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DNA의 열적 안정성을 결정하는 매개변수

DNA의 열적 안정성을 결정하는 매개변수


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GC 함량이 높은 DNA가 GC 함량이 적은 DNA보다 더 안정적인 이유는 무엇입니까? AT 염기쌍보다 하나 더 많은 GC 염기쌍의 3개의 수소 결합 때문입니까, 아니면 GC 염기쌍의 더 안정적인 염기 스태킹 때문입니까? 내 책에서는 그것이 수소 결합 때문이라고 나와 있지만 연구 기사에서는 베이스 스태킹이 열 안정성만 결정한다고 말하는 것을 발견했습니다. 여기에 링크 설명 입력


GC 결합은 AT 결합보다 더 안정적이어야 하지만 더 높은 결합 에너지(3개 수소 결합 대 2개)로 인해 GC 결합은 DNA의 안정화 요소로 간주되는 스태킹 에너지입니다.

우리는 스태킹 용어의 온도 및 염 의존성이 DNA 안정성 매개변수의 온도 및 염 의존성을 완전히 결정한다는 것을 발견했습니다. 현재 연구에 사용된 모든 온도 및 염 농도에 대해 염기 적층은 DNA 이중 나선의 주요 안정화 요소입니다. A•T 페어링은 항상 불안정하고 G•C 페어링은 안정화에 거의 기여하지 않습니다. Base-stacking 상호작용은 전체 이중체의 안정성뿐만 아니라 서열에 대한 이중체 안정성의 의존성에 크게 기여합니다.

그 이유는 여러 가닥의 서로 다른 구성에서 동일한 수의 쌍을 가질 수 있기 때문입니다. 이는 적층 상호 작용이 없는 한 높은 엔트로피와 불안정성을 의미합니다. 이것이 대부분의 DNA 및 RNA 나선 모델이 적층 에너지 추가를 기반으로 하는 이유입니다. 특히 RNA의 경우 개시 에너지, 내부 루프와 관련된 에너지 등 일부 추가 기여가 있습니다.


PCR 순환 매개변수&ndash성공을 위한 6가지 주요 고려 사항

적절한 양의 DNA 입력 및 PCR 구성 요소가 결정되면 효율적인 증폭을 위해 PCR 사이클링 및 실행 매개변수를 설정해야 합니다. DNA 중합효소의 특성, PCR 버퍼의 유형 및 템플릿 DNA의 복잡성은 모두 이러한 반응 조건의 설정에 영향을 미칩니다. 이 페이지의 섹션에서는 PCR 프로세스의 주요 단계에 대한 설명으로 시작하여 PCR 사이클링 매개변수에 대한 일반적인 고려 사항에 대해 설명합니다. (그림 1).

이 페이지에서:

그림 1. 템플릿 DNA에서 표적 서열을 증폭하기 위한 PCR의 주요 단계(변성, 어닐링, 확장)의 그림.

비디오: PCR의 원리

PCR은 표적 DNA 서열을 증폭하기 위해 세 가지 열 순환 단계에 의존합니다. 이 비디오는 이 세 단계가 PCR에서 어떻게 작동하는지 설명합니다.


중합효소 연쇄 반응에 의한 증폭을 향상시키기 위한 공용매의 사용

아빠. 랑드르, . NS. 왓슨, PCR 전략에서, 1995년

열안정성에 대한 공용매의 영향 탁 DNA 중합효소

의 열안정성 DNA 중합효소는 앞서 설명한 대로 결정되었습니다(그림 2). 97.5 °C에서, DNA 중합효소에는 반감기가 있습니다(NS1/2) 11분의 정상 상태 열 비활성화 후(그림 2A). 95 °C에서 NS1/2 40분이다(도 2B). 글리세롤은 열안정성을 향상시킵니다. 97.5 °C에서 20% 글리세롤로 11분에서 60분 이상. 포름아미드는 열안정성을 95.0 °C에서 40분에서 5% 포름아미드로 16분, 10% 포름아미드로 2분으로 줄입니다. 글리세롤과 포름아미드를 결합하면 열안정성이 향상됩니다. 포름아미드 단독: 5% 포름아미드 및 10% 글리세롤은 NS1/2 5% 포름아미드 단독의 경우 16분과 비교하여 24분입니다.

그림 2. 열안정성 97.5° 및 95°C에서 공용매의 존재하에 DNA 중합효소. 의 열안정성 DNA 중합효소는 정상 상태 열 비활성화에 의해 결정되었습니다. 열 비활성화는 95° 또는 97.5°C의 항온 수조에서 수행되었습니다. 온도는 보정된 온도계를 사용하여 모니터링했으며 실험 중에 0.5°C 이하로 변동했습니다. 효소는 다음을 포함하는 표준 GeneAmp PCR 마스터 믹스에서 준비되었습니다: 10 pmol 람다 프라이머 1 및 2 200 μM 각 dATP, dTTP 및 dGTP 1.25U DNA 중합효소 0.5ng 람다 템플릿 1 × PCR 완충액 및 공용매. 포함된 PCR 버퍼: 10m미디엄 Tris–HCl, pH 8.3 50m미디엄 KCI와 2m미디엄 마그네슘2. 오십 μl을 0.5 ml 튜브에 분배하고 50 μl 가벼운 미네랄 오일. 다섯 μ각 튜브의 l은 이전에 설명한 대로 활성화된 연어 정자 DNA에 표지된 뉴클레오티드 모노포스페이트를 통합하여 DNA 중합효소 활성에 대해 이중으로 분석되었습니다. 각 시점에 대한 남은 활성 백분율은 각 효소에 대한 초기 활성의 일부로 결정되었습니다. 반감기, NS1/2, 활동이 50% 남아 있는 시간이었습니다. 패널 A는 열적 비활성화를 보여줍니다. 글리세롤이 있는 상태에서 97.5°C에서 DNA 중합효소. 패널 B는 열 비활성화를 보여줍니다. 글리세롤과 포름아미드의 조합으로 95°C에서.

표 1A는 열안정성에 대한 단일 공용매의 영향을 요약합니다. 시도된 공용매 중 글리세롤만이 열안정성을 향상시켰습니다. . 다른 공용매는 열안정성을 감소시켰고, NMP는 5% NMP에서 가장 극적으로 효소가 97.5°C에서 즉시 비활성화되었습니다. 표 1B는 글리세롤과 NMP 또는 포름아미드의 조합에 대한 요약을 보여줍니다. 두 경우 모두 글리세롤은 NMP 또는 포름아미드의 열 비활성화를 개선했습니다.

표 1A. 열안정성에 대한 단일 공용매의 효과

NS1/2(분)
공용매97.5 °C
홀로9–11
글리세린1%13
10%33
20%&gt 60
DMSO1%10
10%6
20%4
포름아미드1%9
10%1.5
20%3
NMP0.5%6
1%4
5%0
KCl50m미디엄9–11
25m미디엄7
10m미디엄5
0m미디엄3
케이2그래서4100m미디엄&gt 35
50m미디엄35
25m미디엄20
5m미디엄7

표 1B. 공용매와 열안정성의 조합

NS1/2 (mm)
공용매95 °C97.5 °C
홀로4011
글리세린10%&gt 6023
포름아미드5%163
10%2&lt 1
10% 글리세롤–5% 포름아미드 245
10% 글리세롤–10% 포름아미드 41.5
NMP0.5%266
글리세린5%&gt 6020
10%&gt 6023
15%&gt 6032
0.5% NMP-5% 글리세롤 3211
0.5% NMP-10% 글리세롤 4214
0.5% NMP-15% 글리세롤 3818

한 번 읽고 절대 쓰지 않는 보관 스토리지(액세스 빈도는 1회에 한 번

DNA 기반 정보 저장에 대한 가장 가능성 있는 첫 번째 응용 프로그램 중 하나는 수십 년 또는 수세기에 걸쳐 역사적 또는 기타 기록을 보존하기 위한 장기 '콜드' 저장이 될 것입니다. 이는 DNA 합성 및 시퀀싱의 현재 높은 비용이 드물게 발생하고 수년에 걸쳐 상각될 때 정당화될 수 있기 때문입니다. 이러한 응용 분야에서 중요한 것은 DNA의 장기적 안정성에 대한 강한 이해입니다.

수백만 년 된 영구 동토층에 보존된 화석이나 미생물에서 DNA를 성공적으로 회수하는 것은 일반적으로 DNA 17,18의 장기적 안정성에 대한 동기를 부여하는 증거로 사용됩니다. 그러나 고려해야 할 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 첫째, 이러한 결과 중 일부가 현대 박테리아 또는 인간 DNA 19의 잠재적인 오염으로 인해 잘못 해석되었다는 상당한 우려가 있습니다. 따라서 이론적 계산 19과 물리적 측정 20 간의 대략적인 일치에 기초하여 천연 샘플에서 DNA를 회수하는 데 대한 현재 최상의 추정치는 약 400,000년이며, 이러한 샘플의 주요 분해 메커니즘은 DNA의 PCR 기반 증폭 및 검출.

둘째, 천연 시료의 DNA 안정성 추정은 DNA 저장 응용 분야에 대해 지나치게 낙관적일 수 있습니다. 화석에서 DNA를 복구하는 맥락에서 리보솜 및 미토콘드리아 DNA는 종종 다른 종의 유기체를 식별하는 데 사용되지만 세포당 수백 개의 사본으로 존재할 수 있습니다. 그러나 실제로 게놈 DNA 서열이 다중 복제 미토콘드리아 DNA보다 복구하기 훨씬 더 어려울 때 이들은 DNA의 성공적인 분리를 주장할 때 사용되는 서열입니다. 따라서 일부 DNA는 화석화되거나 영구 동토층 샘플에서 회수될 수 있지만, 상당한 분해로 인해 종종 가장 풍부한 서열만 탐지할 수 있습니다. 이것은 화석화된 DNA의 추정된 반감기가 단지

500년, 상대적으로 추운 영구동토층 온도(5.5E-6/nt/yr * 242 nt * 500 년)에서 평균 242-nt 길이의 미토콘드리아 DNA 서열을 가정할 때 연간 5.50E-6의 뉴클레오티드 단편화 비율에 해당

50%) 17 . 이는 DNA 신호를 복구하는 것으로 추정되는 400,000년보다 훨씬 짧은 기간입니다. 따라서 암호화 전략과 물리적 중복성의 양에 따라 데이터의 상당 부분을 복구할 수 있어야 하는 DNA 저장 응용 프로그램의 맥락에서 화석화된 DNA의 데이터를 기반으로 하는 저장 시스템의 '유용한' 안정성은 수백 년 이하.

천연 영구 동토층이나 화석화된 시료, 일반적으로 동결된 수성 시료에는 상당한 안정성 한계가 있을 수 있지만 다행히도 DNA 저장 시스템은 안정성을 크게 높일 수 있는 고도로 통제된 재료와 환경 조건으로 설계할 수 있습니다. 여러 접근 방식이 테스트되었으며 대부분은 인산염 백본의 가수분해를 줄이기 위해 탈수된 형태의 DNA를 포함합니다. 예를 들어, DNA는 Flinders Technology Associate(FTA) 필터 카드에 흡착되어 상용 제품 DNA Stable과 같은 생체 고분자 저장 매트릭스에 저장되거나 실크 매트릭스에 내장되거나 단순히 동결 건조된 분말 20,21로 저장됩니다. 많은 경우에 매트릭스에 DNA가 흡착되면 DNA가 안정화됩니다. 예를 들어, 25, 37 및 45°C에서 40일 동안 실크에 포함된 DNA의 80%는 보호되지 않은 경우 22%에 비해 복구 가능했습니다. 실크는 또한 자외선에 대한 보호 기능을 제공했습니다. 염은 또한 특히 높은 주변 습도에 대해 건조된 DNA에 대한 안정화 효과를 제공하는 것으로 나타났으며 DNA를 상대적으로 접근 가능한 상태로 유지하면서 높은 DNA 로딩(>20 wt%)을 유지할 수 있습니다.

테스트한 다양한 방법 중 현재 최고의 안정성을 일관되게 나타내는 현재의 주요 접근 방식은 실리카, 산화철 또는 이 둘의 조합으로 구성된 무기 매트릭스 내에서 DNA를 캡슐화하는 것입니다. 여러 그룹에서 캡슐화가 DNA 안정성 24,25,26,27을 실질적으로 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다. 예를 들어, Puddu와 동료들은 캡슐화된 DNA의 안정성을 100°C에서 30분 동안 보호되지 않은 DNA와 직접 비교했습니다. 캡슐화된 DNA의 80%가 회수된 반면 보호되지 않은 건조된 DNA의 0.05%만이 살아남았습니다. Grass와 동료들은 실리카 입자로 캡슐화하면 실온에서 20-90년, 9.4°C에서 2000년, -18°C에서 200만년 이상 동안 DNA를 유지할 수 있다고 추정했습니다. 이러한 추정치는 60~70°C의 고온에 노출된 DNA에서 얻은 데이터에 적용된 노화 가속화 모델에서 파생되었습니다. 몇 가지 연구에서 실제 데이터를 인코딩하는 다양한 DNA 가닥 집단이 노화 가속화 후에 해독되어 반감기의 추정치뿐 아니라 완전한 파일을 검색할 수 있다는 증거를 제공했습니다 24,25 . 여러 경우에 데이터가 여러 번 검색되고 다시 포함될 수 있지만 성능 저하가 관찰되었습니다. 이러한 시스템의 '중단점'은 열화 허용 인코딩을 가능하게 하기 위해 희생되는 밀도 오버헤드와 물리적 중복성에 따라 달라집니다.

이 연구는 특히 실리카에 캡슐화된 DNA의 장기간 안정성에 대한 실질적인 증거를 제공합니다. 그러나 고려해야 할 몇 가지 잠재적인 제한 사항이 있습니다. 첫째, 캡슐화 및 검색의 물리적 프로세스에는 시간이 걸리므로 이 접근 방식이 냉장 보관 응용 프로그램에 가장 적합합니다. 둘째, DNA의 캡슐화는 본질적으로 저장 시스템의 정보 밀도를 감소시킵니다. 실리카 최종 캡슐화를 통해 DNA와 양이온성 폴리에틸렌이민을 교대로 사용하는 층별 설계는 이러한 시스템에서 현재까지 최고의 저장 밀도를 달성했습니다.

3.4중량% DNA 25 . 이것은 정보 밀도에서 1-2차수의 희생이지만, 1-2차수의 밀도를 희생하면서 기존의 저장 매체에 비해 DNA 저장의 5-6차수 이점을 감안할 때 순수한 DNA만큼 조밀하지는 않습니다. 여전히 매우 공간 효율적인 시스템을 생성합니다.

DNA 가닥의 크기도 중요한 설계 고려 사항입니다. DNA 저장 분야의 한 가지 희망은 더 긴 DNA 가닥을 만들 수 있는 합성 기술을 개발하는 것입니다. 더 긴 가닥의 이점은 파일 주소와 인덱스에 할당되는 가닥당 오버헤드 비율을 줄여 시스템의 정보 밀도를 높이는 것입니다. 그러나 이전 작업에서는 가닥 길이가 증가함에 따라 밀도와 관련하여 수익이 감소하는 것을 이미 제안했습니다 3 . 더 짧은 DNA 가닥의 사용을 뒷받침하는 경험적 증거는 짧은 가닥이 환경 손상에 더 탄력적임을 시사합니다. 예를 들어, 830 W/m 2 의 햇빛 조사에 노출되면 53 nt DNA 가닥과 비교하여 113 nt의 경우 거의 2 배 더 큰 분해가 발생했습니다. DNA 저장 시스템에서 UV에 지속적으로 노출되는 것은 불가능하지만 길이에 따른 분해 민감도의 일반적인 원리를 반영할 수 있습니다. 실제로, 다른 환경 손상은 90°C 열처리에 노출되어 더 긴 가닥 28에 대해 거의 300배 더 큰 분해를 초래하는 반면, 더 짧은 가닥은 동결-해동 주기에 더 탄력적이며 유사한 길이 의존성을 나타냅니다. 29 이들은 가속화된 분해 연구이기 때문에 더 긴 가닥이 실제 사용을 위해 충분히 안정적일 가능성이 높지만 더 짧은 가닥 길이는 개선된 안정성 프로필을 제공할 가능성이 높습니다.

마지막으로, 겉보기에는 단순해 보이지만 장기간 DNA 안정성을 정확하게 결정하는 것은 사소하거나 해결된 문제가 아니라는 점에 주목하는 것이 중요합니다. 두 가지 주요 과제가 있습니다. 첫째, 수억 년 또는 수백만 년의 안정성 예측으로 이어질 수 있는 많은 연구에서 사용되는 가속 노화 모델은 본질적으로 외삽이므로 장기간에 걸쳐 실제 안정성에서 벗어날 수 있습니다. 이것은 장기간에 걸쳐 중요하지만 특히 많은 모델에서 일반적으로 가정하는 온도에 대한 기하급수적 의존성을 나타내지 않는 알려지지 않은 분해 메커니즘이 있는 경우에 특히 그렇습니다. 데이터 검색의 정확성이 저온 저장 시스템에서 가장 중요하다는 점을 감안할 때 온도 이외의 다른 매개변수로 인한 가속화된 저하를 평가하는 추가 연구는 외삽 안정성에 대한 신뢰도를 높일 것입니다. 예를 들어, 고온을 통해 인위적으로 노화를 가속화할 뿐만 아니라 전자기 방사선 및/또는 아원자 입자에 대한 높은 노출을 통해 노화를 가속화하는 모델을 포함하여 DNA 안정성의 보다 포괄적인 기계론적 모델을 개발하기 위해 보다 다양한 보관 조건을 테스트해야 합니다. 분자 수준에서 pH, 가수분해 및 습도, 기계적 재배열(예: 동결 해동, 액체 취급). 또한 DNA 농도 및 캡슐화 조건은 DNA 분자 사이 또는 DNA와 캡슐화 물질 사이의 화학적 상호 작용에서 발생하는 분해 메커니즘이 있을 수 있으므로 안정성에 고유한 영향을 미칠 수 있습니다.

가속 노화 연구의 두 번째 과제는 분해를 측정하는 방법이 종종 충분히 민감하지 않기 때문에 큰 분해 효과에 의존하거나 결과를 왜곡하거나 편향시킬 수 있는 증폭 단계(예: PCR을 통한)가 필요하다는 것입니다. 이러한 문제는 장기적인 안정성을 평가하기 위해 새로운 미래의 금본위제에 동기를 부여합니다. 새로운 접근 방식에는 매우 드문 분해 이벤트를 감지하기 위한 단기 샘플의 심층 차세대 시퀀싱 조합이 포함될 수 있습니다. 또한, 해당 분야에서 인간 세대 이상의 과정에 걸쳐 DNA 안정성에 대한 실시간, 비가속, 장기 연구를 공동으로 시작하고 이러한 결과를 심층적으로 시퀀싱된 단기 연구와 비교하는 것이 바람직할 수 있습니다. 가속 분해의 다른 모드를 사용하는 것과 같습니다. 이는 안정성을 모니터링하고 장기적 안정성에 대한 통찰력을 제공하기 위한 방법으로 실제 상업적으로 활성인 저장 시스템에서 수행될 수 있습니다. 이 작업은 주요 분해 모드와 노화에 대한 상대적 기여를 식별하기 위해 다양한 환경 모욕에 대한 연구와 짝을 이룰 수 있습니다. 전반적으로 이 데이터는 과거에 생성된 DNA 저장 시스템의 안정성을 업데이트 및 벤치마킹하고 안정성을 예측하는 모델을 지속적으로 알리고 조정하는 데 사용할 수 있습니다.


내용물

전기영동은 크기에 따라 분자를 분류할 수 있는 과정입니다. 전기장을 사용하여 분자(예: DNA)가 아가로스 또는 폴리아크릴아미드로 만들어진 겔을 통해 이동하도록 만들 수 있습니다. 전기장은 분자를 젤을 통해 밀어내는 한쪽 끝의 음전하와 겔을 통해 분자를 당기는 다른 쪽 끝의 양전하로 구성됩니다. 분류되는 분자는 겔 재료의 웰에 분배됩니다. 젤을 전기 영동 챔버에 넣은 다음 전원에 연결합니다. 전기장이 가해지면 더 큰 분자는 젤을 통해 더 천천히 이동하고 더 작은 분자는 더 빠르게 이동합니다. 크기가 다른 분자는 겔에서 별개의 밴드를 형성합니다. [4]

이 경우 "겔"이라는 용어는 표적 분자를 포함하고 분리하는 데 사용되는 매트릭스를 나타냅니다. 대부분의 경우 겔은 분석 대상의 비중과 조성에 따라 조성과 다공성이 선택되는 가교 중합체입니다. 단백질 또는 작은 핵산(DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드)을 분리할 때 젤은 일반적으로 다양한 농도의 아크릴아미드와 가교제로 구성되어 다양한 크기의 폴리아크릴아미드 메쉬 네트워크를 생성합니다. 더 큰 핵산(수백 염기 이상)을 분리할 때 선호되는 매트릭스는 정제된 아가로스입니다. 두 경우 모두 겔은 단단하지만 다공성인 매트릭스를 형성합니다. 폴리아크릴아미드와 달리 아크릴아미드는 신경독이며 중독을 피하기 위해 적절한 안전 예방책을 사용하여 취급해야 합니다. Agarose는 가교가 없는 긴 비분지형 비하전 탄수화물 사슬로 구성되어 있어 거대분자와 거대분자 복합체를 분리할 수 있는 큰 구멍이 있는 겔을 생성합니다. [5]

전기 영동은 겔 매트릭스를 통해 분자를 이동시키는 데 사용되는 기전력(EMF)을 나타냅니다. 분자를 겔의 우물에 넣고 전기장을 가하면 분자는 모든 종의 전하 대 질량 비율(Z)이 균일할 때 질량에 의해 결정되는 다른 속도로 매트릭스를 통해 이동할 것입니다. 그러나 전하가 모두 균일하지 않은 경우 전기영동 절차에 의해 생성된 전기장은 전하에 따라 분자가 차등적으로 이동하게 합니다. 순 양으로 하전된 종은 음으로 하전된 음극으로 이동하는 반면(이것은 갈바니 전지가 아닌 전해 전지이기 때문에), 순 음으로 하전된 종은 양으로 하전된 양극으로 이동합니다. 질량은 이러한 불균일하게 하전된 분자가 매트릭스를 통해 각각의 전극으로 이동하는 속도의 한 요인으로 남아 있습니다. [6]

여러 샘플이 겔의 인접한 웰에 로드된 경우 개별 레인에서 병렬로 실행됩니다. 서로 다른 분자의 수에 따라 각 레인은 구성 요소당 하나의 밴드인 하나 이상의 별개의 밴드로 원래 혼합물에서 구성 요소의 분리를 보여줍니다. 구성 요소가 불완전하게 분리되면 밴드가 겹치거나 확인되지 않은 여러 구성 요소를 나타내는 구별할 수 없는 얼룩이 생길 수 있습니다. [ 인용 필요 ] 상단에서 동일한 거리에 있는 서로 다른 레인의 밴드에는 동일한 속도로 젤을 통과한 분자가 포함되어 있는데, 이는 일반적으로 크기가 거의 같다는 것을 의미합니다. 알려진 크기의 분자 혼합물을 포함하는 사용 가능한 분자량 크기 마커가 있습니다. 이러한 마커가 미지의 샘플과 평행한 겔의 한 레인에서 실행된 경우 관찰된 밴드를 미지의 밴드와 비교하여 크기를 결정할 수 있습니다. 밴드가 이동하는 거리는 분자 크기의 로그에 대략 반비례합니다. [ 인용 필요 ]

전기 영동 기술에는 한계가 있습니다. 겔에 전류를 흐르게 하면 가열되기 때문에 전기영동 중에 겔이 녹을 수 있다. 전기영동은 전기장으로 인한 pH 변화를 줄이기 위해 완충용액에서 수행되는데, 이는 DNA와 RNA의 전하가 pH에 의존하기 때문에 중요하지만 너무 오래 실행하면 용액의 완충 용량이 소진될 수 있습니다. 또한 SDS-PAGE로 분자량을 결정하는 데에는 한계가 있으며, 특히 미지의 단백질의 분자량을 찾으려고 할 때 그렇습니다. 특정 생물학적 변수는 최소화하기 어렵거나 불가능하며 전기영동 이동에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 요인에는 단백질 구조, 번역 후 변형 및 아미노산 조성이 포함됩니다. 예를 들어, 트로포미오신은 SDS-PAGE 젤에서 비정상적으로 이동하는 산성 단백질입니다. 이는 산성 잔류물이 음으로 하전된 SDS에 의해 반발되어 부정확한 질량 대 전하 비율 및 이동을 초래하기 때문입니다. [7] 또한, 유전 물질의 다른 준비는 형태학적 또는 기타 이유로 서로 일관되게 이동하지 않을 수 있습니다.

가장 일반적으로 사용되는 겔 유형은 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔입니다. 각 유형의 겔은 다양한 유형과 크기의 분석 물질에 적합합니다. Polyacrylamide 젤은 일반적으로 단백질에 사용되며 DNA의 작은 조각(5-500 bp)에 대해 매우 높은 분해능을 가지고 있습니다. 반면 Agarose gel은 DNA 분해능이 낮으나 분리 범위가 넓어 일반적으로 50~20,000bp 크기의 DNA 조각에 사용되지만 Pulsed field에서는 6Mb 이상의 분해능이 가능합니다. 겔 전기영동(PFGE). [8] 폴리아크릴아미드 젤은 수직 구성으로 실행되는 반면 아가로스 젤은 일반적으로 잠수함 모드에서 수평으로 실행됩니다. 그들은 또한 아가로즈가 열적으로 경화되는 반면 폴리아크릴아미드는 화학 중합 반응에서 형성되기 때문에 주조 방법이 다릅니다.

아가로즈 편집

Agarose 젤은 해조류에서 추출한 천연 다당류 폴리머로 만들어집니다. Agarose 젤은 젤 세팅이 화학적 변화가 아니라 물리적이기 때문에 다른 매트릭스에 비해 쉽게 주조되고 취급됩니다. 샘플도 쉽게 회수할 수 있습니다. 실험이 끝나면 생성된 젤을 비닐 봉지에 담아 냉장고에 보관할 수 있습니다.

Agarose gel은 pore 크기가 균일하지 않지만 200kDa 이상의 단백질 전기영동에 최적입니다. [9] 아가로스 겔 전기영동은 50개 염기쌍에서 수 메가 염기(수백만 염기)에 이르는 DNA 단편의 분리에도 사용할 수 있습니다. 인용 필요 ] , 그 중 가장 큰 것은 특수 장치가 필요합니다. 길이가 다른 DNA 밴드 사이의 거리는 겔의 아가로스 백분율에 의해 영향을 받으며 백분율이 높을수록 더 긴 실행 시간, 때로는 며칠이 필요합니다. 대신 높은 비율의 아가로스 겔은 펄스 전기장 전기영동(PFE) 또는 전기장 반전 전기영동으로 실행해야 합니다.

"대부분의 아가로스 겔은 전기영동 완충액에 용해된 0.7%(큰 5–10kb DNA 단편의 우수한 분리 또는 분해능)와 2%(작은 0.2–1kb 단편의 우수한 분해능) 사이의 아가로스로 만들어집니다. 최대 3%까지 사용할 수 있습니다. 아주 작은 조각을 분리하지만 수직 폴리아크릴아미드 젤이 이 경우 더 적합합니다. 낮은 비율의 젤은 매우 약하고 들어 올리려고 할 때 부서질 수 있습니다. 높은 비율의 젤은 종종 부서지기 쉽고 고르게 설정되지 않습니다. 1% 젤은 일반적으로 많은 응용 프로그램." [10]

폴리아크릴아미드

폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)은 폴리아크릴아미드 겔이 제공하는 균일한 기공 크기로 인해 5~2,000kDa 크기 범위의 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 겔 생성에 사용되는 아크릴아미드 및 비스-아크릴아미드 분말의 농도를 조절하여 모공 크기를 제어합니다. 아크릴아미드는 액체 및 분말 형태의 강력한 신경독이므로 이러한 유형의 젤을 만들 때는 주의해야 합니다.

Maxam-Gilbert 또는 Sanger 방법과 같은 전통적인 DNA 시퀀싱 기술은 폴리아크릴아미드 젤을 사용하여 길이가 단일 염기쌍만큼 다른 DNA 단편을 분리하여 시퀀스를 읽을 수 있었습니다. 오늘날 대부분의 현대 DNA 분리 방법은 특히 작은 DNA 단편을 제외하고는 아가로스 겔을 사용합니다. 현재 면역학 및 단백질 분석 분야에서 가장 많이 사용되며, 서로 다른 단백질 또는 동일한 단백질의 동형을 별도의 밴드로 분리하는 데 자주 사용됩니다. 이들은 웨스턴 블롯에서와 같이 항체 및 해당 마커로 프로브될 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막으로 옮겨질 수 있습니다.

일반적으로 분해 젤은 6%, 8%, 10%, 12% 또는 15%로 만들어집니다. 스태킹 젤(5%)을 분해 젤 위에 붓고 젤 빗(웰을 형성하고 단백질, 샘플 버퍼 및 사다리가 배치될 레인을 정의함)을 삽입합니다. 선택한 백분율은 샘플에서 식별하거나 프로브하려는 단백질의 크기에 따라 다릅니다. 알려진 가중치가 작을수록 사용해야 하는 백분율이 높아집니다. 겔의 버퍼 시스템에 대한 변경은 매우 작은 크기의 단백질을 추가로 분해하는 데 도움이 될 수 있습니다. [11]

전분 편집

부분적으로 가수분해된 감자 전분은 단백질 전기영동을 위한 또 다른 무독성 배지를 만듭니다. 젤은 아크릴아미드나 아가로스보다 약간 더 불투명합니다. 변성되지 않은 단백질은 전하와 크기에 따라 분리될 수 있다. 나프탈 ​​블랙 또는 아미도 블랙 염색을 사용하여 시각화합니다. 전형적인 전분 겔 농도는 5%에서 10%입니다. [12] [13] [14]

변성 편집

변성 젤은 분석물의 자연 구조를 방해하여 선형 사슬로 펼쳐지는 조건에서 실행됩니다. 따라서 각 거대분자의 이동성은 선형 길이와 질량 대 전하 비율에만 의존합니다. 따라서 2차, 3차 및 4차 수준의 생체 분자 구조가 붕괴되어 1차 구조만 분석할 수 있습니다.

핵산은 종종 완충액에 요소를 포함하여 변성되는 반면, 단백질은 일반적으로 SDS-PAGE 공정의 일부로 나트륨 도데실 설페이트를 사용하여 변성됩니다. 단백질의 완전한 변성을 위해서는 3차 및 4차 구조를 안정화시키는 이황화 공유 결합을 환원시키는 것도 필요하며, 이를 환원 PAGE라고 합니다. 환원 조건은 일반적으로 베타-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨을 첨가하여 유지됩니다. 단백질 샘플의 일반적인 분석을 위해 PAGE를 줄이는 것이 단백질 전기영동의 가장 일반적인 형태입니다.

RNA의 적절한 분자량 추정을 위해서는 변성 조건이 필요합니다. RNA는 DNA보다 분자내 상호작용을 더 많이 형성할 수 있어 전기영동 이동성을 변화시킬 수 있습니다. 요소, DMSO 및 글리옥살은 RNA 구조를 파괴하기 위해 가장 흔히 사용되는 변성제입니다. 원래 고독성 methylmercury hydroxide는 RNA 전기영동을 변성시키는 데 자주 사용되었지만[15] 일부 샘플에서는 선택되는 방법일 수 있습니다. [16]

변성 겔 전기영동은 DNA 및 RNA 밴딩 패턴 기반 방법 온도 구배 겔 전기영동(TGGE)[17] 및 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)에 사용됩니다. [18]

네이티브 편집

네이티브 겔은 분석물의 자연 구조가 유지되도록 비변성 조건에서 실행됩니다. 이를 통해 접힌 또는 조립된 복합체의 물리적 크기가 이동성에 영향을 미치므로 생체 분자 구조의 4가지 수준 모두를 분석할 수 있습니다. 생물학적 시료의 경우 세제는 세포의 지질막을 용해하는 데 필요한 정도로만 사용됩니다. 복합체는 대부분의 경우 세포에 있는 것처럼 결합되고 접힌 상태로 남아 있습니다. 그러나 한 가지 단점은 분자의 모양과 크기가 이동성에 어떤 영향을 미칠지 예측하기 어렵기 때문에 복합체가 명확하게 또는 예측 가능하게 분리되지 않을 수 있다는 것입니다. 이 문제를 해결하고 해결하는 것이 정량적 네이티브 PAGE의 주요 목표입니다.

천연 겔 전기영동은 변성법과 달리 하전된 변성제를 사용하지 않습니다. 따라서 분리되는 분자(보통 단백질 또는 핵산)는 분자량 및 고유 전하뿐 아니라 단면적도 다르므로 전체 구조의 모양에 따라 다른 전기영동력을 경험합니다. 단백질의 경우 본래의 상태를 유지하기 때문에 일반 단백질 염색 시약뿐만 아니라 특정 효소 결합 염색으로도 가시화될 수 있다.

천연 겔 전기영동을 적용한 구체적인 실험 예는 단백질 정제 과정에서 시료 내 효소의 존재를 확인하기 위해 효소 활성을 확인하는 것입니다. 예를 들어, 단백질 알칼리성 포스파타제의 경우 염색 용액은 Tris 완충액에서 4-클로로-2-2메틸벤젠디아조늄염과 3-포스포-2-나프토산-2'-4'-디메틸 아닐린의 혼합물입니다. 이 얼룩은 젤을 염색하기 위한 키트로 상업적으로 판매됩니다. 단백질이 존재하는 경우, 반응 메커니즘은 다음과 같은 순서로 발생합니다. 이는 알칼리성 포스파타제에 의한 3-포스포-2-나프토산-2'-4'-디메틸 아닐린의 탈인산화로 시작됩니다(물이 필요함 반응을 위해). 인산염 그룹은 방출되고 물에서 알코올 그룹으로 대체됩니다. 친전자체 4-클로로-2-2 메틸벤젠디아조늄(Fast Red TR Diazonium 염)은 최종 생성물인 Red Azo 염료를 형성하는 알코올 그룹을 대체합니다. 이름에서 알 수 있듯이 이것은 반응의 최종 가시적색 생성물입니다. 단백질 정제에 대한 학부 학술 실험에서 젤은 일반적으로 결과를 시각화하고 정제가 성공적인지 여부를 결정하기 위해 상용 정제된 샘플 옆에 실행됩니다. [20]

기본 겔 전기영동은 일반적으로 단백질체학 및 금속체학에 사용됩니다. 그러나 기본 PAGE는 단일 가닥 형태 다형성에서와 같이 알려지지 않은 돌연변이에 대해 유전자(DNA)를 스캔하는 데에도 사용됩니다.

겔 전기영동의 완충액은 전류를 전달하는 이온을 제공하고 pH를 비교적 일정한 값으로 유지하는 데 사용됩니다. 이 완충액에는 전기가 통과하는 데 필요한 많은 이온이 있습니다. 증류수나 벤젠과 같은 것은 이온이 거의 포함되어 있지 않아 전기영동에 사용하기에 적합하지 않습니다. 전기영동에 사용되는 완충액은 여러 가지가 있다. 가장 일반적인 것은 핵산 Tris/Acetate/EDTA(TAE), Tris/Borate/EDTA(TBE)입니다. 다른 많은 버퍼가 제안되었습니다. Pubmed citations (LB), isoelectric histidine, pK matching goods buffers 등을 기반으로 거의 사용되지 않는 리튬 붕산염. 대부분의 경우 주장된 근거는 더 낮은 전류(더 적은 열) 일치 이온 이동성으로 인해 버퍼 수명이 길어집니다. 붕산염은 문제가 있습니다. 붕산염은 중합되거나 RNA에서 발견되는 것과 같은 시스 디올과 상호 작용할 수 있습니다. TAE는 완충 용량이 가장 낮지만 더 큰 DNA에 대해 최상의 분해능을 제공합니다. 이것은 더 낮은 전압과 더 많은 시간을 의미하지만 더 나은 제품입니다. LB는 비교적 새롭기 때문에 5kbp보다 큰 조각을 분리하는 데 효과적이지 않습니다. 그러나 전도도가 낮기 때문에 훨씬 더 높은 전압(최대 35V/cm)을 사용할 수 있으므로 일상적인 전기 영동의 경우 분석 시간이 단축됩니다. As low as one base pair size difference could be resolved in 3% agarose gel with an extremely low conductivity medium (1 mM Lithium borate). [22]

Most SDS-PAGE protein separations are performed using a "discontinuous" (or DISC) buffer system that significantly enhances the sharpness of the bands within the gel. During electrophoresis in a discontinuous gel system, an ion gradient is formed in the early stage of electrophoresis that causes all of the proteins to focus on a single sharp band in a process called isotachophoresis. Separation of the proteins by size is achieved in the lower, "resolving" region of the gel. The resolving gel typically has a much smaller pore size, which leads to a sieving effect that now determines the electrophoretic mobility of the proteins.

After the electrophoresis is complete, the molecules in the gel can be stained to make them visible. DNA may be visualized using ethidium bromide which, when intercalated into DNA, fluoresce under ultraviolet light, while protein may be visualised using silver stain or Coomassie Brilliant Blue dye. Other methods may also be used to visualize the separation of the mixture's components on the gel. If the molecules to be separated contain radioactivity, for example in a DNA sequencing gel, an autoradiogram can be recorded of the gel. Photographs can be taken of gels, often using a Gel Doc system.

After separation, an additional separation method may then be used, such as isoelectric focusing or SDS-PAGE. The gel will then be physically cut, and the protein complexes extracted from each portion separately. Each extract may then be analysed, such as by peptide mass fingerprinting or de novo peptide sequencing after in-gel digestion. This can provide a great deal of information about the identities of the proteins in a complex.

  • Estimation of the size of DNA molecules following restriction enzyme digestion, e.g. in restriction mapping of cloned DNA.
  • Analysis of PCR products, e.g. in molecular genetic diagnosis or genetic fingerprinting
  • Separation of restricted genomic DNA prior to Southern transfer, or of RNA prior to Northern transfer.

Gel electrophoresis is used in forensics, molecular biology, genetics, microbiology and biochemistry. The results can be analyzed quantitatively by visualizing the gel with UV light and a gel imaging device. The image is recorded with a computer operated camera, and the intensity of the band or spot of interest is measured and compared against standard or markers loaded on the same gel. The measurement and analysis are mostly done with specialized software.

Depending on the type of analysis being performed, other techniques are often implemented in conjunction with the results of gel electrophoresis, providing a wide range of field-specific applications.

핵산 편집

In the case of nucleic acids, the direction of migration, from negative to positive electrodes, is due to the naturally occurring negative charge carried by their sugar-phosphate backbone. [23]

Double-stranded DNA fragments naturally behave as long rods, so their migration through the gel is relative to their size or, for cyclic fragments, their radius of gyration. Circular DNA such as plasmids, however, may show multiple bands, the speed of migration may depend on whether it is relaxed or supercoiled. Single-stranded DNA or RNA tends to fold up into molecules with complex shapes and migrate through the gel in a complicated manner based on their tertiary structure. Therefore, agents that disrupt the hydrogen bonds, such as sodium hydroxide or formamide, are used to denature the nucleic acids and cause them to behave as long rods again. [24]

Gel electrophoresis of large DNA or RNA is usually done by agarose gel electrophoresis. See the "Chain termination method" page for an example of a polyacrylamide DNA sequencing gel. Characterization through ligand interaction of nucleic acids or fragments may be performed by mobility shift affinity electrophoresis.

Electrophoresis of RNA samples can be used to check for genomic DNA contamination and also for RNA degradation. RNA from eukaryotic organisms shows distinct bands of 28s and 18s rRNA, the 28s band being approximately twice as intense as the 18s band. Degraded RNA has less sharply defined bands, has a smeared appearance, and intensity ratio is less than 2:1.

단백질 편집

Proteins, unlike nucleic acids, can have varying charges and complex shapes, therefore they may not migrate into the polyacrylamide gel at similar rates, or all when placing a negative to positive EMF on the sample. Proteins therefore, are usually denatured in the presence of a detergent such as sodium dodecyl sulfate (SDS) that coats the proteins with a negative charge. [3] Generally, the amount of SDS bound is relative to the size of the protein (usually 1.4g SDS per gram of protein), so that the resulting denatured proteins have an overall negative charge, and all the proteins have a similar charge-to-mass ratio. Since denatured proteins act like long rods instead of having a complex tertiary shape, the rate at which the resulting SDS coated proteins migrate in the gel is relative only to its size and not its charge or shape. [삼]

Proteins are usually analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), by native gel electrophoresis, by preparative gel electrophoresis (QPNC-PAGE), or by 2-D electrophoresis.

Characterization through ligand interaction may be performed by electroblotting or by affinity electrophoresis in agarose or by capillary electrophoresis as for estimation of binding constants and determination of structural features like glycan content through lectin binding.

Nanoparticles Edit

A novel application for the gel electrophoresis is to separate or characterize metal or metal oxide nanoparticles (e.g. Au, Ag, ZnO, SiO2) regarding the size, shape, or surface chemistry of the nanoparticles. The scope is to obtain a more homogeneous sample (e.g. narrower particle size distribution), which than can be used in further products/processes (e.g. self-assembly processes). For the separation of nanoparticles within a gel, the particle size about the mesh size is the key parameter, whereby two migration mechanisms where identified: the unrestricted mechanism, where the particle size << mesh size, and the restricted mechanism, where particle size is similar to mesh size. [25]

  • 1930s – first reports of the use of sucrose for gel electrophoresis
  • 1955 – introduction of starch gels, mediocre separation (Smithies) [13]
  • 1959 – introduction of acrylamide gels disc electrophoresis (Ornstein and Davis) accurate control of parameters such as pore size and stability and (Raymond and Weintraub)
  • 1966 – first use of agar gels [26]
  • 1969 – introduction of denaturing agents especially SDS separation of protein subunit (Weber and Osborn) [27]
  • 1970 – Laemmli separated 28 components of T4 phage using a stacking gel and SDS
  • 1972 – agarose gels with ethidium bromide stain [28]
  • 1975 – 2-dimensional gels (O’Farrell) isoelectric focusing then SDS gel electrophoresis
  • 1977 – sequencing gels
  • 1983 – pulsed field gel electrophoresis enables separation of large DNA molecules
  • 1983 – introduction of capillary electrophoresis
  • 2004 – introduction of a standardized time of polymerization of acrylamide gels enables clean and predictable separation of native proteins (Kastenholz) [29]

A 1959 book on electrophoresis by Milan Bier cites references from the 1800s. [30] However, Oliver Smithies made significant contributions. Bier states: "The method of Smithies . is finding wide application because of its unique separatory power." Taken in context, Bier clearly implies that Smithies' method is an improvement.


내용물

Affinity Edit

  • between any kind of biomolecules [1] including proteins, DNA, [2]RNA, [3] peptides, [4]small molecules, [5]fragments[6] and ions
  • for interactions with high molecular weight complexes, large molecule assemblies, even with liposomes, [7]vesicles, nanodiscs, [8]nanoparticles[9] and viruses
  • in any buffer, including serum and cell lysate [4]
  • in competition experiments (for example with substrate and inhibitors)

Thermodynamic parameters Edit

MST has been used to estimate the enthalpic and entropic contributions to biomolecular interactions. [10]

Additional information Edit

MST is based on the quantifiable detection of a fluorescence change in a sample when a temperature change is applied. The fluorescence of a target molecule can be extrinsic or intrinsic (aromatic amino acids) and is altered in temperature gradients due to two distinct effects. On the one hand temperature related intensity change (TRIC), which describes the intrinsic property of fluorophores to change their fluorescence intensity as a function of temperature. The extent of the change in fluorescence intensity is affected by the chemical environment of the fluorescent probe, which can be altered in binding events due to conformational changes or proximity of ligands. [11] [12] On the other hand, MST is also based on the directed movement of molecules along temperature gradients, an effect termed thermophoresis. A spatial temperature difference ΔT leads to a change in molecule concentration in the region of elevated temperature, quantified by the Soret coefficient SNS:c더운/c추운 = exp(-SNS ΔT). [13] [14] Both, TRIC and thermophoresis contribute to the recorded signal in MST measurements in the following way: ∂/∂T(cF)=c∂F/∂T+F∂c/∂T. The first term in this equation c∂F/∂T describes TRIC as a change in fluorescence intensity (F) as a function of temperature (T), whereas the second term F∂c/∂T describes thermophoresis as the change in particle concentration (c) as a function of temperature. Thermophoresis depends on the interface between molecule and solvent. Under constant buffer conditions, thermophoresis probes the size, charge and solvation entropy of the molecules. The thermophoresis of a fluorescently labeled molecule A typically differs significantly from the thermophoresis of a molecule-target complex AT due to size, charge and solvation entropy differences. This difference in the molecule's thermophoresis is used to quantify the binding in titration experiments under constant buffer conditions.

The thermophoretic movement of the fluorescently labelled molecule is measured by monitoring the fluorescence distribution F inside a capillary. The microscopic temperature gradient is generated by an IR-Laser, which is focused into the capillary and is strongly absorbed by water. The temperature of the aqueous solution in the laser spot is raised by ΔT=1-10 K. Before the IR-Laser is switched on a homogeneous fluorescence distribution F추운 is observed inside the capillary. When the IR-Laser is switched on, two effects, occur on the same time-scale, contributing to the new fluorescence distribution F더운. The thermal relaxation induces a binding-dependent drop in the fluorescence of the dye due to its local environmental-dependent response to the temperature jump (TRIC). At the same time molecules typically move from the locally heated region to the outer cold regions. The local concentration of molecules decreases in the heated region until it reaches a steady-state distribution.

While the mass diffusion D dictates the kinetics of depletion, SNS determines the steady-state concentration ratio c더운/c추운=exp(-SNS ΔT) ≈ 1-SNS ΔT under a temperature increase ΔT. The normalized fluorescence F표준=F더운/NS추운 measures mainly this concentration ratio, in addition to TRIC ∂F/∂T. In the linear approximation we find: F표준=1+(∂F/∂T-SNS)ΔT. Due to the linearity of the fluorescence intensity and the thermophoretic depletion, the normalized fluorescence from the unbound molecule F표준(A) and the bound complex F표준(AT) superpose linearly. By denoting x the fraction of molecules bound to targets, the changing fluorescence signal during the titration of target T is given by: F표준=(1-x) F표준(A)+x F표준(AT). [11]

Quantitative binding parameters are obtained by using a serial dilution of the binding substrate. By plotting F표준 against the logarithm of the different concentrations of the dilution series, a sigmoidal binding curve is obtained. This binding curve can directly be fitted with the nonlinear solution of the law of mass action, with the dissociation constant KNS as result. [15] [16] [17]


Template DNA denaturation assessment

The initial denaturation step is carried out at the beginning of PCR to separate the double-stranded template DNA into single strands so that the primers can bind to the target region and initiate extension. Complete denaturation of the input DNA helps ensure efficient amplification of the target sequence during the first amplification cycle. Furthermore, the high temperature at this step helps inactivate heat-labile proteases or nucleases that may be present in the sample, with minimal impact on thermostable DNA polymerases. When using a hot-start DNA polymerase, this step also serves to activate the enzyme, although a separate activation step may be recommended by the enzyme supplier.

The initial denaturation step is commonly performed at 94–98°C for 1–3 minutes. The time and temperature of this step can vary depending on the nature of the template DNA and salt concentrations of buffer. For example, mammalian genomic DNA may require longer incubation periods than plasmids and PCR products, based on DNA complexity and size. Similarly, DNA with high GC content (e.g., >65%) often calls for longer incubation or higher temperature for denaturation (그림 2). Buffers with high salts (as required by some DNA polymerases) generally need higher denaturation temperatures (e.g., 98°C) to separate double-stranded DNA (그림 3).

Figure 2. Increasing the initial denaturation time improves the PCR yield of a GC-rich, 0.7 kb fragment amplified from a human gDNA sample. The initial denaturation steps were set to 0, 0.5, 1, 3, and 5 minutes respectively.

Some DNA polymerases such as DNA polymerase can become easily denatured from prolonged incubation above 95°C. To compensate for decreased activity in this scenario, more enzymes may be added after the initial denaturation step, or a higher-than-recommended amount of DNA polymerase can be added at the beginning. Highly thermostable enzymes such as those derived from Archaea are able to withstand prolonged high temperatures and remain active throughout PCR (learn more about DNA polymerase characteristics).


A compiled standalone Java application is available for download as Supplementary Software 1. The genetic algorithm used to optimize SCEPTTr requires human input to further optimize the values used. For this reason, it is available from the corresponding author upon reasonable request.

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Architecture of nonspecific protein–DNA interactions in the Sso7d–DNA complex

Many biochemical processes, including DNA packing, maintenance and control, rely on non-sequence specific protein–DNA interactions. Nonspecific DNA-binding proteins have evolved to tolerate a wide range of DNA sequences, yet bind with a respectable affinity. The nonspecific binding requirement is in contrast to that imposed on, for example, transcription factors and implies a different structural basis for the biomolecular recognition process. To address this issue, and the mechanism for archaeal DNA packing, we determined the structure of the Sso7d protein from 설포로부스 솔파타리쿠스 in complex with DNA. Sso7d binds DNA by placing a triple-stranded β-sheet across the DNA minor groove. The protein is anchored in this position by the insertion of hydrogen bond-donating side chains into the groove and additionally stabilized by electrostatic and non-polar interactions with the DNA backbone. This structure explains how strong binding can be achieved independent of DNA sequence. Sso7d binding also distorts the DNA conformation and introduces significant unwinding of the helix. This effect suggests a mechanism for DNA packing in 설포로부스 based on negative DNA supercoiling.


Applications of Thermal Denaturation Methods

Thermal denaturation methods (예를 들어, DSF and DSLS) have recently been optimized for high-throughput screening applications 1,2,5 (1 번 테이블), including chemical profiling of different protein families, identifying novel ligands, 10,48–50 and investigating the stability of large numbers of proteins in buffers with different chemical compositions. 1,14,51–55 For example, DSF has been applied to the screening of monoclonal antibody formulations. Antibodies were screened in many different buffers, and the elevated aggregation levels induced by salt, pH, and high protein concentrations were successfully assessed. 36 In addition, the effects of ions on protein stability, such as the effects of Ca 2+ and Mg 2+ on collapsin response mediator protein 2 (CRMP-2), have been investigated by using DSF. 52 DSF has been used in the search for buffer conditions that reduce aggregation levels. 36,42 However, initial protein aggregation level can only be directly monitored by DSLS. 1,5,22 Thermal denaturation methods have been widely used to investigate changes in the stability of proteins encoded by genes with single nucleotide polymorphisms (SNPs) 56 or point mutations, 57 and comparing the stability of different isoforms 58 or mutants of the same protein. 59

Table 1. Applications of High Throughput Thermal Denaturation Methods

DSF, differential scanning fluorimetry DSLS, differential static light scattering ITD, isothermal denaturation.



코멘트:

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