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포유류 세포에서 두 개의 단백질을 발현하는 가장 좋은 방법은 무엇입니까?

포유류 세포에서 두 개의 단백질을 발현하는 가장 좋은 방법은 무엇입니까?



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나는 두 개의 단백질을 가지고 있으며 안정적인 transfection을 위해 두 유전자를 가진 벡터를 준비할 것입니다. 각 단백질에는 고유한 프로모터가 있으며 저는 piggyBac 벡터를 사용하여 두 유전자가 모두 들어 있는 단일 카세트를 염색체에 삽입합니다. 내 질문은 다음과 같습니다.

  1. 두 유전자에 대해 동일한 프로모터(CMV, SV40 또는 유도성 프로모터)를 사용하는 경우 이것이 발현 수준에 어떤 영향을 미칩니까? 나는 유전자 중 하나가 다른 것보다 낮게 발현될 수 있다는 일부 논문을 읽었습니다. 직접 경험하신 분 공유해주시면 감사하겠습니다.
  2. 두 가지 모두에 대해 동일한 프로모터를 사용하지만 멀리(즉, 카세트의 끝) 배치하면 발현 수준이 다시 영향을 받습니까? 너무 간단하게 들리지만 사람들이 그것으로 좋은 결과를 얻었다면 뭔가를 출판했을 것이라고 생각합니다.
  3. 각 유전자에 대해 서로 다른 프로모터를 사용하는 경우(예: 하나는 CMV, 다른 하나는 Tet 유도성) 어떻게 작동합니까? 나는 이것을 사용한 논문을 찾을 수 없었고 나는 이 접근 방식을 계속하고 싶습니다. 따라서 경험이 있다면 도움을 주시면 정말 감사하겠습니다.

IRES 또는 2A-펩타이드를 사용하고 싶지 않습니다. 나는 전사 단계에서 이 실험을 통제할 수 있기를 원합니다.


양방향 프로모터를 사용할 수 있습니다. 같은 수준으로 발현되지 않는 단백질에 대해 말씀하신 문제는 중합효소 경쟁으로 인해 발생합니다. 그러나 잘 최적화된 부분과 잘 작동하는 상업적으로 이용 가능한 벡터도 있습니다.

일련의 순서로 유전자를 복제할 수 있습니다. 문제가 되지 않습니다. 이전 유전자의 polyA 신호 뒤에 100bp 링커만 남겨둡니다. 카세트가 너무 커지면 삽입이 약간 어려워집니다. 이것이 사람들이 IRES 또는 TA-펩타이드 등을 사용하는 이유입니다.

Retroviral 기반 삽입은 꽤 잘 작동하지만 다른 세포 사이의 복제 수 변화를 제어할 수 없습니다.

두 가지 다른 프로모터를 사용할 수 있습니다. 역학은 프로모터 강도와 인듀서의 농도에 따라 달라집니다.


나는 내 질문을 살펴보고 이것이 아직 답이 없다는 것을 깨달았습니다. 자, 이제 답을 얻었습니다.

나는 두 개의 분리된 프로모터(하나는 CMV, 다른 하나는 Tet-inducible)로 구성을 설계했고 정말 좋은 결과를 얻었습니다. 단백질 발현에 어려움은 없었습니다. 나는 Tet-유도성 단백질을 매우 훌륭하게 제어할 수 있었고 CMV로 다른 단백질의 일정한 수준을 얻었습니다.

간단히 말해서 두 개의 유전자를 두 개의 개별 프로모터 아래에 안전하게 배치하고 이들로 안정적인 세포주를 준비하고 좋은 발현 수준을 얻을 수 있습니다.


포유류 세포에서 두 개의 단백질을 발현하는 가장 좋은 방법은 무엇입니까? - 생물학

재조합 단백질이란? 단백질은 생명에 가장 중요한 생물학적 분자 중 하나입니다. 그리고 이 단백질들은 대사 반응 촉매, DNA 복제, 자극에 대한 반응, 한 위치에서 다른 위치로 분자 이동 등 유기체 내에서 광범위한 기능을 수행합니다. 그러나 우리가 이러한 단백질의 구조, 기능, 메커니즘, 경로 또는 기타 사실을 분석하고자 할 때 자연 공급원에서 그 양이 충분하지 않다는 것을 알게 될 것입니다. 이 경우 우리는 실험실에서 짧은 시간에 많은 양과 순도의 단백질을 저렴한 비용으로 생산해야 합니다. 따라서 재조합 단백질 기술이 필요하다. 재조합 단백질(Recombinant protein)은 단백질의 조작된 형태로, 다양한 방식으로 생성되어 다량의 단백질을 생산하고, 유전자 서열을 변형하고, 유용한 상용 제품을 제조한다. 재조합 단백질은 유전자 발현과 mRNA 번역을 지원하는 시스템에서 복제된 재조합 DNA에 의해 암호화됩니다. 일반적으로 표적 단백질의 cDNA 서열인 재조합 DNA는 특성이 잘 규명된 프로모터의 제어 하에 있고 선택된 숙주 세포 내에서 표적 단백질을 발현하여 높은 수준의 단백질 발현을 달성하도록 설계되었습니다. 재조합 DNA 기술에 의한 유전자 변형은 돌연변이 단백질 또는 다량의 단백질의 발현으로 이어질 수 있다.

적절한 단백질 발현 시스템을 선택하는 것이 재조합 단백질 발현의 성공을 위한 열쇠입니다. 표적 단백질 특성, 의도된 적용, 단백질 수율 및 비용을 비롯한 여러 요인을 고려해야 합니다. 또한, 많은 단백질 발현 프로젝트, 특히 큰 단백질, 막 단백질, 핵 단백질 및 번역 후 변형이 심한 단백질에 대한 과제가 존재합니다.

요즘에는 여러 표현 시스템을 사용하고 있습니다. 시스템마다 기능과 응용 프로그램이 다릅니다. 여기에서는 연구 및 산업 분야에서 일반적으로 사용되는 4가지 시스템을 소개합니다. 그것들은 박테리아 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 바큘로바이러스 발현 시스템 및 포유동물 발현 시스템이다.

그림1. 4가지 표현 시스템

E.coli 발현 시스템은 주요 용도이자 가장 성숙한 발현 시스템입니다. 주요 방법은 표적 DNA 단편을 삽입한 벡터를 숙주 세포에 전달하는 것이다. 그런 다음 IPTG에 의해 단백질 발현을 유도합니다.

가장 초기 개발 및 가장 널리 사용되는 고전적 발현 시스템으로서 E. coli 발현 시스템은 명확한 유전적 배경, 빠른 번식, 저렴한 비용, 높은 발현, 제품의 쉬운 정제, 우수한 안정성, 강력한 오염 방지 능력의 장점을 가지고 있습니다. 그리고 넓은 적용 범위. 그러나 원핵생물 발현 시스템에는 많은 단점이 있습니다. 모든 단백질이 용해되는 것은 아닙니다. 세포질에서 잘못 접힌 단백질은 봉입체(inclusion body)라고 불리는 불용성 응집체를 형성하여 정제가 어려울 수 있습니다. 더욱이, 원핵생물 발현 시스템의 번역 후 변형 처리가 불완전하고 발현된 생성물의 생물학적 활성이 낮다.
따라서, 다른 보다 정교한 시스템도 개발되고 있으며, 이러한 시스템은 이전에 E.coli에서 불가능하다고 생각된 단백질, 예를 들어 글리코실화된 단백질의 발현을 허용할 수 있습니다.

그림2. 잘못 접힌 본체 및 봉입체

새로운 외인성 단백질 발현 시스템으로서 효모 발현 시스템은 원핵 및 진핵 발현 시스템의 장점을 모두 포함했습니다. 유전공학 분야에서 널리 활용되고 있다. Saccharomyces cerevisiae의 완전한 유전자 서열은 1996년에 시퀀싱되었습니다. 양조 및 빵 산업에서 S.cerevisiae의 사용은 수천 년 동안 알려져 왔으며 독소를 생성하지 않고 FDA에서도 인정했습니다. 따라서 효모 시스템에서 발현되는 생산물은 많은 숙주 안전성 실험이 필요하지 않습니다.

그러나 새로운 효모 시스템과 비교하여 S.cerevisiae 발현 시스템은 강력하고 엄격한 조절 프로모터가 없는 고밀도 배양에 적합하지 않습니다. 그리고 분비 효율이 낮다. 특히 분자량이 30kD 이상인 표적 단백질은 거의 분비되지 않는 경우가 많다.

나중에 사람들은 분열 효모와 메탄올 효모 발현 시스템을 개발했습니다. 그 중 메탄올 효모 발현 시스템은 가장 널리 사용되는 효모 발현 시스템이다. 현재 주로 사용되는 메탄올 효모는 H Polymorpha, Candida Bodini 및 Pichia Pastris입니다. Pichia Pastoris는 가장 인기 있는 도구입니다. 메탄올 효모의 대부분은 메탄올 효모 산화효소 유전자-1(AOX1)을 포함합니다. 외인성 유전자는 프로모터(PAOX1)의 작용하에 발현되었다. PAOX1은 탄소원으로 포도당 또는 글리세롤을 사용하는 강력한 촉진제입니다. 메탄올 효모에서 AOX1 유전자의 발현은 일반적으로 억제되었다. 그리고 PAOX1은 메탄올이 유일한 탄소원일 때 활성화될 수 있습니다. 따라서 AOX1 유전자의 발현은 유전자의 조절하에 증가될 수 있다. 외인성 단백질 생산을 표현하기 위한 메탄올 효모의 사용은 종종 최대 그램입니다. S.cerevisiae와 비교하여 그 번역은 포유동물 세포에 더 가깝고 과당화를 겪지 않습니다.

곤충 발현 시스템은 고등 진핵생물과 유사한 외래 단백질을 번역하고 변형하는 능력을 갖는 널리 사용되는 진핵생물 발현 시스템이다. 재조합 배큘로바이러스에 의한 곤충 세포 시스템의 외인성 단백질 발현은 보다 대중적인 발현 방법이다. 단백질 수준은 최대 1입니다.

500mg/L. 그러나 배양액, 산소공급, 대수증식 등 많은 요인에 의해 제한되고 영향을 받습니다.

Baculovirus는 알려진 곤충 바이러스의 가장 큰 그룹이며 가장 초기에 가장 많이 연구되고 적용 가능한 곤충 바이러스입니다. 배큘로바이러스 게놈은 80-160kb 크기의 단일 폐쇄 원형 이중 가닥 DNA 분자입니다. 그것의 게놈은 곤충 핵에서 복제되고 전사될 수 있습니다. DNA 복제는 baculovirus의 껍질에서 조립되는데, 이는 유연성이 뛰어나고 외부 DNA 삽입물의 큰 조각을 수용할 수 있습니다. 그것은 큰 DNA 조각의 발현을 위한 이상적인 운반체입니다.

baculovirus 시스템의 주요 장점은 다음과 같습니다.

  1. 재조합 단백질은 단백질 올바른 접힘 및 이황화 결합과 같은 완전한 생물학적 기능을 가지고 있습니다.
  2. 번역 후 수정
  3. 총 단백질 양의 최대 50%까지 높은 수준의 발현
  4. 큰 삽입 단백질 수용
  5. 여러 유전자를 동시에 발현합니다.

주요 단점은 외인성 단백질 발현이 바이러스 감염으로 인해 세포가 죽기 시작하는 매우 늦은 바이러스 프로모터의 제어 하에 있다는 것입니다.
글리코실화가 척추동물에서 발견되는 글리코실화와 다를 수 있지만 곤충 발현 시스템은 일반적으로 막 단백질 생산에 사용됩니다. 일반적으로 숙주 범위가 제한되어 있고 변형 없이 척추동물을 감염시키지 않기 때문에 포유류 바이러스보다 사용하는 것이 더 안전합니다.

포유류 세포에서 발현되는 재조합 단백질은 일반적으로 플라스미드 형질감염 및 바이러스 벡터 감염을 사용합니다. 플라스미드 형질감염을 사용한 안정적인 세포주는 몇 주 또는 심지어 몇 달이 걸리는 반면 바이러스 벡터는 며칠 내에 빠르게 세포를 감염시킬 수 있습니다.

단백질 발현의 시간적, 공간적 차이에 따라 발현 시스템은 일시적, 안정 및 유도 발현 시스템으로 나눌 수 있습니다. 일과성 발현 시스템은 선택 압력 및 외인성 벡터가 없는 숙주 세포 배양이 세포 분열 동안 점차적으로 손실되는 것을 의미한다. 표적 단백질 발현 기간이 짧다. 과도 발현 시스템의 장점은 간단하고 짧은 실험 기간입니다. 안정적인 발현 시스템이란, 캐리어 DNA가 숙주 세포에서 장기간 안정적으로 복제 및 발현되는 것을 의미합니다. 선택 저항 및 압력 단계가 필요하기 때문에 안정적인 표현은 상대적으로 시간이 많이 걸리고 힘든 작업입니다. 유도 발현 시스템은 표적 유전자가 외래 소분자에 의해 유도될 때 발현되기 시작하는 것을 말한다. 이종 프로모터, 인핸서 및 증폭 가능한 유전자 마커의 사용은 단백질 생산을 증가시킬 수 있습니다.
포유동물 발현 시스템은 단백질 개시 신호, 처리, 분비, 글리코실화에서 독특한 이점을 가지며 온전한 거대분자 발현에 적합하다.

Fig3. 안정적인 세포주 개발

천연 단백질에 더 가까운 포유류 세포에 의해 생성되는 외래 단백질은 원핵생물 발현 시스템 또는 효모 및 곤충 세포와 같은 다른 진핵생물 발현 시스템에 의해 생성되는 단백질보다 훨씬 더 많은 활성을 갖는다. 이 기술의 단점은 복잡하고 요구 사항이 높으며 수율이 낮고 때로는 바이러스 감염이 존재한다는 것입니다.

무엇보다 이러한 모든 표현 체계에는 장단점이 있습니다. E.coli 및 효모 발현 시스템의 장점은 높은 발현 수준과 저렴한 비용입니다. 그러나 그들의 변형 시스템은 곤충 세포 및 포유류 세포와 다릅니다. 포유류 세포에서 생산되는 단백질은 천연 단백질과 유사합니다. 그러나 단점은 낮은 표현 수준과 복잡한 작업입니다. 상이한 발현 시스템에 의해 생성된 재조합 단백질의 생물학적 활성 및 면역원성은 전환된 번역 후 프로세싱으로 인해 때때로 상이하다. 따라서 어떤 발현 시스템을 선택해야 할지 고려할 때 표적 단백질에 독성이 있는지, 단백질에 생물학적 활성이 필요한지, 해당 단백질에 글리코실화가 필요한지, 비용 효율성, 수율, 정화, 안전 등. 경험이 풍부한 실험 지식을 바탕으로 이러한 모든 요소를 ​​고려하여 우리의 전문 지식이 적절한 결정과 선택을 할 것입니다.

1 번 테이블. 단순히 표현 시스템을 비교

세균 발현 시스템 효모 발현 시스템 곤충 발현 시스템 포유류 발현 시스템
속도 ★★★★ ★★★ ★★
생산하다 ★★★ ★★★★ ★★
PTM
(인간에 비해)
★★ ★★★ ★★★★
비용 ★★★★ ★★★ ★★
애플리케이션 원핵생물 단백질, 단순 진핵생물 단백질 세포내/분비단백질, 이황화결합단백질, 당화단백질 막단백질, 대형단백질,
바이러스 백신, 신호 단백질, 사이토카인, 키나제
복잡한 진핵생물 단백질, 정확한 PTM이 필요한 단백질

당사의 모든 단백질 발현 시스템 서비스를 제공합니다. 재조합 단백질 및 발현 시스템 선택에 대해 궁금한 사항이 있으시면 언제든지 문의해 주세요!


정상 수명 및 세포주 유도

발달 초기 단계에서 동물 세포는 다양한 조직과 기관으로 발달하면서 광범위한 증식과 분화를 겪습니다. 성인의 경우 대부분의 세포는 신진대사 활동을 하고 신장에서의 여과 또는 간에서의 합성 및 화학적 변형과 같은 생리학적 역할을 수행하지만 대부분의 세포는 활발히 분열하지 않지만 정지 상태입니다. 대부분의 정상적인 성인 세포는 자극에 반응하여 분열하여 오래되거나 손상된 세포를 보충합니다. 피부나 상피 장 세포와 같은 특정 조직의 세포만 규칙적으로 분열합니다.

몸에는 200가지가 넘는 다양한 유형의 세포가 있으며 그 중 많은 세포가 배양에서 절제되거나 성장할 수 없습니다. 더 잘 배양할 수 있는 세포에는 섬유아세포 및 특정 상피 세포가 포함됩니다. 세포 분리의 첫 번째 단계는 세포가 생존하고 증식하기에 적합한 물리적, 화학적 환경에서 조직을 이식하는 것입니다.

세포 성장을 위한 허용적인 환경은 설탕, 아미노산, 비타민, 미네랄 및 인슐린과 같은 성장 인자를 포함한 복잡한 영양소 혼합물을 필요로 합니다. 혈액의 특정 세포 유형을 제외하고 조직에서 파생된 세포는 고정 의존적입니다. 즉, 자유롭게 떠다니는 개별 세포로 성장하지 않습니다. 따라서 조직 환경에서 방출된 후 세포는 부착할 수 있는 표면이 필요합니다. 그렇지 않으면 생존 및 분열에 실패합니다.

부착 후, 세포는 전체 표면이 한 세포 두께의 층으로 덮일 때까지 빈 표면으로 성장하고 확장합니다.즉., 단층). 이 시점에서 그들은 분열을 멈추고 접촉 억제라는 상태에 도달합니다. 다음으로 트립신과 같은 효소는 세포를 표면에 "접착"하는 단백질을 분해하여 세포를 용액으로 방출하는 데 사용됩니다. 일단 분리되면 세포는 더 큰 표면적을 가진 배양 용기로 옮겨 성장을 재개할 수 있습니다.

이 부착, 세포 확장 및 분리 주기는 여러 번 반복될 수 있으며 각 주기는 여러 세포 분열로 구성됩니다. 그러나 대부분의 정상 세포에는 자체 2배를 계산하는 내부 시계가 있습니다. 소위 Hayflick 한계에 도달하면 세포 분열이 중지됩니다. (3, 4). 조직에서 파생된 대부분의 세포는 증식을 멈추고(노화되기) 비정상적인 모습을 보이기 전에 최대 40~60번까지 분열할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 세포가 배양에서 유지할 수 있는 배가의 수는 백신 생산 용도에 충분합니다.

이들 세포가 나타내는 노화 및 접촉 억제는 정상 조직 세포의 특징입니다. 그러나 암에서 분리된 특정 세포는 불멸이며 접촉 억제를 극복할 수 있습니다. 반세기 이상 전에 과학자들은 노화에서 살아남은 세포를 분리하는 데 성공했습니다 (5, 6). 이 세포들은 다른 세포들이 모두 죽은 후에도 분열을 계속했습니다. 흥미롭게도 암세포와 달리 살아남은 세포 중 일부는 여전히 접촉 억제를 따르고 형태학적으로 정상으로 보였습니다.

Hayflick 한계를 우회하고 계속 분열하는 이러한 불멸 세포를 세포주라고 하며 정상 조직에서 분리된 세포 균주와 달리 배양 시 불멸입니다. 세포주와 세포주는 또 다른 중요한 방식에서 다릅니다. 세포주의 모든 세포에는 세포당 2세트의 정상적인 염색체가 있는 반면, 세포주의 세포에는 형태학적으로 정상인 경우에도 일반적으로 2세트의 염색체가 없습니다.

많은 세포주는 면역이 저하된 마우스에 주입될 때 종양 형성을 유도합니다. 그러나 세포주는 영원히 배양될 수 있기 때문에 거의 무제한으로 제품을 생산하도록 유전적으로 조작될 수 있습니다. 이러한 이유로 포유류 세포에서 생산되는 모든 치료 단백질은 세포주를 사용합니다.


일시적 형질감염 방법

리포솜은 세포막의 빌딩 블록인 인지질 이중층의 합성 유사체입니다. 이러한 형질감염 화합물은 수성 조건에서 회전 타원체 리포솜의 형성을 허용하는 각 분자의 소수성 및 친수성 영역의 존재를 포함하여 천연 대응물과 많은 특성을 공유합니다. 유리 DNA 또는 RNA가 있는 경우 리포솜은 핵산을 캡슐화하여 효율적인 전달 시스템을 만듭니다. 리포솜의 전하, 구성 및 구조는 세포막에 대한 복합체의 친화성을 정의합니다. 특정 조건에서 리포솜-핵산 복합체는 세포막과 상호작용하여 세포내이입에 의해 세포에 접근할 수 있고 이어서 핵산을 세포질로 방출할 수 있습니다. 입자 크기, 지질 제형, 전하 비율 및 리포솜 준비 방법을 포함하여 리포솜에 의한 핵산의 포유동물 세포로의 성공적인 전달을 결정하는 몇 가지 요인이 있습니다.

리포솜에 대한 대안은 미셀 또는 작은 캡슐화 액적을 형성하기 위해 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 비리포솜 지질 및 중합체를 포함합니다. Transfection은 일반적으로 수성 조건에서 수행되며, 이를 통해 양친매성 화합물의 친유성 부분 또는 세포막과 같은 지방산 화합물에 대한 친화성을 나타내는 액적 부분이 외인성 핵산을 감싸는 미셀 캡슐을 형성할 수 있습니다. .

덴드리머는 작은 복합체를 형성하기 위해 DNA와 상호작용할 수 있는 고도로 분지된 구형 거대분자입니다. 덴드리머는 생물학적 액체에서 안정하고 온도에 민감하지 않습니다. 이러한 특성은 덴드리머를 조직 배양 형질감염을 위한 매우 효율적인 도구로 만듭니다. 덴드리머의 단점은 생분해되지 않기 때문에 장기간 노출되면 세포에 유독할 수 있다는 것입니다.

전기천공법은 외인성 핵산을 현탁액 세포 및 비부착 1차 세포(림프구와 같은)에 전달하는 매우 효율적인 기술입니다. 이 기술은 전기를 사용하여 세포막에 일시적인 기공(전기 기공)을 생성하여 하전된 핵산 분자(RNA 또는 DNA)를 표적 세포로 흡수할 수 있도록 합니다.


포유류 세포에서 양성 선택

안정적인 형질감염을 달성하려면 세포가 플라스미드 DNA를 게놈에 통합하도록 강제하는 선택적 압력이 있어야 합니다. 이 포스트의 목적을 위해, 우리는 양성 선택을 양성 형질을 선택하는 수단으로 정의할 것입니다(즉, 플라스미드에는 세포가 독소에 내성을 갖도록 하는 카세트가 포함되어 있음). 반면 음성 선택은 음성 형질을 선택하는 것입니다( 즉, 플라스미드는 세포를 독소에 민감하게 만드는 카세트를 포함합니다. 아래 표에서는 양성 선택에 중점을 두고 있지만 음성 선택 기술을 양성 선택과 함께 사용하여 유전자가 게놈 내의 특정 위치를 표적으로 하도록 할 수 있습니다.

포유류 세포에서 양성 선택은 박테리아에서와 유사하게 작동하며 가장 일반적으로 사용되는 선택 마커의 표는 아래에 나열되어 있습니다.

헬라, NIH3T3, CHO, COS-1, 293HEK

* 포괄적이지 않습니다. ** 진핵생물에서. ***선택에 사용되는 농도는 일반적으로 형질감염된 세포주의 유지에 사용되는 농도보다 더 많습니다(2배).


단백질 발현 최적화

기관차에서 카부스에 이르기까지 일련의 특정 자동차로 구성된 기차처럼 단백질은 각 부분인 아미노산이 연결된 후에만 "역을 떠날" 수 있습니다.

실제로, 철도 야적장에서 자동차를 이동하는 것은 단백질 발현을 구성하는 과정보다 훨씬 간단합니다. 이 과정은 전사로 시작하여 번역으로 끝나고 번역 후 수정으로 정교해지기까지 합니다. 그러나 이러한 프로세스를 제어하고 복잡한 바이오 의약품과 같은 가치 있는 화물을 운송하는 것은 가능합니다.

오늘날의 문제에 대한 실용적인 솔루션을 제공하는 것을 목표로 하는 최근 Bioprocessing Summit은 컨퍼런스 프로그램의 한 부분을 단백질 발현의 발전에 초점을 맞췄습니다. 이 부분은 게놈 규모의 RNA 간섭(RNAi) 활용, 항상 인기 있는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 발현 시스템의 당공학 개선, 약물 개발을 향상시키기 위한 일시적이고 안정적인 발현의 조화와 같은 새로운 접근 방식을 다뤘습니다.

곤충 세포에 대한 프레젠테이션도 진행되었습니다. 다른 발현 시스템과 마찬가지로 곤충 세포는 제조 호환 공정을 신중하게 최적화하여 생물 치료제를 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로 일부 프레젠테이션에서는 단백질 발현과 관련된 여러 프로세스에 하나 또는 여러 회사를 사용하는 상대적 이점과 같은 아웃소싱 문제에 대해 설명했습니다.

다학제적 접근

효율적인 단백질 발현을 저해할 수 있는 수많은 문제를 감안할 때 때때로 전문가와 상의하는 것이 합리적입니다. 예를 들어, 아웃소싱 문제로 인해 많은 기업이 Ingenza와 협력하게 되었으며, Ingenza는 산업 생명공학 및 합성 생물학에서 선택의 파트너가 되는 것을 목표로 합니다.

Ingenza의 전무 이사인 Ian Fotheringham 박사는 "효과적인 단백질 발현에는 동시에 최적화하기 위해 높은 수준의 전문 지식이 필요한 보이지 않는 측면과 알려진 측면이 많이 있습니다. "일부 실험실은 한 측면 또는 다른 측면에 대한 지식을 가지고 있지만 효과적인 단백질 발현의 여러 측면을 다룰 수 있는 능력을 가진 사람과 함께 작업하는 것이 더 효율적입니다. 그런 면에서 우리는 차별화됩니다.”

Fotheringham 박사는 이제 아웃소싱이 단백질 발현 분야에서 잘 확립된 옵션이라고 주장했습니다. 우리는 다학제적인 회사인 데에는 이유가 있습니다.”

예를 들어 Fotheringham 박사는 발현된 표적 단백질이 재조합 숙주에서 잘린 미국의 선도적인 바이오 제약 회사와 협력했다고 설명했습니다. “첫째, 우리는 발현을 위해 표적 유전자를 최적화했습니다. 대장균 의 라이브러리를 사용하여

50,000개의 코딩 영역 서열 변이체. 우리는 최고의 전체 길이 공연자를 신속하게 식별하는 간단한 페트리 플레이트 스크린을 고안했습니다.

“이러한 성공에 힘입어 우리는 고객의 많은 목표에 GMP 준수 생산 균주를 제공했습니다. 다른 프로젝트는 이중 카세트 벡터(예: 표적 및 샤페론), 대체 숙주, 새로운 유도 전략 및 재조합 단백질 안정성, 생산 및 정제를 최적화하기 위한 표적 게놈 통합을 성공적으로 포함했습니다."

Ingenza는 또한 혁신적인 연구를 번역하기 위해 학술 기관 및 신흥 스핀아웃과 협력합니다. Fotheringham 박사는 회사의 대학 파트너 중 한 명이 발견한 강력한 항균제인 에피더마이신의 예를 인용했습니다. Epidermicin은 메티실린 내성과 싸울 수 있습니다. 황색포도상구균 (MRSA) 감염, 그러나 초기에는 숙주 독성으로 인해 적은 양으로만 발현될 수 있었다.

Fotheringham 박사는 "우리는 독점적인 inABLE ® 조합 조립 플랫폼을 활용하여 실험 설계(DOE) 기반 발효와 결합하여 에피더마이신 및 그 유도체의 과잉 생산을 허용하는 절단 가능한 융합 구조를 준비하고 스크리닝했습니다."라고 말했습니다. "성공은 대학 분사가 그 결과를 활용할 수 있게 해줍니다."

이 회사는 이제 최적화된 미생물 및 포유동물 생산 시스템과 모듈식 일회용 발효 접근법을 사용하여 임상 평가 및 제조를 위한 원료의약품을 제공함으로써 주요 고객과 함께 GMP 생물제제 분야로 더 나아가고 있습니다.


Ingenza는 간단한 페트리 접시 스크린을 사용하여 다음 라이브러리를 사용하여 대장균에서 표적 유전자 발현을 최적화합니다.

일시적이고 안정적인 CHO 발현의 조화

사내에서 일하는 사람들에게 CHO 세포에서 단백질 산물의 발현은 다양한 이유로 가장 인기 있는 발현 플랫폼 중 하나로 남아 있다고 Eli Lilly and Company의 연구 과학자인 Yashas Rajendra 박사는 말했습니다. 그는 "CHO ​​시스템은 본질적으로 적응력이 있으며 산업용 생물 반응기로 쉽게 확장할 수 있습니다"라고 설명했습니다.

그러나 복잡한 바이오 의약품의 초기 단계 약물 발견을 위해 회사는 종종 HEK293 일시적 발현 플랫폼에 의존합니다. Rajendra 박사는 "이는 분자가 발전하여 결국 CHO에서 발현될 때 놀라움의 위험을 증가시킬 수 있습니다."라고 경고했습니다. "이러한 위험을 줄이기 위해 우리는 안정적인 CHO 플랫폼에 사용된 것과 동일한 세포주, 배지 패키지 및 DNA 발현 카세트를 기반으로 하는 일시적인 CHO 플랫폼을 개발했습니다."

Rajendra 박사에 따르면, 일시적이고 안정적인 발현 접근법의 조화는 분자를 발견에서 개발 및 궁극적으로 제조로 전환할 때 단백질 품질 및 발현에 대한 더 나은 예측 가능성을 제공할 수 있습니다. Rajendra 박사는 “이 일시적인 CHO 시스템은 빠르게(7일 이내에) 높은 역가를 생성할 수 있습니다. "시스템은 10L까지 확장 가능합니다."

Rajendra 박사의 그룹은 또 다른 변형을 도입했습니다. 즉, 그램 양의 치료 단백질을 생성하기 위해 안정적인 CHO 풀(마스터 웰 또는 클론 대신)을 사용하는 것입니다. Rajendra 박사는 "안정적인 CHO 풀을 생성하는 데 2-4주가 걸립니다. 대조적으로, 클론 CHO 세포주를 생성하는 데 보통 몇 개월이 걸립니다. 따라서 속도는 안정적인 풀의 주요 이점 중 하나입니다.

"또한 일시적인 발현에 비해 장점은 형질주입을 위해 더 적은 양의 플라스미드 DNA를 사용하고 부피 확장이 용이하며 냉동 세포 은행을 사용하여 장기간에 걸쳐 다중 생산을 수행할 수 있는 유연성을 포함합니다. 우리는 최근에 2~7.6g/L 범위의 CHO 풀 역가를 발표했습니다.”

Rajendra 박사는 현재 클론 이질성, 유전 및 발현 안정성, 제품 품질 일관성에 대한 우려로 인해 안정적인 풀이 전임상 물질 생성에 주로 사용된다고 밝혔습니다. 그러나 미래에는 안정 풀의 사용이 독성 로트의 생성과 최초의 인체 용량 연구로 확장될 수 있습니다.

Rajendra 박사는 "이 작업에는 시간이 걸리겠지만, 심층 제품 품질 평가를 가능하게 하는 숙주 세포 공학, 트랜스포존 매개 접근 방식 및 분석 도구의 발전을 고려할 때 '클론성' 패러다임에서 '제품 품질 일관성' 패러다임으로의 전환.

CHO의 당공학

널리 사용되지만 CHO 발현 시스템은 다른 포유동물 세포가 제기하는 것과 유사한 문제를 제시합니다. 특히, CHO 세포는 복합형 N-글리칸에서 이질적인 재조합 단백질을 생산합니다.

"당화는 단백질의 가장 중요한 번역 후 변형 중 하나입니다."라고 Johns Hopkins University(JHU)의 화학 및 생체 분자 공학과의 연구원인 Andrew(Cheng-Yu) Chung이 말했습니다. “단백질의 글리칸은 특히 단백질 접힘에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 그들은 단백질 안정성과 단백질-단백질 상호작용에 상당한 영향을 미칩니다.”

Michael J. Betenbaugh 박사의 연구실에 있는 Chung은 조작된 단백질의 시알화를 연구하고 있습니다. "시알산 그룹의 음전하, 크기 및 친수성 특성 때문에 시알화는 글리칸 말단의 매우 중요한 변형 중 하나입니다."라고 Chung은 설명했습니다. 이러한 특성으로 인해 시알산은 단백질-단백질 상호작용에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 시알화는 바이오 치료제의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.”

Chung과 동료들은 다양한 잠재적인 생물 치료제에 대한 시알화 함량 수준을 조절하기 위한 유전 공학 전략의 적용을 조사했습니다. "글리칸 구조를 조작하는 한 가지 일반적인 방법은 CRISPR/Cas9와 같은 유전 공학 도구를 통해 특정 당효소를 녹인/녹아웃하거나 과발현하는 것입니다."라고 그는 말했습니다. "예를 들어, 시알화 경로에 관여하는 당효소를 과발현하는 것은 순환 체류 시간(CRT)에 영향을 미칠 수 있는 시알산 함량이 증가된 생물학적 제제를 생산하기 위한 전략입니다. 증가된 CRT는 환자에게 더 낮은 용량을 의미할 수 있습니다.”

CHO 세포의 글리코실화를 보다 균일하고 인간 세포의 유사한 과정과 유사하게 만드는 또 다른 전략은 세포 배양 배지에 특정 화학 보충제를 첨가하는 것입니다.

Chung의 그룹은 유전 공학과 추가 배지 보충이라는 두 가지 전략을 동시에 시도하기로 결정했습니다. 정 교수는 “CHO 세포의 유전 공학은 시알릴화가 강화되고 단백질 역가가 높은 생물학적 제제를 생산하는 데 사용될 수 있다”고 지적했다. 이러한 접근 방식은 화학 보조제의 사용과 결합되었다고 Chung은 계속했습니다. 사료에 첨가되는 특정 화학 유사체는 JHU의 생물 의학 공학 부교수인 Kevin Yarema 박사에 의해 개발되었습니다.

곤충 세포 발현

대부분의 재조합 생물치료제는 포유류 세포에서 생산되지만 다른 것들은 곤충 세포에서 생산됩니다. 예를 들어, 곤충 세포 플랫폼은 Genocea Biosciences를 위한 재조합 단백질을 발현하기 위해 선택되었습니다.

"생식기 포진에 대한 우리의 치료 백신(GEN-003)은 보조제와 결합된 2개의 재조합 단백질로 구성됩니다."라고 단백질 생산 부국장인 Rajiv Gangurde 박사가 말했습니다. “두 단백질 모두 곤충 세포에서 발현됩니다.

"발현 플랫폼의 선택은 주로 활성에 필요한 특정 번역 후 변형, 즉 항원 중 하나에 의한 적절한 면역원성 반응을 이끌어내는 능력에 의해 결정되었습니다. 이러한 변형은 재조합 단백질이 발현되는 숙주 세포에만 국한되는 것이 아니라 인간에게도 잘 견딘다는 점은 곤충 세포를 사용하는 가장 큰 장점 중 하나”라고 말했다.

생식기 포진은 전 세계적으로 4억 명 이상, 미국에서만 5천만 명 이상이 영향을 미치는 심각한 만성 감염입니다. Rajiv 박사는 경구용 항바이러스제가 승인된 이후로 수십 년 동안 환자를 위한 진정한 혁신이 없었다고 지적했습니다.

Prior to expressing the product in insect cells, Dr. Rajiv and colleagues needed to overcome some specific hurdles. “Early on, we faced several challenges in developing manufacturing-compatible processes,” he noted. “We have overcome those hurdles through extensive in-house process development work and choosing a contract manufacturing organization with insect cell production scale-up experience.

“One protein is expressed as a soluble, secreted protein, while the other is an intracellular, insoluble protein. This fundamental difference in expression makes it easier to express the proteins separately. Moreover, there are notable differences in the levels of expression hence, independent expression allows the required flexibility in downstream processing and drug product manufacture.”

The company, which is conducting its third clinical trial with GEN-003, expects to start Phase III in the second half of next year. Next, the company plans to file a Biologics License Application with the FDA in 2019. If the application is approved, the company will launch GEN-003 in 2020.

“We believe we have established GEN-003 as a highly attractive product that requires only a once-yearly injection offering similar efficacy to that of daily oral antiviral therapy,” asserts Dr. Rajiv. “Given that most patients choose not to take daily oral anti-viral pills and accounting for compliance challenges with daily therapy, we believe the real-world efficacy of GEN-003 from an annual injection could translate into significant patient benefits and a revenue opportunity in excess of $1 billion in the United States alone.”


Genocea Biosciences’ Rajiv Gurde, Ph.D., utilizes insect cells to separately express two key recombinant proteins for the company’s therapeutic vaccine, GEN-003, against genital herpes.

RNAi to Enhance Expression

Aside from its traditional use as a workhorse technique for basic research, RNAi also has applications for improving protein expression.

“RNAi has been often applied in the fields of medical and basic research, especially to understand disease mechanisms,” reports Joseph Shiloach, Ph.D., director of the Biotechnology Core Laboratory, Intramural Research at the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health. “We decided to use it for identifying genes that are currently not known to be involved in protein expression, yet whose knockdown could improve recombinant protein production in mammalian cells.”

Dr. Shiloach and colleagues performed a genome-scale, high-throughput RNAi screen using HEK293 cells expressing firefly luciferase. “The basic idea was to individually knock down approximately 22,000 genes one at a time and look for those that affected expression, but did not affect cell growth,” explained Dr. Shiloach. “We utilized three different siRNAs for each gene and performed the work collaborating with the National Center for Advanced Translational Science.”

Among the “hits” identified was the gene for ornithine decarboxylase antizyme 1. The protein product helps regulate intracellular polyamines that are needed for cell growth and proliferation. “We also performed a detailed investigation to confirm the findings,” continued Dr. Shiloach. “We are now assessing the long-term effects of knockdown, the mechanisms involved in metabolism, and feasibility of extending this approach to other mammalian cells.”

According to Dr. Shiloach, the take-home message from these studies is that genome-scale RNAi screens can identify key pathways and genes whose modulation may help improve the expression and production of recombinant proteins. “These studies are more a beginning than an ending,” he stated. “But we have established a different foundation for the targeted design of more efficient mammalian cell expression platforms.”

Boosting Expression

Expression levels of recombinant proteins (simple proteins as well as complex biologics) can be unpredictable in mammalian cells, and this causes major headaches for target discovery and scale-up manufacture, according to Tom Payne, Ph.D., head of cell engineering at Oxford Genetics. Scientists are familiar with finding that sometimes proteins express at unexpectedly low levels, even when under the control of strong promoters (e.g., CMV).

“To minimize protein-to-protein variability and maximize yield, we adopted a high-throughput approach to screen and optimize >5,000 recombinant promoters by random shuffling, >30 5’ UTRs in different configurations and >15 poly-A signals,” said Dr. Payne. “We also developed Kozak and stop codon libraries and screened >1,000 genes from diverse organisms encoding putative ancillary protein to generate expression plasmids that consistently produce high yields of diverse proteins in HEK-293 and CHO systems, termed SnapFast Pro.”

Validating the System

To validate this vector system, Dr. Payne and his team compared protein yields to an industry-standard protein-expression vector. To maximize the relevance of the dataset they algorithmically determined the frequency with which each gene in the human genome had been cited in publications (PubMed hits, 2000–2016), identifying those genes consistently increasing in hits, as an indication of importance in biomedical research.

“The top 150 genes were batch codon-optimized, FLAG-tagged, and sub-cloned into the expression vector or SnapFast Pro,” continued Dr. Payne. “Following transient transfection into either CHO-K1 or HEK-293 cells, lysates and/or supernatants (depending on whether the protein is secreted) were subjected to high-throughput automated western blot. For both secreted and nonsecreted proteins, SnapFast Pro gave consistently high-level protein expression, in many cases showing high expression where no protein could be detected with the reference expression vector.”


Oxford Genetics is a specialist synthetic biology company focused on providing DNA, protein, virus, and cell-line design and development solutions. Two of the firm’s scientists can be seen working on a custom cell-line development project looking to optimize expression of a client’s gene of interest.


Protein Purification Strategies

Proteins are biological macromolecules that maintain the structural and functional integrity of the cell, and many diseases are associated with protein malfunction. Protein purification is a fundamental step for analyzing individual proteins and protein complexes and identifying interactions with other proteins, DNA or RNA. A variety of protein purification strategies exist to address desired scale, throughput and downstream applications. The optimal approach often must be determined empirically.

단백질 정제

The best protein purification protocol depends not only on the protein being purified but also on many other factors such as the cell used to express the recombinant protein (e.g., prokaryotic versus eukaryotic cells). 대장균 remains the first choice of many researchers for producing recombinant proteins due to ease of use, rapid cell growth and low cost of culturing. Proteins expressed in 대장균 can be purified in relatively high quantities, but these proteins, especially eukaryotic proteins, may not exhibit proper protein activity or folding. Cultured mammalian cells might offer a better option for producing properly folded and functional mammalian proteins with appropriate post-translational modifications (Geisse . 1996). However, the low expression levels of recombinant proteins in cultured mammalian cells presents a challenge for their purification. As a result, attaining satisfactory yield and purity depends on highly selective and efficient capture of these proteins from the crude cell lysates.

To simplify purification, affinity purification tags can be fused to a recombinant protein of interest (Nilsson . 1997). Common fusion tags are polypeptides, small proteins or enzymes added to the N- or C-terminus of a recombinant protein. The biochemical features of different tags influence the stability, solubility and expression of proteins to which they are attached (Stevens et al. 2001). Using expression vectors that include a fusion tag facilitates recombinant protein purification.

Isolation of Protein Complexes

A major objective in proteomics is the elucidation of protein function and organization of the complex networks that are responsible for key cellular processes. Analysis of protein:protein interactions can provide valuable insight into the cell signaling cascades involved in these processes, and analysis of protein:nucleic acid interactions often reveals important information about biological processes such as mRNA regulation, chromosomal remodeling and transcription. For example, transcription factors play an important role in regulating transcription by binding to specific recognition sites on the chromosome, often at a gene’s promoter, and interacting with other proteins in the nucleus. This regulation is required for cell viability, differentiation and growth (Mankan . 2009 Gosh . 1998).

Analysis of protein:protein interactions often requires straightforward methods for immobilizing proteins on solid surfaces in proper orientations without disrupting protein structure or function. This immobilization must not interfere with the binding capacity and can be achieved through the use of affinity tags. Immobilization of proteins on chips is a popular approach to analyze protein:DNA and protein:protein interactions and identify components of protein complexes (Hall . 2004 Hall et al. 2007 Hudson and Snyder, 2006). Functional protein microarrays normally contain full-length functional proteins or protein domains bound to a solid surface. Fluorescently labeled DNA is used to probe the array and identify proteins that bind to the specific probe. Protein microarrays provide a method for high-throughput identification of protein:DNA interactions. Immobilized proteins also can be used in protein pull-down assays to isolate protein binding partners in vivo (mammalian cells) or in vitro. Other downstream applications such as mass spectrometry do not require protein immobilization to identify protein partners and individual components of protein complexes.


내용물

Commonly used protein production systems include those derived from bacteria, [2] yeast, [3] [4] baculovirus/insect, [5] mammalian cells, [6] [7] and more recently filamentous fungi such as 균사체 써모필라. [8] When biopharmaceuticals are produced with one of these systems, process-related impurities termed host cell proteins also arrive in the final product in trace amounts. [9]

Cell-based systems Edit

The oldest and most widely used expression systems are cell-based and may be defined as the "combination of an expression vector, its cloned DNA, and the host for the vector that provide a context to allow foreign gene function in a host cell, that is, produce proteins at a high level". [10] [11] Overexpression is an abnormally and excessively high level of gene expression which produces a pronounced gene-related phenotype. [12] [13]

There are many ways to introduce foreign DNA to a cell for expression, and many different host cells may be used for expression — each expression system has distinct advantages and liabilities. Expression systems are normally referred to by the host and the DNA source or the delivery mechanism for the genetic material. For example, common hosts are bacteria (such as 대장균, B. subtilis), yeast (such as S.cerevisiae [4] ) or eukaryotic cell lines. Common DNA sources and delivery mechanisms are viruses (such as baculovirus, retrovirus, adenovirus), plasmids, artificial chromosomes and bacteriophage (such as lambda). The best expression system depends on the gene involved, for example the 사카로마이세스 세레비지애 is often preferred for proteins that require significant posttranslational modification. Insect or mammal cell lines are used when human-like splicing of mRNA is required. Nonetheless, bacterial expression has the advantage of easily producing large amounts of protein, which is required for X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance experiments for structure determination.

Because bacteria are prokaryotes, they are not equipped with the full enzymatic machinery to accomplish the required post-translational modifications or molecular folding. Hence, multi-domain eukaryotic proteins expressed in bacteria often are non-functional. Also, many proteins become insoluble as inclusion bodies that are difficult to recover without harsh denaturants and subsequent cumbersome protein-refolding.

To address these concerns, expressions systems using multiple eukaryotic cells were developed for applications requiring the proteins be conformed as in, or closer to eukaryotic organisms: cells of plants (i.e. tobacco), of insects or mammalians (i.e. bovines) are transfected with genes and cultured in suspension and even as tissues or whole organisms, to produce fully folded proteins. 포유류 생체 내 expression systems have however low yield and other limitations (time-consuming, toxicity to host cells. ). To combine the high yield/productivity and scalable protein features of bacteria and yeast, and advanced epigenetic features of plants, insects and mammalians systems, other protein production systems are developed using unicellular eukaryotes (i.e. non-pathogenic 'Leishmania' cells).

Bacterial systems Edit

대장균 편집하다

대장균 is one of the most widely used expression hosts, and DNA is normally introduced in a plasmid expression vector. The techniques for overexpression in 대장균 are well developed and work by increasing the number of copies of the gene or increasing the binding strength of the promoter region so assisting transcription.

For example, a DNA sequence for a protein of interest could be cloned or subcloned into a high copy-number plasmid containing the 라크 (often LacUV5) promoter, which is then transformed into the bacterium 대장균. Addition of IPTG (a lactose analog) activates the lac promoter and causes the bacteria to express the protein of interest.

대장균 strain BL21 and BL21(DE3) are two strains commonly used for protein production. As members of the B lineage, they lack lon 그리고 OmpT proteases, protecting the produced proteins from degradation. The DE3 prophage found in BL21(DE3) provides T7 RNA polymerase (driven by the LacUV5 promoter), allowing for vectors with the T7 promoter to be used instead. [14]

코리네박테리움 편집하다

Non-pathogenic species of the gram-positive 코리네박테리움 are used for the commercial production of various amino acids. NS C. 글루타미쿰 species is widely used for producing glutamate and lysine, [15] components of human food, animal feed and pharmaceutical products.

Expression of functionally active human epidermal growth factor has been done in C. 글루타미쿰, [16] thus demonstrating a potential for industrial-scale production of human proteins. Expressed proteins can be targeted for secretion through either the general, secretory pathway (Sec) or the twin-arginine translocation pathway (Tat). [17]

Unlike gram-negative bacteria, the gram-positive 코리네박테리움 lack lipopolysaccharides that function as antigenic endotoxins in humans.

슈도모나스 플루오레센스 편집하다

The non-pathogenic and gram-negative bacteria, 슈도모나스 플루오레센스, is used for high level production of recombinant proteins commonly for the development bio-therapeutics and vaccines. P. 형광 is a metabolically versatile organism, allowing for high throughput screening and rapid development of complex proteins. P. 형광 is most well known for its ability to rapid and successfully produce high titers of active, soluble protein. [18]

Eukaryotic systems Edit

Yeasts Edit

Expression systems using either S. 세레비지애 또는 피치아 파스토리스 allow stable and lasting production of proteins that are processed similarly to mammalian cells, at high yield, in chemically defined media of proteins.

Filamentous fungi Edit

Filamentous fungi, especially 아스페르길루스 그리고 Trichoderma, but also more recently 균사체 써모필라 C1 [8] have been developed into expression platforms for screening and production of diverse industrial enzymes. The expression system C1 shows a low viscosity morphology in submerged culture, enabling the use of complex growth and production media.

바큘로바이러스-infected cells Edit

Baculovirus-infected insect cells [19] (Sf9, Sf21, High Five strains) or mammalian cells [20] (HeLa, HEK 293) allow production of glycosylated or membrane proteins that cannot be produced using fungal or bacterial systems. [19] It is useful for production of proteins in high quantity. Genes are not expressed continuously because infected host cells eventually lyse and die during each infection cycle. [21]

Non-lytic insect cell expression Edit

Non-lytic insect cell expression is an alternative to the lytic baculovirus expression system. In non-lytic expression, vectors are transiently or stably transfected into the chromosomal DNA of insect cells for subsequent gene expression. [22] [23] This is followed by selection and screening of recombinant clones. [24] The non-lytic system has been used to give higher protein yield and quicker expression of recombinant genes compared to baculovirus-infected cell expression. [23] Cell lines used for this system include: Sf9, Sf21 from 스포도프테라 프루기페르다 cells, Hi-5 from 트리코플러스시아 니 cells, and Schneider 2 cells and Schneider 3 cells from 초파리 멜라노가스터 세포. [22] [24] With this system, cells do not lyse and several cultivation modes can be used. [22] Additionally, protein production runs are reproducible. [22] [23] This system gives a homogeneous product. [23] A drawback of this system is the requirement of an additional screening step for selecting viable clones. [24]

굴착기 편집하다

Leishmania tarentolae (cannot infect mammals) expression systems allow stable and lasting production of proteins at high yield, in chemically defined media. Produced proteins exhibit fully eukaryotic post-translational modifications, including glycosylation and disulfide bond formation. [ 인용 필요 ]

Mammalian systems Edit

The most common mammalian expression systems are Chinese Hamster ovary (CHO) and Human embryonic kidney (HEK) cells. [25] [26] [27]

    [26] myeloma lymphoblstoid (e.g. NS0 cell) [25]
  • Fully Human
    • Human embryonic kidney cells (HEK-293) [26]
    • Human embryonic retinal cells (Crucell's Per.C6) [26]
    • Human amniocyte cells (Glycotope and CEVEC)

    Cell-free systems Edit

    Cell-free production of proteins is performed 시험관 내 using purified RNA polymerase, ribosomes, tRNA and ribonucleotides. These reagents may be produced by extraction from cells or from a cell-based expression system. Due to the low expression levels and high cost of cell-free systems, cell-based systems are more widely used. [28]


    추가 정보

    Authors' contributions

    GC and VS designed the experiments. GC, VS and MG performed the experiments. AP developed the models and AP and DdB conducted simulations. AP, GC and DdB drafted the manuscript. DdB and MdB conceived and supervised the collaboration and overall strategy of the project and edited the manuscript. All authors have read and approved the final manuscript.

    Giulia Cuccato, Athanasios Polynikis contributed equally to this work.


    Customer Testimonial for our Protein Expression & Purification Services

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    — Dr. Barry Bradford, Kansas State University, Department of Animal Sciences & Industry