었습니다. 발견. 후자는 의심할 여지 없이 가장 큰 놀라움이었고(Williamson, 1977), 그것의 잘못된 해석은 아마도 분자생물학의 역사에서 가장 큰 실수였을 것입니다. 인트론은 전사되지만, 단백질을 암호화하지 않고 많은 비암호화 RNA가 기능할 수 있다는 것은 상상할 수 없었습니다. 특히 예상치 못한 방식으로, 인트론은 기능하지 않고 인트론 RNA가 접합 후 성능이 저하됩니다(추가 처리가 아닌). 진핵생물 게놈에서 인트론의 존재는 아직 제거되지 않았고 도메인 셔플링 및 대안적 스플라이싱을 촉진함으로써 단백질의 진화에 유용성을 갖는 초기 유전자 조립의 잔류물로 합리화되었습니다(Crick, 1979 Gilbert, 1978 Padgett et 알., 1986). 흥미롭게도, DNA 자체가 디지털 저장 매체라는 사실은 수년 동안 널리 인식되어 왔지만 일반적으로 그 출력 중 일부가 디지털 신호일 수 있다고 생각하지 않았습니다. ~을 통해RNA 1 .

일부 초기 경우에는 RNA가 조절 분자로 작용할 수 있다고 제안되었습니다. 가능성은 1961년 Jacob과 Monod(Jacob and Monod, 1961)에 의해 처음으로 잠깐 제기되었지만 전형적인 유전자 조절 인자인 라크 억제인자는 이후에 단백질로 밝혀졌다(Gilbert and Muller-Hill, 1966). RNA 조절 네트워크의 존재는 1969년 Britten과 Davidson에 의해 처음으로 가정되었으며(Britten and Davidson, 1969 Davidson et al., 1977), 핵에 있는 RNA의 훨씬 더 큰 복잡성을 설명하기 위한 시도로(당시 '이종 핵 RNA' 또는 hnRNA) mRNA가 위치한 세포질과 비교. 이 논문은 고등 진핵생물의 진화에서 조절 기전에 대한 중요한 역할을 처음으로 제안한 역사적 중요성이 있지만, RNA 조절 자체의 아이디어는 인트론의 발견 이후에도 이 발견이 설명을 제공했음에도 불구하고 추구되지 않았습니다. 적어도 부분적으로) hnRNA의 기원과 절제된 인트론 RNA로부터 유전자 조절 신호의 공동 생산의 명백한 잠재적 소스(Mattick, 1994 Mattick and Gagen, 2001).

원핵생물 게놈의 분석은 예측된 바와 같이(Croft et al., 2003) 조절 단백질을 코딩하는 유전자의 수는 유전자 수 또는 게놈 크기에 거의 2차적으로 확장된다는 것을 보여주었습니다(Croft et al., 2003 Gagen and Mattick, 2005 Mattick, 2004 Mattick and Gagen, 2005 van Nimwegen, 2003). 또한, 이러한 관계의 외삽은 새로운 조절 유전자의 수가 새로운(비조절) 기능적 유전자의 수를 초과할 것으로 예측되는 지점이 박테리아 게놈의 관찰된 크기 상한에 가깝다는 것을 보여줍니다(Gagen and Mattick, 2004 Gagen과 Mattick, 2005). 이것은 박테리아가 아마도 진화 초기에 단백질 기반 조절의 가속화 비용에 의해 부과된 복잡성 한계에 도달했음을 의미합니다(증명하지는 않지만). 그것은 또한 (i) 더 복잡한 진핵생물이 다른 방식으로 문제를 해결했음에 틀림없다는 것을 의미하며, 아마도 서열 특이적 조절 분자[microRNA(miRNA)가 좋은 예임]로서 RNA를 함께 선택함으로써 더 미묘하게 , (ii) 규제 요인의 조합 그 자체로 이 한도를 초과하기 위해 규제 공간을 확장하는 데 사용할 수 없습니다. 선험적으로 원핵생물이 더 복잡한 프로모터를 쉽게 진화시키고 전사 인자를 추가로 동원할 수 없었을 것이라고 예상하는 이유. 이것은 차례로 고등 유기체의 복잡한 유전자 조절 체제가 여러 층의 조절 및 조절 결정을 통해 작동할 수 있음을 시사합니다. 조합) 주어진 지점에서 입력.

어떤 경우든, 그리고 규제 정보의 비선형 스케일링과 일치하게, 고등 유기체의 게놈에서 비단백질 코딩 DNA 서열의 범위와 상대적 복잡성 사이에는 강한 관계가 있습니다. 실제로 이것은 게놈 정보 내용과 복잡성 사이의 유일하게 일관된 관계인 것으로 보입니다(Taft et al., 2007)(그림 1). 이러한 비단백질 코딩 서열은 인간 게놈의 거의 99%를 차지하며(Frith et al., 2005), 많은 사람들이 이것이 모두 다음과 같이 기능할 수 있다는 것을 상상할 수 없었습니다. 시스- 작용하는 조절 요소(복잡한 유기체에서 분명히 확장되었지만). 다시 이 견해는 대부분의 유전 정보가 단백질에 의해 처리된다는 가정에 암묵적으로 근거를 두고 있습니다.


호박 화석에서 공룡 DNA 추출 불가능, 과학자들은 말한다

과학자들은 두 마리의 침 없는 꿀벌에서 고대 DNA를 추출하려고 시도했습니다. 트리고니스카 아멜리아에. 이 이미지는 보여줍니다 트리고니스카 아멜리아에 콜롬비아 코팔의 꿀벌. 이미지 크레디트: David Penney 박사/맨체스터 대학교.

호박 속의 곤충에서 DNA를 추출하여 공룡을 재현한다는 아이디어는 1990년대 초반부터 대중의 관심을 끌었습니다.

그러나 맨체스터 대학 과학자들은 오픈 액세스 저널에 발표된 새로운 연구에서 플로스원, 이 기술은 성공할 가능성이 낮다고 밝혔습니다.

그들은 매우 민감한 시퀀싱 기술을 사용했습니다. 이는 호박의 아화석화된 수지 전구체인 코팔의 곤충에 대한 가장 진보된 유형의 DNA 시퀀싱입니다.

이 연구는 물리적으로 격리된 독립적인 실험실로 구성된 고대 DNA 시설에서 법의학 보호복을 입고 수행되었으며, 각 실험실에는 양압을 유지하는 극도로 여과된 공기 공급 장치와 관리된 액세스 시스템이 있습니다.

1990년대의 원래 연구에서 DNA 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)이라는 과정에 의해 이루어졌습니다. 이 과정은 부분적으로 분해된 고대 DNA의 추출물을 오염시키는 손상되지 않은 현대 DNA 분자를 우선적으로 증폭하여 다음과 같은 위양성 결과를 제공합니다. 진정한 고대 DNA로 오인된 것”이라고 수석 저자인 테렌스 브라운 교수는 설명했다.

"‘next generation’ 시퀀싱 방법을 사용하는 우리의 접근 방식은 길이에 관계없이 추출물의 모든 DNA 분자에 대한 서열을 제공하고 현대 분자를 오염시키는 것을 선호하지 않기 때문에 고대 DNA에 이상적입니다.&# 8221

과학자들은 민감한 차세대 방법을 사용했음에도 불구하고 코팔에서 비교적 어린 60년에서 10,600년 된 아화석 곤충의 고대 DNA를 감지할 수 없다는 결론을 내렸습니다. 자연 건조된 박물관 곤충보다 더 좋지도 않고 아마도 더 나쁠 수도 있습니다.

이것은 코팔보다 수백만 년 더 오래된 호박 속의 곤충 화석에서 DNA가 추출되었다는 주장에 대해 상당한 의심을 불러일으킵니다.

직관적으로, 수지에 완전하고 신속한 삼켜져서 거의 즉각적인 죽음을 초래하는 것이 수지 매장된 곤충의 DNA 보존을 촉진할 수 있다고 상상할 수 있지만 이것은 사실이 아닌 것으로 보입니다. 따라서 불행히도 쥬라기 공원 시나리오는 허구의 영역에 머물러 있어야 한다고 Dr Penney는 결론지었습니다.


DNA 연결 문제 해결

모든 실험 절차에서 컨트롤을 올바르게 설정하면 문제의 원인을 해결할 수 있으므로 일이 잘못되었을 때 많은 작업을 절약할 수 있습니다. DNA 결찰도 다르지 않습니다. 이 기사에서는 완전한 컨트롤 세트로 결찰 반응을 설정하고 결찰 문제의 원인을 해결하는 데 사용하는 방법을 설명합니다.

DNA 결찰 배경 및#8230의 첫 번째 비트

결찰 반응은 둔탁한 DNA를 결합하려는지 끈적한 DNA를 결합하려는지에 따라 두 가지 범주로 나뉩니다. 설정이 약간 다르지만 컨트롤은 기본적으로 두 가지 반응 유형에 대해 동일합니다. 이 기사에서는 단일 삽입물을 벡터에 연결하는 데 중점을 둘 것입니다.

라이게이션 반응은 선형화된 벡터 단편으로 시작되며, 여기에 등몰(또는 몰 과량)의 인서트가 적절한 완충액의 DNA 리가제와 함께 혼합됩니다. 리가아제는 벡터를 결합하고 초기 선형화된 DNA에서 공유적으로 닫힌 원형 벡터를 생성하는 조각을 삽입합니다. 저는 보통 50ng의 벡터를 사용하고, 오른쪽의 방정식을 사용하여 1몰당량에 필요한 인서트 양을 계산합니다. 따라서 5kbp 벡터와 1kbp 삽입물에 대한 내 결찰 믹스는 다음과 같습니다.

  • 50ng 벡터
  • 10ng 인서트
  • 1마이크로리터 10x 리가아제 완충액
  • 1 마이크로리터 DNA 리가제
  • 물 10 마이크로리터

인서트의 몰 과잉을 추가하면 인서트 크기에 따라 결찰의 기회가 증가할 수 있으므로 몇 가지 vector:insert 비율을 시도하는 것이 좋습니다. 결찰이 작동하는 방식에 대한 자세한 정보는 여기에서 얻을 수 있습니다.

결찰 후, 유능한 대장균 반응 혼합물로 변환됩니다. 사실 그 대장균 원형에 의해 효율적으로 변형될 수 있지만 선형이 아닌 DNA는 결찰이 성공적인지 여부를 결정하는 기초입니다. 공유적으로 닫힌 원형 DNA로 형질전환하여 얻은 콜로니의 수는 세포의 능력과 존재하는 DNA의 양에 따라 다릅니다. 결찰 및 제어에 대해 동일한 유능한 세포 준비를 사용한다고 가정하면 형성된 콜로니 수는 각 반응에서 공유적으로 닫힌 DNA의 양(즉, 결찰이 얼마나 성공적이었는지)에 따라 달라집니다.

이제 컨트롤로 넘어갑니다. 안내를 위해 다음은 집중할 컨트롤에 대한 요약입니다.

DNA 결찰 문제 해결 컨트롤 1 및 2: 벡터 배경

벡터 준비는 복제 절차의 중요한 부분입니다. 소량의 소화되지 않은 벡터라도 ligation으로 전달되면 효율적으로 변형되어 콜로니가 생성됩니다. 비삽입 벡터를 포함하는 콜로니를 “background” 콜로니라고 합니다. 배경 콜로니를 줄이기 위한 벡터 준비에 대한 자세한 정보는 여기에서 찾을 수 있습니다.

배경의 또 다른 소스는 벡터의 재연결입니다. 선형 벡터에 호환되는 말단(예: 뭉툭한 말단 또는 호환되는 끈적한 말단)이 있는 경우 리가아제는 이들을 효율적으로 결합하여 원형의 변형 가능한 DNA를 생성하여 배경 콜로니를 생성합니다. 포스파타제 처리는 재결찰의 가능성을 줄이고 배경을 줄이지만 종종 완벽하지 않습니다.

출처가 무엇이든, 결찰 반응에 얼마나 많은 배경 지식이 있는지 아는 것이 매우 중요합니다. 배경의 양을 결정하려면 삽입물을 물로 교체하여 병렬 결찰 반응을 설정해야 합니다. 컨트롤 1입니다. 이 대조군의 형질전환으로 형성된 집락은 소화되지 않거나 다시 결찰된 벡터의 결과이며, 결찰에서 형성된 집락 수에서 이 대조군에서 형성된 집락 수를 빼면 결찰 반응이 제대로 이루어졌는지 여부를 알 수 있습니다. 성공적인. 이상적인 시나리오는 컨트롤 플레이트에 콜로니가 거의 없거나 전혀 없고 결찰 플레이트에 수십, 수백 또는 수천 개의 콜로니가 있다는 것입니다.

결찰이 잘 진행되면 대조군 1로 충분합니다. 그러나 문제가 발생하는 경우 아래에 설명된 컨트롤을 사용하여 원인을 정확히 찾아낼 수 있습니다. 컨트롤 2 컨트롤 1과 비슷하지만 없이 리가제. 대조군 2의 형질전환으로 형성된 집락은 리가아제가 없기 때문에 벡터 재결찰이 아니라 소화되지 않은 벡터의 결과일 수 있습니다. 많은 수의 배경 집락을 얻고 있는 경우 대조군 1과 2를 비교하면 문제가 소화되지 않은 벡터로 인한 것인지 또는 벡터 재결찰로 인한 것인지 결정할 수 있습니다.

DNA 결찰 문제 해결 컨트롤 3 및 4: 집락 없음!?

동전의 반대편에는 식민지가 거의 없거나 전혀 없습니다. 이는 유능한 세포 또는 형질전환 절차의 문제, 잘못된 항생제 사용 또는 불량한 ligase 활성과 같은 결찰 반응의 문제 때문일 수 있습니다. 나머지 컨트롤을 사용하여 이러한 가능성을 구분할 수 있습니다.

컨트롤 3 소화되지 않은 부모 벡터의 알려진 양(약 0.1ng가 잘 작동함)을 사용합니다. 변환하는 경우 대장균 소화되지 않은 부모 벡터는 플레이트에 콜로니를 생성하지 않으며, 문제는 형질전환 절차, 유능한 세포 또는 항생제 선택에 있습니다. 따라서 다음 단계는 새 세포를 시도하거나 변환 절차를 검토하는 것입니다.

한편, 형질전환이 성공하면 형질전환으로 얻은 콜로니 수를 세어 세포의 능력을 계산할 수 있다. 현실적으로 세포의 최소 복제 능력은 DNA 1마이크로그램당 1吆^6 집락 형성 단위(CFU)여야 합니다. 세포가 이보다 낮으면 이것이 문제일 가능성이 높으므로 새로운 컴피턴트 세포 배치로 형질전환을 다시 수행해야 합니다.

을위한 컨트롤 4, 미리 대비해야 합니다. 적당한 양(1마이크로그램)의 벡터를 취하여 단일 효소로 분해한 다음 젤에서 실행하고 밴드를 분리합니다. 이제 리가제가 제대로 작동하는지 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 벡터 플러스 및 마이너스 리가아제로 결찰 반응을 실행한 다음 유능한 세포를 변환합니다. 두 접시의 콜로니 수를 비교하십시오. 리가아제 함유 반응이 리가아제 마이너스 플레이트보다 훨씬 더 많은 콜로니(최소 5-10x)를 가지고 있으면 리가아제가 작동할 가능성이 높습니다. 그렇지 않은 경우 리가아제에 문제가 있을 수 있습니다. 문제가 여전히 벡터 준비에 있을 수 있지만 이 컨트롤에 주의하십시오! 가장 좋은 방법은 소화된 벡터의 큰 배치를 구성한 다음 신선한 리가제로 검증하는 것입니다. 벡터 준비가 좋다는 것을 알게 되면 이를 사용하여 향후 리가제 배치를 확인할 수 있습니다.

번거롭고 시간이 많이 소요될 수 있지만 변환 실험에 대해 올바른 제어를 수행하면 발생할 수 있는 문제를 쉽고 빠르게 식별하는 데 도움이 됩니다.


인간 유전자 치료

유전 공학의 가장 흥미로운 잠재적 응용 프로그램 중 하나는 인간 유전 질환의 치료입니다. 의학 과학자들은 개인의 DNA 오류로 인해 발생하는 약 3,000가지의 장애를 알고 있습니다. 겸상적혈구빈혈, 테이-삭스병, 뒤셴 근이영양증, 헌팅턴 무도병, 낭포성 섬유증, 레쉬-니한 증후군과 같은 상태는 DNA 분자에서 단일 질소 염기의 손실, 잘못된 삽입 또는 변화로 인해 발생합니다. 유전 공학을 통해 과학자들은 특정 유전자가 부족한 개인에게 해당 유전자의 정확한 사본을 제공할 수 있습니다. 올바른 유전자가 기능을 시작하면 유전 질환이 치료될 수 있습니다. 이 절차는 인간 유전자 요법(HGT)으로 알려져 있습니다.

인간 환자를 대상으로 한 HGT의 승인된 첫 번째 시험은 1980년대에 시작되었습니다. 가장 유망한 실험 세트 중 하나는 중증 복합 면역 결핍증(SCID)으로 알려진 상태와 관련되었습니다. SCID를 가진 개인은 면역 체계가 없습니다. 대다수의 사람들에게 무해한 미생물에 노출되면 사망에 이를 수 있는 질병이 발생합니다. 무균 기포에 보관되지 않은 SCID로 태어난 치료받지 않은 영아는 몇 달 안에 병에 걸리고 첫 번째 생일 전에 사망합니다.

1990년에 국립보건원(NIH)의 연구팀은 4세 SCID 환자에게 HGT를 시도했습니다. 그 환자는 자신의 몸에 없는 유전자 복제를 포함하는 약 10억 개의 세포를 받았습니다. HGT의 또 다른 예는 낭포성 섬유증 환자의 기도에 정상 유전자를 도입하기 위해 1993년 NIH에서 승인한 절차였습니다. NIH에 따르면 1990년대 말까지 390개 이상의 유전자 치료 연구가 시작되었습니다. 이 연구에는 4,000명 이상의 사람들과 12개 이상의 의학적 상태가 포함되었습니다.

2000년에 프랑스의 의사들은 SCID로 고통받는 세 아기를 치료하기 위해 HGT를 사용했다고 주장했습니다. 치료를 받은 지 불과 10개월 만에 아기들은 정상적인 면역 체계를 보였습니다. 이것은 HGT가 명백한 성공을 거둔 것은 이번이 처음입니다.

논란이 남아 있다. 인간 유전자 치료는 과학자와 비과학자 모두에게 큰 논란의 근원입니다. HGT를 사용해서는 안 된다고 주장하는 사람은 거의 없습니다. 겸상 적혈구 빈혈을 없앨 수 있다면 대부분의 사람들이 동의합니다. 우리는 확실히 노력해야 합니다. 그러나 HGT는 다른 우려를 제기합니다. 과학자들이 유전적 장애를 치료할 수 있다면 그 시대의 문화적, 지적 유행에 따라 개인을 설계할 수도 있습니다. 인간은 HGT로 할 수 있는 변경 사항에 대해 "충분히"라고 말할 때를 알 수 있습니까?

최근의 성공에도 불구하고 1990년 첫 번째 실험이 수행된 이후 HGT의 대부분의 결과는 크게 실망스러웠습니다. 그리고 1999년에 애리조나 주 투손에 사는 18세 소년이 펜실베니아 대학에서 실험에서 사망하면서 HGT에 대한 연구는 큰 타격을 받았습니다. 대사 장애를 앓고 있던 그 청년은 치명적인 형태의 그 질병에 걸린 아기를 위한 유전자 요법을 테스트하기 위한 실험에 자원했습니다. 이 청년의 정신을 인용하면서 연구원들은 HGT가 제공하는 가능한 인명 구조 기회에 대한 작업을 계속할 것을 약속하며 낙관적입니다.


반전이 있는 화학

DNA 또는 디옥시리보핵산은 거의 모든 생명체의 모든 세포 내부에서 발견되는 분자입니다. 그것은 세포가 생존하는 데 필요한 단백질을 만드는 데 도움이 되며 번식을 촉진합니다. 머리카락 하나보다 수천 배 얇은 DNA 가닥은 설탕 그룹, 인산염 그룹 및 4개의 질소 함유 염기 중 하나인 세 가지 화학적 구성 요소로 구성됩니다.

1953년에 과학자들은 DNA가 이중 나선 구조로 되어 있으며, 화학 염기인 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T)이 서로 얽혀 있는 두 길이의 설탕 사이에 쌍으로 쌓여 있다고 제안했습니다. 및 인산염. 설탕과 인산염이 측면 레일 역할을 하고 염기 쌍이 가로대 역할을 하는 코르크 마개처럼 꼬인 사다리를 상상해 보십시오.

이러한 염기쌍의 순서 또는 서열은 인간에서 햄스터, 히비스커스에 이르기까지 특정 생명체를 생성하는 유전 암호를 결정하기 때문에 매우 중요합니다.

인간의 DNA는 약 30억 개의 염기를 가지고 있으며, 그 중 99%는 모든 사람에게 정확히 동일합니다. 그 기지는 우리 종의 특징인 공유 특성을 발생시키는 청사진을 형성합니다. 나머지 1%는 눈 색깔, 피부색, 체형과 같이 각 사람을 독특하게 만드는 수많은 특징을 담당합니다.


특정 DNA 서열이 있는 세포를 분리할 수 있습니까? - 생물학

먼저 DNA가 디옥시리보핵산의 축약형이라는 것을 알아야 합니다. 하지만 그것은 한 입 반입니다. 그래서 우리는 DNA에 충실할 것입니다! 신체의 모든 것 중에서 DNA가 가장 중요합니다. 그것은 당신을 만드는 것입니다, 당신! DNA는 건물의 청사진과 같은 신체의 유전 정보를 전달하는 분자입니다. 그리고 증거의 측면에서, DNA 일치는 매우 강력합니다. 일란성 쌍둥이를 제외하고는 어떤 두 사람도 똑같은 DNA를 가지고 있지 않기 때문입니다.

좋습니다. 여기서 생물학 수업을 조금 듣겠지만 최대한 간단하게 하겠습니다(특히 저는 생물학자가 아니기 때문에!). 그러나 DNA는 무엇입니까? 많은 수의 원자로 구성되어 있으며 일반적으로 반복 단위로 배열되어 있음을 의미하는 고분자입니다. DNA의 경우 반복 단위는 뉴클레오티드이며, 당 분자, 인산기 및 4개의 질소 분자 중 하나로 구성됩니다.

DNA의 가장 좋은 점은 그것이 신체의 모든 세포에서 발견되고 모든 세포에서 동일하다는 것입니다. 혈액 세포에서 발견되는 DNA는 뇌 조직의 DNA 및 모발의 모낭에 있는 DNA와 동일합니다. DNA 증거의 가장 좋은 출처는 혈액, 타액, 소변, 머리카락, 치아, 뼈 및 조직입니다. 법의학 과학자들은 껌, 봉투, 우표, 담배꽁초, 컵, 손톱깎이, 비듬, 땀, 무기, 의복 등 다양한 물체에서 DNA를 추출할 수 있습니다.

그래서 우리는 DNA 샘플로 시작합니다. 채취한 혈액 샘플이나 협측 면봉(뺨 안쪽을 문지르는 것)과 같은 선호하는 경로를 통해 수집한 경우 작업할 DNA가 많이 있습니다. 하지만 만약 당신이 작은 DNA 샘플이 있습니까? 운 좋게도 이제 우리가 보유한 기술로 DNA 가닥을 복제할 수 있습니다. 중합효소연쇄반응(PCR)으로 알려진 기술을 사용하면 살아있는 세포 외부에서 DNA 가닥의 일부를 복사할 수 있어 수백만 개의 복사본이 생성됩니다. DNA Thermal Cycler와 같은 기계는 DNA를 두 배로 늘릴 수 있으며 몇 시간 내에 30개의 주기가 지나고 DNA가 10억 배 증가할 것입니다.

이제 작업할 샘플이 충분하므로 어떻게 사용합니까?

제한 단편 길이 다형성(RFLP)은 DNA 분자가 제한 효소에 의해 "절단"될 때 생성되는 염기쌍의 다른 단편 길이를 사용하는 기술입니다. 제한 효소는 특정 위치에서 DNA 분자를 절단하는 가위 역할을 하는 단백질 분자입니다. 다른 지점에서 자릅니다. DNA 가닥을 다양한 길이의 단편으로 절단한 다음 겔 전기영동을 사용하여 분리할 수 있습니다. 전기 영동은 전위의 영향을 받는 동안 지지 매체(종종 겔)에서 이동하여 분자를 분리하는 데 사용되는 기술입니다. 약간 음전하를 띠는 DNA 조각은 길이에 따라 분리되는 젤을 따라 이동합니다. 짧은 조각은 긴 조각보다 더 멀리 이동할 수 있습니다. 시각화를 돕기 위해 DNA를 나일론 막으로 옮기고 여기에 방사성 프로브를 추가합니다. 마지막으로 나일론 시트를 X선 필름에 대고 방사능 붕괴가 필름을 표시하는 위치에 놓습니다. 처리되면 각 단편의 길이를 나타내는 밴드가 필름에 나타나며 DNA 프로필을 남깁니다! 용의자의 프로필은 범죄 현장에 남겨진 증거의 프로필과 비교할 수 있습니다.

새로운 분석 방법 중 하나는 STR(Short Tandem Repeat)로 알려져 있습니다. 이제 DNA 프로파일링에서 가장 성공적이고 가장 널리 사용되는 프로세스입니다. STR은 DNA 분자 전체에 걸쳐 반복되는 3-7개 염기의 짧은 서열을 포함하는 염색체 상의 위치입니다. STR은 이전 분석 기술에 필요한 것보다 짧은 가닥으로 분해되기 쉽고 분해되기 시작한 얼룩에서 제거할 수 있습니다. 검사하는 동안 다른 STR을 제거하고 PCR로 증폭한 다음 전기영동 젤에서 분리합니다. 주어진 시간이 지나면 전류가 차단되고 과학자는 문제가 된 샘플 STR이 대조군 샘플과 비교하여 얼마나 멀리 이동했는지 볼 수 있습니다. 하나의 STR을 측정값으로 사용하는 것은 그다지 유용하지 않을 수 있지만 미국에는 국가 데이터베이스에 입력하는 데 사용되는 표준화된 13개의 STR이 있습니다(이 강의 뒷부분에서 설명). 아래 차트에는 사용된 13개의 STR이 무작위로 선택된 2명의 개인이 동일한 STR 유형을 가질 확률과 함께 나열되어 있습니다.

아프리카 계 미국인 미국 백인
D3S1358 0.094 0.075
vWA 0.063 0.062
FGA 0.033 0.036
TH01 0.109 0.081
티폭스 0.090 0.195
CSF10P 0.081 0.112
D5S818 0.112 0.158
D13S317 0.136 0.085
D7S820 0.080 0.065
D8S1179 0.082 0.067
D21S11 0.034 0.039
D18S51 0.029 0.028
D16S539 0.070 0.089

여러 STR을 결합하면 각 STR의 확률이 함께 곱해집니다. 따라서 미국 백인에서 D3S1358, vWA 및 FGA의 조합은 0.075*0.062*0.036 = 0.0001674이고 여기에 100을 곱하여 0.01674% 또는 5000분의 1을 얻습니다. 백인계 미국인과 아프리카계 미국인의 경우 900조 분의 1입니다.

전 세계적으로 다양한 DNA 데이터베이스가 존재합니다. 가장 큰 것(가장 많은 샘플과 데이터가 있는 것)은 정부가 통제합니다. 미국은 가장 큰 데이터베이스를 통제합니다. – CODIS(Combined DNA Index System) 영국은 데이터베이스에서 크게 뒤쳐지지 않습니다. – NDNAD(National DNA Database) 호주에는 NCIDD(National Criminal Investigation DNA Database)가 있고, 캐나다에는 국가 DNA 데이터가 있습니다. 은행(NDDB). 이러한 데이터베이스의 도움으로 수사관은 범죄에서 발견된 DNA 프로필을 알려진 범죄자의 DNA 프로필과 비교하는 것이 훨씬 쉽습니다. 데이터베이스는 범죄자에게만 국한되지 않습니다. 여기에는 미해결 범죄 피해자의 DNA 샘플과 실종자 프로필도 포함되어 있습니다. 범죄 현장과 데이터 뱅크가 일치하는 경우 이를 "콜드 히트(cold hit)"라고 합니다. 콜드 히트는 유용하지만 DNA 데이터뱅크를 사용하지 않고 이루어진 매치보다 "증거 가치"가 덜합니다.

이것은 실제로 법의학 센터에서 내 수업에 제출한 사례이므로 이름이나 공개 정보가 제공되지 않았습니다. 그러나 그것은 DNA 프로파일의 최종 결과에 대한 훌륭한 그림과 함께 왔습니다. 40대 여성 A씨가 자택에서 숨진 채 발견됐다. 그녀는 비흡연자였으나 수사관들은 현장에서 담배꽁초를 발견했다. 부검 과정에서 그녀의 손톱이 잘려 피해자의 혈액 샘플과 담배꽁초와 함께 증거의 일부로 제출되었습니다. 손톱깎이와 담배꽁초에서 남성의 DNA 프로필이 결정되었습니다. 조사가 계속되자 용의자가 발견되었고 그에게서 혈액 샘플을 채취하여 분석을 위해 제출했습니다.

손톱에 묻은 외래 DNA와 담배꽁초의 DNA가 피고인의 프로필과 일치했으며, 다른 사람의 DNA일 확률은 86억분의 1이다. 배심원단은 피고인에게 유죄를 선고했고 사건은 해결되었습니다.



코멘트:

  1. Randy

    나는 기념비, 몇 가지 음모의 웅장함에 대해 말할 것입니다. 그리고 나는 그것을 필터링되지 않은 진짜라고 부릅니다. 내 생각에, 아름다움은 여전히 ​​다른 것입니다 : 최고, 가장 순수한, 선택된 사람은 당신을 떨고 놀라게합니다. 당신은 모든 것에서 아름다움을 찾을 수 있지만, 군중의 모든 것은 아름다움이 아닙니다. IMHO.

  2. Burne

    내 생각에, 그 의미는 머리에서 발끝까지 전개되며, 가축은 그가 할 수있는 모든 것을 압박했습니다.

  3. Roni

    당신뿐만 아니라



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