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DNA 분자를 중수로 표지하는 메커니즘은 무엇입니까?

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나는 중수를 사용하여 분열하는 세포를 따라간다는 논문을 본 적이 있습니다. 중수는 새로 합성된 DNA 분자에 통합될 것이라고 가정했습니다. 복제 과정에서 물이 직접적으로 포함됩니까? 양성자 교환이 있습니까?

방법을 설명하는 논문은 여기에서 찾을 수 있습니다: http://www.pnas.org/content/105/16/6115.full.pdf


나는 라벨링이 NTP를 감소시켜 dNTPS를 형성할 때 발생한다고 가정합니다.

이 과정(리보뉴클레오타이드 환원효소에 의해 촉매됨)은 2' 탄소의 하이드록실 그룹을 양성자화하여 물로 남게 한 다음 새로 형성된 탄수화물에 수소화물을 추가하는 것을 포함합니다. 2개의 수소 원자(양성자 및 수소화물)는 ​​효소의 2개 티올에서 유래하며, 이 과정에서 이황화 결합을 형성하기 위해 산화됩니다.

요점은 중수가 있을 때 두 티올이 수소를 중수소로 빠르게 교환한다는 것입니다. 즉, 탄수화물에 첨가되는 수소화물은 중수소가 되고 결과적으로 dNTP는 중수소로 표시됩니다.

이것은 황-수소 결합(용매와 빠르게 교환되는)의 수소를 사용하여 탄소-수소 결합(용매와 빠르게 교환되지 않음)이 형성되기 때문에 라벨이 작동하는 것을 상상할 수 있는 유일한 단계입니다. ).


중수소 동위원소 효과 및 표지 패턴에 의해 연구된 유로카나아제의 메커니즘

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발명의 배경

본 발명은 일반적으로 프로테옴 분석에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 분자의 분석 및 정량을 위해 샘플 내의 분자에 작용기를 전달하는 방법에 관한 것이다.

생물학적 공정을 연구하기 위한 고전적인 생화학적 접근은 공정을 구성하는 특정 활성의 순차적인 분별 및 분석 주기에 의한 균질성을 위한 정제, 분리된 각 구성요소의 상세한 구조, 기능 및 조절 분석 및 재구성에 기반을 두고 있습니다. 분리된 구성 요소에서 프로세스의 인간 게놈 프로젝트 및 기타 게놈 시퀀싱 프로그램은 특정 종의 완전한 게놈 서열, 따라서 원칙적으로 해당 종에 의해 잠재적으로 암호화되는 모든 단백질의 아미노산 서열의 완전한 게놈 서열을 빠르게 연속적으로 밝혀내고 있습니다. 생물학 역사상 유례가 없는 이 정보 자원은 전통적인 연구 방법을 향상시키고 근본적으로 다른 연구 패러다임(그 중 하나가 단백질체학)의 발전을 촉진할 것으로 기대됩니다.

다수의 다른 종의 게놈과 함께 전체 인간 게놈의 서열을 결정하려는 노력은 매우 성공적이었다. 46종의 미생물(TIGR Microbial Database www.tigr.org)의 게놈이 완성되었으며 120여 종의 다른 미생물의 게놈이 시퀀싱되고 있습니다. 추가적으로, 진핵생물의 보다 복잡한 게놈, 특히 유전적으로 잘 특성화된 단세포 유기체 Saccharomyces cerevisiae와 다세포 종 Caenorhabditis elegans 및 Drosophila melanogaster의 게놈이 완전히 시퀀싱되었습니다. 또한 벼, 인간 및 애기장대 게놈의 "초안 서열"이 발표되었습니다. 완전한 게놈 서열이 없는 경우에도 210만 명이 넘는 인간과 120만 개 이상의 뮤린 발현 서열 태그(EST)를 포함하는 풍부한 DNA 서열 데이터베이스가 공개적으로 이용 가능하게 되었습니다.

EST는 cDNA 라이브러리에서 클론의 체계적인 단일 패스 시퀀싱에 의해 생성되는 부분 유전자 서열을 나타내는 대략 300 내지 500개의 인접 뉴클레오티드의 스트레치입니다. 진화를 제외하고 대부분의 생물학적 과정의 시간 척도에서 게놈 DNA 서열은 정적인 것으로 볼 수 있으므로 게놈 서열 데이터베이스는 라이브러리와 유사한 정보 자원을 나타냅니다. 시퀀스 데이터베이스의 개별 시퀀스에 "기능"을 할당하기 위한 집중적인 노력이 진행 중입니다. 이것은 알려진 기능을 가진 서열 패밀리에 대한 서열의 통계적으로 유의한 유사성을 나타내는 선형 서열 모티프 또는 고차 구조 모티프의 컴퓨터 분석 또는 종에 걸친 상동 단백질 기능의 비교와 같은 다른 수단에 의해 시도됩니다. 안티센스 뉴클레오타이드 기술을 사용한 유전자 녹아웃 및 유전자 발현 억제와 같은 실험 방법을 포함하여 개별 서열의 기능을 결정하기 위해 다른 방법도 사용되어 왔으며, 이는 시간이 많이 걸리고 어떤 경우에는 생물학적 기능을 할당하기에는 여전히 불충분합니다. 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드.

프로테옴은 게놈에 의해 발현되는 단백질 보체로 정의되어 왔다. 이 다소 제한적인 정의는 프로테옴의 정적 특성을 의미합니다. 실제로 프로테옴은 발현된 단백질의 유형, 풍부함, 변형 상태, 세포내 위치, 폴리펩타이드 및 핵산과 같은 다른 생체분자와의 상호작용이 세포 또는 조직의 생리학적 상태에 의존하기 때문에 매우 역동적입니다. 따라서 프로테옴은 세포 상태 또는 세포가 직면하는 외부 조건을 반영할 수 있으며, 프로테옴 분석은 세포 상태를 분화 및 연구하고 이를 제어하는 ​​분자 메커니즘을 결정하기 위한 게놈 전체 분석으로 볼 수 있습니다. 분화된 세포의 프로테옴이 수천에서 수만 가지 유형의 단백질로 구성되는 것으로 추정되고 추정된 동적 발현 범위가 5배 이상임을 고려하면 프로테옴 분석에 대한 전망은 벅차게 보입니다. 그러나 잠재적으로 발현되는 모든 단백질의 서열을 나열하는 DNA 데이터베이스의 가용성과 실제로 발현되는 단백질을 식별할 수 있는 기술의 급속한 발전과 결합하여 이제 단백질체학은 현실적인 제안이 되었습니다. 질량 분석은 현재의 proteomics 기술이 서 있는 필수적인 다리 중 하나입니다.

정량적 프로테오믹스는 세포 또는 조직에 의해 발현되는 모든 단백질의 양 및 동일성에 대한 체계적인 분석이다. 주어진 시간에 세포, 조직, 생물학적 유체 또는 단백질 복합체에서 발현되는 단백질은 그 당시의 세포 또는 조직의 상태를 정확하게 정의합니다. 다른 상태에서 동일한 세포 유형의 단백질 프로필 간의 양적 및 질적 차이는 각 상태 간의 전환을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 전통적으로, 단백질체 분석은 단백질을 분리하기 위한 고해상도 겔 전기영동, 특히 2차원 겔 전기영동과 단백질을 식별하기 위한 질량 분석법의 조합을 사용하여 수행되었습니다. 이 접근법은 순차적이고 지루하지만, 더 중요하게는 생물학적으로 중요한 부류의 단백질이 본질적으로 검출 불가능하다는 점에서 근본적으로 제한적이다(Gygi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9390-9395 (2000)).

다수의 종의 게놈 서열의 완성은 일반적으로 발견 과학으로 지칭되는 생물학에 대한 새로운 접근을 촉진시켰다. 발견 과학의 본질은 세포나 조직에 의해 발현되는 특정 분자 부류의 모든 구성원에 대한 체계적이고 정량적인 분석입니다. 발견 과학의 예시적인 구현에는 유전자 발현 어레이 및 정량적 프로테오믹스에 의한 세포 또는 조직에 의해 발현되는 mRNA 분자의 체계적인 분석, 생물학적 샘플에 포함된 단백질의 체계적인 분석이 포함됩니다. 발견 과학의 주요 목적은 생체 분자의 체계적인 측정과 세포의 전이를 제어하는 ​​분자 메커니즘의 식별에서 얻은 데이터를 기반으로 세포 또는 조직의 상태(활성, 병리, 스트레스)를 설명하는 것입니다. 두 상태를 나타내는 세포의 분자 구성을 비교 분석하여 한 상태에서 다른 상태로. 세포 상태에 대한 분자 설명과 이를 제어하는 ​​메커니즘은 가능한 한 많은 매개변수가 바람직합니다. 현재 발현 어레이 방법은 세포에서 mRNA 분자의 체계적인 분석을 허용합니다.

최근에, 생물학적 샘플에 존재하는 단백질을 체계적으로 식별하고 정량화하는데 적합한 동위원소 코딩된 친화성 태그 및 질량 분석법이라고 하는 시약 부류에 기초한 방법이 기술되었다. 단백질 인산화 및 기타 번역 후 변형과 같은 세포 상태와 관련된 기타 특성과 단백질 또는 핵산 이외의 생체 분자(예: 지질, 2차 전달자, 대사 산물)의 정량적 프로파일은 체계적이고 정량적으로 측정하기 어렵습니다. 현재 기술로.

따라서, 세포 내 분자의 분석을 위한 신속하고 효율적이며 비용 효과적인 방법이 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시키고 또한 관련된 이점을 제공한다.


중수로 DNA 분자를 표지하는 메커니즘은 무엇입니까? - 생물학

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합성 펩타이드 및 단백질의 부위 특이적 라벨링

부위 특이적 13C 및 15N 라벨링은 너무 작아서 재조합으로 발현되기에는 너무 작은 폴리펩타이드 또는 균일하게 13C 라벨링된 스펙트럼을 분석하기에는 너무 큰 단백질에 대한 풍부한 구조적 정보를 계속 제공합니다. 40개 아미노산보다 짧은 폴리펩티드의 경우 화학적 합성이 일반적으로 가능하므로 보호된 형태의 13C, 15N 표지된 아미노산이 부위 특이적 표지를 위해 펩티드 합성에 포함될 수 있습니다.

일반적인 부위 특이적 아미노산 라벨링 전략은 흩어져 있는 균일한 13C, 15N 잔기의 라벨링입니다. 펩티드 합성의 수율이 엄청나게 낮지 않은 한, U-13 C, 15 N-표지된 잔기가 다른 여러 샘플의 조합은 결국 관심 폴리펩티드의 완전한 구조를 매핑할 수 있습니다. 이 접근법은 아밀로이드 펩티드 29 및 막 펩티드 30-32를 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 특정 아미노산 잔기의 불균일한 13C 및 15N 라벨링도 적용되었습니다. 가장 일반적으로 표지된 부위는 폴리펩타이드 백본의 13 CO, 때로는 라이신 잔기의 측쇄 15 N입니다. 응용 프로그램에는 일반적으로 이핵 REDOR 33 또는 동핵 13 C 커플링 34 실험을 사용한 거리 측정이 포함됩니다.

대부분의 펩타이드는 Fmoc 고체상 화학을 사용하여 합성되기 때문에 부위 특이적 아미노산 표지에는 Fmoc 보호 아미노산이 필요합니다. 소수성 아미노산의 경우 Fmoc로 보호된 형태는 일반적으로 상업적으로 이용 가능하며 보호되지 않은 형태에서도 쉽게 합성할 수 있습니다. 반면에 극성 아미노산은 백본과 측쇄 보호를 모두 필요로 하므로 제조 비용이 더 많이 들고 어렵습니다. Fmoc 고체상 합성이 펩타이드 합성에서 지배적인 화학인 반면, t-Boc 고체상 합성은 흥미로운 구조 결정 대상 35에도 사용되었습니다. Boc 보호 13 C, 15 N 표지 아미노산은 훨씬 덜 일반적입니다. 따라서, t-Boc-보호된 아미노산의 상업적 생산 증가 및 가용성이 바람직합니다.


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과학

372권, 6538호
2021년 4월 9일

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D. Sorigué, K. Hadjidemetriou, S. Blangy, G. Gotthard, A. Bonvalet, N. Coquelle, P. Samire, A. Aleksandrov, L. Antonucci, A. Benachir, S. Boutet, M. Byrdin, M Cammarata , S. Carbajo , S. Cuiné , RB Doak , L. Foucar , A. Gorel , M. Grünbein , E. Hartmann , R. Hienerwadel , M. Hilpert , M. Kloos , TJ Lane , B. Légeret , P Legrand, Y. Li-Beisson, SLY Moulin, D. Nurizzo, G. Peltier, G. Schirò, RL Shoeman, M. Sliwa, X. Solinas, B. Zhuang, TRM Barends, J.-P. Colletier, M. Joffre, A. Royant, C. Berthomieu, M. Weik, T. Domratcheva, K. Brettel, M. H. Vos, I. Schlichting, P. Arnoux, P. Müller, F. Beisson

광효소의 스냅샷은 지방산 탈카르복실화 동안 구조적 변화를 보여줍니다.


단백질𠄽NA 상호작용의 핵자기공명 분석

용액 상태 핵 자기 공명의 최근 방법론적 및 도구적 발전은 거대 고분자 복합체와 같은 구조 생물학의 도전적인 문제를 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 이 검토는 단백질-DNA 복합체의 구조를 해결하고 그 역학을 분석하기 위해 현재 사용되는 실험 전략에 중점을 둡니다. 이러한 접근 방식이 표적 인식의 상세한 분자 메커니즘을 이해하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 강조합니다.

1. 소개

전사, DNA 복제 및 복구는 DNA 결합 단백질에 의한 극도로 엄격한 조절이 필요한 주요 동적 세포 과정입니다. 특히, 이러한 단백질은 다량의 비특이적 DNA 결합 부위가 있는 경우 특정 DNA 표적을 인식해야 합니다.

대부분의 경우, 전사 인자는 DNA 인식에 특화된 DNA 결합 도메인[2]과 다른 단백질 파트너와의 상호작용을 통한 신호 전달에 관련된 추가 도메인을 포함하는 모듈식 조직[1]을 확장합니다[3]. DNA 결합 도메인에 대한 많은 양의 구조 데이터는 구조적 분류를 제안할 수 있는 중요한 구조적 다양성을 강조하고[4], DNA 인식과 관련된 분자 메커니즘을 이해하기 위한 단서를 제공합니다. DNA 결합 도메인은 대부분 게놈에서 특정 DNA를 인식하고 표적화하는 것으로 제한되며, 진화 과정에서 강한 결합 친화도가 선택되었습니다.

특정 DNA 인식의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 얻으려면 DNA-단백질 복합체에 대한 자세한 구조 정보가 필요합니다. X-선 회절은 인터페론-β 인핸서에 결합된 8개의 전사 인자에 의해 형성된 복합체의 결정 구조로 설명된 바와 같이 큰 거대 분자 복합체의 구조를 결정하는 가장 강력한 방법으로 남아 있습니다[5,6]. 그러나 X선 결정학은 큰 분자 어셈블리에 매우 유용하지만 매우 역동적이고 일시적인 복합체를 결정화하는 데 어려움이 있어 일반적인 적용에 제한이 있습니다. 최근 수십 년 동안 액체 상태 핵 자기 공명(NMR)은 횡이완 최적화 분광법[7,8](TROSY)과 같은 중요한 방법론적 발전과 함께 매우 높은 자기장 분광계의 생산으로 감도 및 스펙트럼 분해능 측면에서 발전했습니다. , 더 큰 거대 분자 또는 복합체에 대한 NMR 연구의 길을 열어줍니다. 단백질-DNA 복합체의 경우, 최근 NMR 발전의 대부분을 적용하여 구조 계산을 수행하는 데 사용할 수 있는 구조적 제한을 제공할 수 있습니다. 두 가지 범주의 정보를 수집할 수 있습니다. 일반적으로 상호 작용 표면 매핑에서 파생된 모호한 구속과 분자간 핵 오버하우저 효과(NOE), 잔류 쌍극자 커플링 및 상자성 이완 향상(PRE) 실험에 의해 제공되는 모호하지 않은 구속입니다. 이 모든 데이터는 단백질-DNA 복합체의 고품질 구조를 계산하기 위해 함께 결합될 수 있습니다.

또한 X선 회절과 달리 NMR 분광법은 실온에서 수행되며 거대 분자의 동적 기능에 대한 액세스를 제공합니다. 아미드 질소의 15N 이완 속도를 연구함으로써 스펙트럼 밀도 함수의 분석에서 단백질의 전체 확산 및 국부 거동에 대한 정보를 추출할 수 있습니다.

Lac operator[9-13]에 대해 수행된 중요한 작업은 Lac repressor가 특정 표적과 비특이적 표적에 결합하는 분자 메커니즘을 이해하는 열쇠를 제공했습니다. 단백질-DNA 인식의 경우, 적응과 가소성은 특정 인식 능력을 부여하는 두 가지 주요 특성인 것으로 보입니다. 더욱이, 액체 상태 NMR은 고도로 일시적인 중간체에 접근하는 데 사용될 수 있으며, 이제 NMR에 의한 단백질 확산을 추적하고 DNA를 따라 검색 메커니즘을 표적화하는 것이 가능합니다[14]. 호메오도메인 HoxD9 DNA 인식에 대해 수행된 최근 작업은 HoxD9가 특정 복합체에서 관찰된 것과 동일한 결합 모드 및 방향으로 비특이적 DNA에 결합한다는 것을 분명히 보여주었다[15]. 그러나 비특이적 DNA 결합은 항상 교환 과정과 연관되어 DNA와의 경계면에 위치한 측쇄의 다양한 동적 거동을 유발합니다.

이 논문은 NMR에 의한 단백질-DNA 복합체에 특정한 NMR 구조 연구 분야의 현재 접근 방식을 검토하고 새로운 개발에 중점을 둡니다. 샘플 준비, 인터페이스 매핑 및 구조적 구속조건 수집에서 구조 계산 및 동적 특성화에 이르는 모든 주요 단계에 대해 설명합니다.

2. 샘플 준비

일반적으로 거대분자 복합체를 다룰 때 다른 라벨링 전략이 사용됩니다. 대부분의 경우 한 파트너만 레이블이 지정되고 다른 파트너는 레이블이 지정되지 않은 상태로 유지되므로 관찰 가능한 NMR 신호의 수를 선택할 수 있다는 이점이 있습니다. 두 가지 샘플을 준비할 수 있습니다. 가장 자주 접하게 되는 첫 번째 샘플에서는 단백질이 15N 및/또는 13C로 표지되어 있는 반면 DNA는 표지되지 않은 샘플이고, 선택적인 다른 샘플에서는 DNA가 15N입니다. 및/또는 13 C 표지 및 단백질 표지되지 않음.

이것은 적정 실험 중 공명을 추적하고 특정 양성자 세트의 자화를 선택하거나 필터링하기 위해 필터링된 실험을 사용하는 편리한 수단을 제공합니다. 생화학 및 전용 동위원소 표지 기술의 발전으로 표지된 단백질이 생성되는 반면 표지된 DNA 샘플은 이전에 잘 검토된 바와 같이 화학적 또는 효소적 방법으로 준비할 수 있습니다[16]. 이중 가닥 DNA는 고온에서 두 가닥을 어닐링한 후 천천히 냉각시키면 형성됩니다. DNA 이중체는 예비 이온 교환 컬럼에서 추가로 정제되고 단백질-DNA 복합체를 준비하기 전에 투석에 의해 탈염될 수 있습니다[17]. 두 가닥을 등몰량으로 혼합하려면 두 가닥 중 하나를 상보적 가닥의 용액에 점진적으로 추가하는 것이 가장 쉽고 NMR 스펙트럼은 각 추가 단계 후에 기록되고 통합됩니다.

NMR을 위한 안정한 단백질-DNA 복합체, 즉 복합체의 0.1-1mM 용액을 준비하는 것은 음으로 하전된 핵산 인산기와 대조되는 DNA 결합 도메인(따라서 양으로 하전됨)의 기본 특성 때문에 어려운 작업으로 남아 있습니다. 두 파트너 사이의 강한 정전기 상호 작용은 고농도에서 발생하며 샘플 침전을 일으킬 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위한 다양한 전략이 문헌에 설명되어 있습니다. (i) 염 농도 증가, (ii) 길이를 단축하여 DNA 전하 수 감소, (iii) 염기성 잔기를 대체하기 위해 부위 지정 돌연변이 유발 사용 DNA 인식 인터페이스 외부의 단백질 표면. Dread ringer protein-DNA complex의 경우와 같이, 교환 과정을 담당하는 C-terminal phenylalanine 잔기가 leucine 잔기로 돌연변이되어 NMR 스펙트럼 품질 [18]. 산화를 방지하기 위한 시스테인 잔기의 돌연변이는 시스테인이 알라닌으로 돌연변이된 인테그라제-DNA ​​복합체의 연구에서와 같이 [19] 단백질-DNA 복합체의 안정성을 향상시키는 것으로 나타났습니다. hTHAP1의 THAP 도메인, C 외부에 있는 두 개의 유리 시스테인2CH 아연 배위 모티프는 세린으로 돌연변이되었습니다[20].

시료 준비의 주요 문제는 복합체의 용해도와 안정성으로 남아 있습니다. 분자간 NOE를 식별하려면 시료가 고농축이어야 하고 합리적인 온도(25°C~40°C)에서 안정적이어야 하기 때문입니다. 날카로운 신호를 얻기 위해.

3. 상호작용 표면 매핑

3.1. 화학적 이동 매핑

단백질 결합 인터페이스를 매핑하기 위해 다양한 기술이 제안되었으며 간략하게 설명합니다. 가장 쉬운 NMR 방법은 화학적 이동 매핑으로 알려져 있으며 일반적으로 이핵 단일 양자 간섭 분광법(HSQC) 스펙트럼에서 단백질 백본 15 N 및 HN 화학적 이동의 검출을 기반으로 합니다. TROSY의 개발로 높은 스펙트럼 분해능으로 큰 복합체에 대한 NMR 스펙트럼을 기록할 수 있습니다. 자유 및 결합된 15N 표지된 단백질의 15N HSQC 스펙트럼을 기록함으로써 정규화된 화학적 이동 섭동(CSP)을 다음을 사용하여 계산할 수 있습니다.

화학적 이동은 화학적 환경의 미묘한 섭동에 매우 민감합니다. 단백질의 결합 유도 내부 구조 재배열이 어떤 경우에는 단백질 화학적 이동에 영향을 미칠 수 있지만 일반적으로 중요한 CSP를 담당하는 방향족 염기에 의해 유도되는 고리 전류 또는 DNA 포스페이트의 근접성입니다. 따라서 DNA 결합 시 단백질 아미드 그룹의 CSP를 모니터링하는 NMR 방법은 상호 작용 표면을 신속하게 매핑하는 데 널리 사용됩니다[21-23].

예를 들어, C 사이의 상호 작용의 경우2CH THAP 인간 THAP1의 징크 핑거 도메인 및 이의 특정 DNA 표적, α-나선 영역에 위치한 잔기에 대해 매우 작은 CSP 값이 관찰된 반면, β-시트 또는 N-말단 루프 내의 잔기는 강한 영향을 받았다(그림 1NS), 도메인이 α-나선 대신 DNA를 인식하기 위해 β-시트와 주변 루프를 사용한다는 증거를 제공합니다[20].

그림 1. hTHAP1의 THAP 도메인에서 화학적 이동 섭동(CSP)과 이미노 교차 포화를 결합하여 상호 작용 표면 매핑. (NS) 잔기 수의 함수로서 DNA 결합 시 관찰된 정규화된 CSP의 히스토그램. (NS) 이미노 교차 포화율(NSNS) 잔여 수의 함수로. () 이미노 교차 포화 데이터의 실험 점 및 적합 곡선의 예. 실험 포인트와 피팅된 곡선은 α-나선형 잔기(DNA에서 멀어짐)에 대해 파란색으로, β-시트 잔기(DNA에 가까움)에 대해 검은색으로 표시됩니다. (NS) hTHAP1의 THAP 도메인의 솔루션 구조에 대한 상호 작용 표면의 매핑.

DNA 결합 표면이 연속적인 단백질 인터페이스 영역에 위치해야 한다는 점은 주목할 만합니다. 두 개의 Myb 유사 DNA 결합 동기를 포함하는 전사 인자 Myb1의 경우, CSP 실험은 유리 단백질의 여러 불연속면에 위치한 큰 화학적 이동 변화를 갖는 잔기를 강조했습니다. DNA 결합 구조에서 단백질의 구조는 DNA 결합 시 구조적 변화를 나타내어 CSP 데이터와 일치하여 복합체에서 연속적인 상호작용 표면을 구성하는 도메인의 구조적 재배열을 초래합니다[24].

보완적인 접근 방식으로 잘 해결된 DNA 이미노 양성자에서 15N HSQC 스펙트럼을 기록하여 DNA 염기쌍의 국부 변형과 DNA 굽힘 및 더 큰 형태 전환을 평가할 수 있습니다. 후자의 경우 계면의 일부가 아닌 영역으로 확장되는 상당한 화학적 이동을 관찰하는 것이 일반적입니다. 핵산 이미노 양성자를 검출하기 위한 특정 펄스 프로그램이 최근에 개발되었습니다[25]. 그러나 DNA에서 CSP의 해석은 DNA에서 발견되는 구조적 동적 거동과 심각한 선 확장으로 이어지는 이미노 양성자 교환으로 인해 단백질과 관련하여 더 어렵습니다. 이미노 양성자의 CSP는 단백질과 상호 작용할 때 큰 형태 변화를 겪는 DNA의 영역을 식별하는 도구로 사용되었습니다. 이 접근법의 최근 흥미로운 적용은 쌀 텔로미어 결합 단백질인 RTBP1과 표적 DNA의 상호작용을 분석하는 데 사용되었습니다[26].

특정 DNA 결합 부위가 종종 다음과 같은 분자생물학적 방법을 사용하여 특성화된다는 점은 주목할 만합니다. NS조직적인 이자형의 진화 간드에 의해 ponential 농축(SELEX) 및 돌연변이유발이 DNA 결합 분석과 결합됩니다[27].

3.2. 이미노 양성자 교차 포화

교차 포화 실험은 큰 단백질-단백질 복합체의 계면을 확인하기 위해 처음 도입되었으며[28] 단백질-핵산 복합체의 결합 표면을 매핑하는 데 성공적으로 적용되었습니다[29,30]. 이 방법은 분자 전체의 자화 감소로 이어지는 한 분자 파트너의 양성자의 선택적 포화를 기반으로 하며, 이는 대부분 스핀 확산에 의해 제어됩니다. 포화는 다른 파트너에게 전달되어 NMR 강도가 감소합니다. DNA-단백질 복합체의 경우, DNA 이미노 양성자 공명(티민 H3 및 구아닌 H1)은 이미노 주파수 범위(δ 1 H, 12–15 ppm)에 중심을 둔 단열 밴드 선택 반전 펄스를 포함하는 루프를 사용하여 선택적으로 포화됩니다. ) [31]. DNA 포화 동안 이미노 양성자 이완 과정은 인접 스핀의 열역학적 평형을 교란시켜 포화를 단백질로 전달합니다. 기존의 15N HSQC 펄스 시퀀스 이전에 포화 기간을 도입함으로써 이미노 교차 포화 실험은 여러 포화 시간(0.1~2초 범위)을 사용하여 기록됩니다. 그런 다음 HSQC 교차 피크의 정규화된 강도가 포화 시간의 함수로 표시됩니다(그림 1).

이 방법은 최근에 화학적 이동 매핑 실험에 추가하여 THAP1의 THAP 도메인의 특정 DNA 결합 인터페이스를 정의하는 데 사용되었습니다[20]. 실험 데이터를 단일 지수 방정식으로 피팅함으로써(그림 1), 특성 감소 시간(NSNS)는 각각의 비프롤린 잔류물에 대해 추출되었으며 NSNS 매개변수(1/NSNS)는 단백질 서열의 함수로 플롯팅되었습니다(그림 1NS). 스핀 확산은 쌍극자 상호작용에 의해 제어되기 때문에(작은 포화 시간 동안), NSNS 매개변수는 DNA 공간적 근접성을 평가합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 교차 포화 데이터는 CSP 데이터와 정성적으로 잘 일치하여 DNA 결합 인터페이스의 신뢰할 수 있는 식별을 제공합니다(그림 1NS).

3.3. 용매 접근성

아미드 수소 교환 실험은 일반적으로 계면 잔류물의 용매 접근성 변화를 식별하고 DNA-단백질 계면의 추가 증거를 제공하는 데 사용됩니다. 유리 단백질과 DNA 결합 단백질에 대한 아미드 양성자 교환 비율의 정량적 분석은 결합 계면 및 DNA 인식 시 단백질 접힘에 대한 정보를 제공하기 위해 적용되었습니다[12].

대안적인 접근법은 수용성 이완제를 사용하여 용매에 노출된 원자의 이완 과정을 증가시키는 것입니다. 실제로, DNA 결합은 결합 계면에 위치한 원자를 보호하여 자유 형태와 결합 형태 사이에 다른 이완 행동을 유도합니다[32].

인터페이스 매핑을 허용하는 이러한 모든 기술은 인식 모드에 관한 중요한 정보를 제공하고 모델링 접근 방식의 문을 엽니다. 때때로 구조가 이미 이용 가능한 상동 단백질 계열을 다룰 때 돌연변이 유발 데이터와 결합된 분자 모델링은 DNA 인식 메커니즘을 이해하기에 충분할 수 있습니다. 그러나 상동 단백질의 구조를 이용할 수 없는 경우에는 계면 매핑 기술이 DNA 인식 과정을 이해하기에 충분하지 않으며 DNA 인식 과정에 대한 정확한 설명을 얻기 위해 추가적인 구조적 제한을 수집해야 합니다.

4. 분자간 구속

4.1. 단거리 분자간 거리 제한: 핵 오버하우저 효과

단백질-DNA 계면에 가까운 잔기의 공간적 근접성은 측정 가능한 NOE를 생성하기에 충분히 큰 분자간 쌍극자-쌍극자 상호작용을 유발할 수 있습니다. 분자간 NOE와 함께 생성된 교차 이완은 공간적 근접성에 대한 직접적인 증거를 제공합니다. 분명히, 복합체에서 두 파트너의 공명은 분자간 NOE를 식별하기 전에 할당되어야 합니다. However, strong resonance overlapping and line broadening associated with the size of the complex and/or chemical exchange make it very difficult to unambiguously assign NOEs. Recent progress in different NMR processes, such as labelling strategies, pulse sequence developments and the availability of high magnetic fields, has largely contributed to solve this problem.

In most studies of DNA–protein complexes, the protein is uniformly 13 C/ 15 N labelled while the DNA remains unlabelled. Consequently, proton frequencies of the protein in the complex are generally assigned using a combination of classical triple-resonance experiments (HNCA, HNCACB) and TOCSY and nuclear Overhauser spectroscopy (NOESY) experiments (three-dimensional 15 N HSQC-NOESY, three-dimensional 15 N HSQC-TOCSY, three-dimensional HCCH-TOCSY, three-dimensional 13 C HSQC-NOESY). The development of isotope filtering and editing schemes has largely contributed to reducing the tedious task of DNA assignment. In particular, it is possible to select the 1 H atoms that are or are not one-bond scalar linked to a specific heteroatom, 15 N or 13 C. General considerations and experimental details on isotope-filtered NMR methods have been well reviewed by Breeze [33].

For instance, in the NMR studies of the complex formed by calmodulin and a peptide, peptide 1 H frequencies and intermolecular NOEs were assigned using a combination of two-dimensional NMR experiments [34,35]. This strategy has also been used for protein–DNA complexes ([18,36–38] [39, p. 423]). Firstly, two-dimensional [F1, NS2] 13 C-filtered NOESY experiments were recorded for the protein–DNA complex to observe NOEs between the 1 H atoms that are one-bond scalar coupled to 12 C spins, i.e. protons of the unlabelled DNA while the protein is uniformly 13 C- and 15 N-labelled. The two-dimensional [F1, NS2] 13 C-filtered NOESY was first proposed using a filter based on the chemical shift-optimized adiabatic 13 C inversion pulse [40] and was then optimized using 1 JHC coupling constant properties [15], providing a sensitivity gain of up to 40 per cent in the most favourable case. Once DNA proton frequencies are assigned, intermolecular NOEs can be detected using two-dimensional [F2] 13 C-filtered NOESY experiments that provide correlations owing to cross relaxation between all protons (bound to DNA 12 C atoms and to protein 13 C atoms). The resulting spectrum corresponds to two-dimensional [F1, NS2] 13 C-filtered NOESY plus intermolecular NOEs.

If resonance overlap persists, filtering and editing schemes in three-dimensional experiments may be combined to increase resolution. Using three-dimensional [F1] 13 C filtered–[F3] 13 C edited–NOESY-HSQC experiments [40], it has been possible to detect intermolecular NOE positions on a three-dimensional experiment. Briefly, all the protons are excited but for 13 C-linked protons, then the mixing time permits DNA protons to perform cross relaxation with surrounding protons finally, magnetization is transferred to 13 C atoms and back to 1 H before detection.

Obtaining intermolecular distance restraints remains difficult and time-consuming, but they permit the interface of protein–DNA complexes to be defined with high accuracy and precision to enable structure calculations. Gathering a significant number of intermolecular NOEs is certainly the most precise and efficient way to define the interface with high accuracy.

4.2. Angular intermolecular restraints: residual dipolar couplings

Structural determination of DNA using the NOE approach is more difficult than it is for proteins and has, for a long time, been severely hampered by a lack of precision and accuracy in the structures. The low proton density together with the elongated shape of the DNA molecule often lead to a small number of NOE restraints. The majority of observable 1 H– 1 H contacts are between directly adjoining base pairs in the DNA sequence, leading to a lack of long-range structural restraints. Therefore, although the local structure is relatively well defined, the global NOE-derived structure of DNA suffers from a lack of long-range distances [41]. The introduction of additional orientational restraints using a small degree of alignment [42] turned out to be useful for DNA, improving both local and global structures [17,43]. The first example of a really extensive use of residual dipolar couplings (RDCs) for a protein–DNA structure determination was performed by Murphy and co-workers [17], who measured and included, in the structure calculation protocol, 274 protein RDCs and 46 DNA RDCs on the HMG-box domain of the human male sex-determining factor SRY, hSRYHMG, bound to a DNA 14-mer.

In solution, the dipolar coupling between two nuclei is averaged to zero because of the isotropic Brownian motion of molecules, unless the movement is restricted to a preferred direction relative to the magnetic field.

DNA molecules are naturally sensitive to an external magnetic field and are aligned partially with respect to the high magnetic field. In order to determine the orientation of the GATA-1 protein on its 16-base pair oligonucleotide, 1 DHN/N and 1 DHα/Cα RDCs were collected on the protein backbone inside the protein–DNA complex at several external magnetic fields without adding liquid crystals [44]. The magnetic susceptibility tensor for the complex is dominated by contributions of the bases in the DNA duplex, yielding an axially symmetric susceptibility tensor with the main axis approximately parallel to the double helix. Using this information, a method for refining the solution structure of this protein–DNA complex using RDC was proposed. This approach, however, had to rely on very precise measurements of dipolar couplings of a fraction of a hertz, owing to a molecular order parameter of these complexes of about 10 −4 or less.

A stronger partial alignment of molecules can be achieved by using dilute aqueous liquid crystalline media (phages Pf1, bicelles, PEG/alcohol, etc.). Thus, weak alignment (here weak alignment means molecular order parameter NS of the order of 10 −3 ) of the molecule will lead to the loss of its purely isotropic motion, resulting in partial dipolar coupling between spins while retaining conditions of high-resolution solution NMR [42]. Pulse programmes have been specifically developed to measure coupling constants, allowing scalar couplings to be assessed under isotropic conditions and apparent scalar couplings (i.e. scalar coupling plus residual dipolar coupling) under anisotropic conditions. Several dipolar couplings can be extracted on the protein backbone bonds, such as 1 DHN/N, 1 DHα/Cα, 1 DCα/C′ and 1 DN/C′. Several methods have been proposed to determine the alignment tensor [45], allowing the transformation of RDC values into orientational restraints of the covalent bonds with respect to the alignment tensor (figure 2).

Figure 2. The residual dipolar coupling formalism, illustration and equations.

We have seen the importance of introducing RDCs in DNA structure determination to remedy the limited number of classical NOE restraints and to increase the accuracy of global DNA structures. The utility of employing RDCs was also established in the accurate determination of subtle structural features such as the DNA helix curvature, as in oligonucleotides containing ANNSN segments [46]. Over the last decade, several pulse programmes have been developed for the measurement of residual dipolar couplings on DNA molecules [47–49]. However, in the simplest manner, RDCs can be extracted using two-dimensional IPAP 15 N/HN HSQC centred on the amide proton regions (for 1 DHN/N RDCs). Once the alignment tensor has been determined, RDCs can be transformed into orientation restraints of covalent bonds in the molecular frame using the equations given in figure 2. Care should be taken to remove from the analysis the mobile loops (which do not follow such simple equations because of dipolar coupling averaging from internal motions), which can be clearly identified from 15 N relaxation analysis.

In the context of protein–DNA complexes with both labelled partners, RDCs can be measured for both molecules within the same sample. Alignment tensors are extracted for each molecule and, if they are identical, RDCs could be used differently. In fact, RDC restraints are transformed into purely intermolecular projection angle restraints [50]. This approach was recently developed and has been successfully applied to define protein–protein interactions [51] and the relative orientation of protein subdomains [52], and may be used for protein–DNA interactions. By collecting RDCs on each partner, it is possible to derive intermolecular projection angle restraints useful for orientating each partner with respect to the other. It represents a new class of intermolecular restraints that could be included in structure calculations of protein–DNA complexes. In particular, combination of these restraints with shape restraints derived from small-angle X-ray scattering (SAXS) represents a very powerful approach [53].

4.3. Long-range intermolecular distance restraints: paramagnetic relaxation enhancement

Magnetic dipolar interaction between a spin and an unpaired electron of a paramagnetic centre can result in chemical shift changes or in an increase in the relaxation rate of the nuclear magnetization, a phenomenon called PRE. Considering the distance NS between the nucleus of interest and the paramagnetic centre, the magnitude of the PRE is proportional to NS −6 . However, in contrast to the NOE effect that is limited to short distances (typically less than 5 Å, slightly more with fully deuterated proteins), the PRE effect can be observed up to 35 Å, depending on the magnetic moment of the paramagnetic centre. Therefore, paramagnetic NMR represents a valuable source of long-range distances that can complement NOE restraints for a complex in the slow-exchange regime. When the molecule does not contain an intrinsic paramagnetic centre, extrinsic spin labels need to be judiciously incorporated to the molecule of interest, usually by designing nitroxide spin labels and cysteine point mutations. In the case of protein–DNA complexes, a paramagnetic agent is commonly conjugated to the DNA. For instance, the use of DNA-containing EDTA-derivatized deoxythymidine chelated to Mn 2+ in the SRY/DNA complex allowed the intermolecular PRE effects to be measured and the polarity of the SRY binding on the DNA to be defined [54]. More recently, the incorporation of deoxy-4-thiouracil into each end of the oligonucleotide reacting with 3-(2-iodoacetamido)-proxyl enabled label both 5′ DNA extremities to be spin labelled [55], and a protocol was described to incorporate nitroxide spin labels into specific 2′-sites within nucleic acids [56].

The PRE effect induced by the spin labelling leads to line broadening, the magnitude of which depends on the distance between the nucleus and the spin label. By combining different labelling sites, PRE data are extracted for different positions of the paramagnetic centre, allowing long-range distance restraint to be determined [57]. This strategy was used to compute solution structures of the SRY–DNA complex [58] (figure 3) and the Mrf2–DNA complex [55].

Figure 3. Long-range distance restraints from PRE, adapted from Iwahara . [58]. Impact of intermolecular PRE data on coordinate accuracy of the SRY–DNA complex when only a single intermolecular NOE restraint located at the centre of the protein–DNA interface is employed. Best-fit superposition of 30 simulated annealing structures (SRY, red DNA, blue) calculated (NS) without and (NS) with 438 intermolecular 1 H-PRE restraints.

5. Structural restraints for dna structure calculation

The determination of DNA structural restraints requires prior assignment of DNA resonances following standard procedure [59]. Briefly, sequential assignment of non-labile protons in B-DNA is accomplished by following short 1 H– 1 H distance connectivities between the bases (purine H8/pyrimidine H6) and the H2′/H2″ and H1′ sugar protons in NOESY spectra recorded in 2 H2O. The intraresidue cross peaks may be independently confirmed by DQF-COSY. In B-DNA, connectivities are also observed between the base (purine H8/pyrimidine H6) and C H5 or T CH3 protons in the direction of 5′ to 3′. At the same time, the A H2 protons are identified by their weak inter- and intrastrand connectivities with H1′ sugar protons. Assignment of the H3′, H4′, H5′ and H5″ sugar protons is also based on the NOESY spectra following standard procedures. Assignment of the labile protons requires that a NOESY spectrum is recorded in H2O buffer and at low temperature to ensure slowing down of proton exchange with the solvent. The main assignment pathway relies on detectable 1 H– 1 H NOEs between the hydrogen-bonded imino protons of adjacent stacked base pairs [59].

The DNA double helix is a highly flexible structure that can adopt different classes of conformations, B, A and Z, and DNA local structural perturbations are often observed upon protein binding as well as larger conformational transitions. One should be particularly cautious in the description of the experimental restraints used in the structure calculation protocol as accurate DNA structure calculation needs to incorporate observables based on a combination of dedicated experiments. The resulting structure may range from a simple DNA classification (here, we are not talking about mere modelling in which the force field could play a major role) up to a precise description of the structure, including sugar puckering, base pair stacking and proper base pair parameters. A number of dedicated NMR experiments have been described, many of which are based on uniform 15 N– 13 C labelling of the DNA. The sugar conformation can be estimated from the analysis of proton intraresidual NOEs within sugar rings in a NOESY spectrum recorded with short mixing time and, in particular, from the ratio of the cross-peak volumes for the intraresidue H8/6–H2′ 그리고 H8/6–H3′ interactions, which is higher than 1 in the presence of a predominant C2′ 엔도 conformation [60]. Similarly, the orientation of the base relative to the deoxyribose ring (syn 또는 안티 conformation) can be determined from the ratio of H8/6–H2′ H로8/6–H1′, which should be higher than 1 in the B-DNA form. Information on both the sugar pucker and base torsion angles is needed to estimate the DNA conformation [59]. These measurements have been done in the NMR study of the THAP zinc finger in complex with its DNA target, and have confirmed that the DNA target adopts a B-DNA form in the complex (figure 4). Alternatively, the type and degree of DNA sugar puckering in protein–DNA complexes can be assessed by recording a NOESY sequence preceded by a constant-time scalar coupling period [61]. Notably, other methods have been developed to study sugar puckering of high molecular weight oligonucleotides based on the measurement of deoxyribose 3 제이 scalar couplings [62] or cross-correlated relaxation rates involving 13 C chemical shift anisotropy (CSA) and 13 C– 1 H dipolar interactions [63], making use of uniform 13 C labelling of the DNA. Alternatively, structural information and DNA conformational changes induced by protein binding can be provided by means of 31 P NMR [64,65]. It is noteworthy that 31 P NMR can be used to identify BNS/BII DNA conformational transitions, which are likely to play a role in sequence-specific recognition [66,67].

Figure 4. Computational strategies for calculation of protein–DNA complex structures using a data-driven docking protocol. (NS) Modelling of the complex formed by the THAP domain of hTHAP1 and its DNA target, including solely interface mapping restraints as ambiguous interface restraints. On the graph, the intermolecular energy is plotted as a function of RMSD from the lowest energy structure in order to illustrate the structure calculation convergence. On the right-hand side, a superposition of the 15 best models is shown. (NS) Modelling of the complex formed by the THAP domain of hTHAP1 and its DNA target, including interface mapping restraints as ambiguous interface restraints, 39 intermolecular NOEs and 49 1 DHN-N RDCs for refinement. In the graph, the intermolecular energy is plotted as a function of RMSD from the lowest energy structure in order to illustrate the calculation convergence. On the right-hand side, a superposition of the 15 best structures is shown (PDB ID 2ko0). () Modelling of the complex formed by the THAP domain of hTHAP1 and its DNA target, including interface mapping restraints as ambiguous interface restraints, 39 intermolecular NOEs and 49 1 DHN-N RDCs and 49 1 DC′-Cα RDCs for refinement. In the graph, intermolecular energy is plotted as a function of RMSD from the lowest energy structure in order to illustrate the calculation convergence. On the right-hand side, a superposition of the 15 best structures is shown and, in both graphs, a comparison between experimentally measured RDCs and backcalculated RDCs is shown for 1 DHN-N RDCs and 1 DC′-Cα RDCs. For each ensemble, pair-wise RMSD on backbone heavy atoms is shown.

Furthermore, without major conformational change, the DNA double helix has to accommodate the protein-binding surface by modifying base pair step parameters (i.e. twist, tilt, roll, shift, slide and rise [68,69]), which may result in DNA bending [70]. Assessing the global bending magnitude in DNA–protein complexes is of particular interest, but classical NMR methods are inefficient in capturing DNA bending. However, the use of RDCs proved their ability to give a reliable view of bending in intrinsically curved DNA [46] or changes in DNA bending induced by protein binding.

To experimentally estimate protein interaction with the DNA and DNA bending, electrophoretic mobility experiments [71,72] have been used based on the observation that bent DNA migrates more slowly in a gel matrix than straight DNA [73]. An alternative method called the circular permutation DNA-bending assay, which is based on differences in the electrophoretic mobility of protein–DNA complexes with DNA-binding sites located at different positions, may be used to provide information on protein-induced DNA bending [74,75].

In addition, several software programs have been developed to model DNA bending such as the 3DNA program, which allows analysis of DNA structural parameters and enables it to be rebuilt with customized DNA models [76]. Several Web servers have been created recently and provide interesting tools to analyse and rebuild DNA models [77,78].

6. Structure calculation strategies

In most cases, several types of structural restraints (NOEs, RDCs, CSAs, PREs, low-resolution envelopes obtained from SAXS, small-angle neutron scattering (SANS) or cryoEM and so on) are combined to calculate protein–DNA structures, thus increasing precision and accuracy. Solution structures are commonly computed by simulated annealing protocols using CNS [79] or XPlor-NIH [19,36,38,80–82]. These protocols permit a complete exploration of the conformational space. Xplor-NIH includes a number of possibilities such as using a database potential of mean force describing base–base positional interactions, which has been shown to improve the structure quality, as viewed from an independent check with experimental observables (RDCs, NOEs) [83].

In some cases, the knowledge of both interaction surfaces is sufficient to orient the protein onto its DNA target. For this simpler purpose, several programs based on molecular docking have been developed. They use biophysical and/or biochemical interaction information, encoded into ambiguous interaction restraints (AIRs) [84], to drive the docking process. Provided that solution structures of the free partners are known and that no major conformational change occurs upon binding, the data-driven docking program HADDOCK can be applied to a large variety of biomolecular complexes [85,86] from protein–protein to protein–nucleic acid complexes [87]. In the context of full structure determination, and of including a wide range of experimental restraints, HADDOCK may be used as a python interface allowing a very simple and easy way to launch CNS for structure calculation of macromolecular complexes and analysis. The protocol includes three steps: a rigid body docking of the two partners based on interaction surface definition, a semi-flexible simulated annealing stage followed by a water-refinement step. The full HADDOCK program has been recently implemented into a HADDOCK Web server [88]. A specific protocol has been recently described for DNA–protein complex modelling using this approach, which highlights the importance of DNA flexibility to explore the conformational space [87,89].

The HADDOCK approach was used to gain insights into the DNA-binding mode by the THAP domain of hTHAP1. In the first step, AIRs derived from NMR chemical shift mapping and imino cross-saturation experiments were used to guide the docking, providing an ensemble of the 15 lowest energy structures with medium resolution (figure 4NS). The structure calculation convergence is illustrated by plotting intermolecular energy as a function of the backbone RMSD from the lowest energy structure. In this case, several ensembles of solutions were generated.

This docking approach can take into account ambiguous as well as unambiguous intramolecular and intermolecular restraints such as intermolecular NOEs, RDCs as intermolecular projection angle restraints and long-range distances derived from PRE experiments [20,55]. It is noteworthy that the inclusion of a few unambiguous intermolecular data in the docking process can greatly increase the structure precision. In the case of the complex formed by the THAP domain and its DNA target, 39 intermolecular NOEs were included in the docking approach and the water-refinement step was done using 1 DHN-N RDC restraints. Following this protocol, the structure calculation was highly convergent and an ensemble of 15 structures under high resolution is shown in figure 4NS. By including additional 1 DC′-Cα RDC restraints, an even better calculation convergence was obtained (figure 4).

7. Refined structures using shape restraints

Cryo-electron microscopy can provide low-resolution shape restraints, which may be used in conjunction with NMR data [90,91].

During the last decade, small-angle scattering of biomolecules in solution has gained popularity with the availability of powerful beamlines and the generation of new data analysis programmes [92–94]. There has been a growing interest in including low-resolution techniques such as SANS and SAXS to tackle challenging problems in structural biology [95–99]. X-ray scattering is generated during the interaction of light with electrons while neutron scattering is due to the interaction with the atom nuclei. The scattered intensity is a function of the macromolecule shape and of the contrast (the scattering density difference) between the macromolecule and the solvent [100]. In order to collect data, the sample ideally needs to be pure, highly homogeneous and monodisperse, without attractive or repulsive interaction among the scattering particles. The resulting one-dimensional diffusion curves contain information about the radius of gyration and the molecular mass, and the three-dimensional structural model of the shape of the particle can be extracted [101]. This information can be incorporated into structure calculation protocols in various ways: (i) for scoring the NMR-derived structures [102], (ii) directly in combination with NMR data (particularly RDCs) in order to perform a grid search using a rigid body protocol [103], or (iii) for direct refinement during NMR structure calculations [104–107]. An example of an application to DNA may be found in Schwieters & Clore [108], who have investigated by a combination of NMR and SAXS the structural and dynamic behaviour of the Dickerson DNA dodecamer. The resulting ensembles provided a detailed description of the conformational space sampled by the dodecamer in solution and of the fluctuations in helicoidal parameters, sugar puckers and BNS–BII backbone transitions.

So far, very few examples have explored the potential of SANS for DNA–protein complexes. SANS is extremely sensitive to contrast variation and, by changing the solvent composition (typically by modifying the H2O/D2O ratio), it is possible to observe specifically one component of the macromolecular complex [101,109]. An early historical success of SANS in the area of protein–DNA complexes was the mapping of the relative topology of DNA and histone in the nucleosome [110]. A recent study by Falb and co-workers [111] has focused on the structure of the U4 RNA in solution. After NMR solution structure calculation, a SANS low-resolution model was constructed in order to validate the free U4 RNA structure. The authors concluded that the SANS data fully supported the NMR analysis and independently corroborate that the sharply bent K-turn motif (observed in the crystal structure of protein-bound U4 RNA) is not formed in solution in the absence of protein and divalent cations.

8. Dynamic study of protein–dna interaction using nuclear magnetic resonance

8.1. Backbone dynamic analysis in a protein–DNA complex

Protein and DNA motions are known to play important roles in the recognition mechanism and specificity [112,113]. In a number of cases, unfolded or partially folded protein domains may provide scaffolds for DNA interaction, and intrinsically disordered protein domains or tails may facilitate DNA search efficiency as reviewed in Wright & Dyson [114] and Vuzman & Levy [115]. An extreme case of dynamic transition upon DNA binding has been described for the Brinker repressor, for which the protein domain Brk is unfolded and highly flexible throughout the entire backbone in the absence of DNA and folds into a helix–turn–helix motif upon DNA binding [116].

The dynamic behaviour of a protein in solution can be monitored by 15 N NMR relaxation studies of backbone amides. With the Lipari–Szabo formalism, the 15 N relaxation rates of individual amide 15 N nuclei (R1, R2, heteronuclear NOE) can be fitted to a generalized order parameter S 2 , which reports amplitudes of ps–ns internal motions, to an internal correlation time (τ이자형), to an exchange term (NS), caused by μs–ms exchange processes, and finally to a global isotropic correlation time (τ) [113]. In most cases, DNA-binding sites are flexible and undergo rapid μs–ms conformational fluctuations characterized by large values of NS for residues located at the target interface. This flexibility often decreases upon target binding. The structural study of the 라크 repressor system has provided keys to understanding the dynamic features of protein–DNA recognition [12,117]. The NMR solution structures of the 라크 DNA binding domain (DBD) in the free state or bound to non-specific or specific DNA targets have been solved and dynamic features of the protein in every state have been characterized. In the non-specific DNA-bound state, the Lac repressor displays a large number of sub-millisecond motions with large NS values that are observed at the DNA–protein interface, indicating a very transient and labile interface, whereas these motions are quenched upon binding of the protein to its cognate operator. These results have been confirmed using H/D exchange [12]. To conclude, the determination of the conformational exchange term for 15 N backbone atoms at the protein–DNA interface gives access to the interaction strength and stability of the DNA–protein complex.

8.2. Search mechanism of the DNA target site

Recognition and binding of specific sites on DNA by proteins are central for many cellular functions such as transcription, replication and recombination, as recently reviewed [118–120]. The proteins have to find their DNA target sites in the bulk of non-specific sequences present in the cell. Yet, it has been widely demonstrated that rate constants for association of proteins with their specific DNA targets can surpass the diffusion limit by almost two orders of magnitude. This observation can be explained by a kinetically optimized pathway involving a combination of three-dimensional diffusion and one-dimensional sliding diffusion along the DNA.

The one-dimensional diffusion rates of LacI repressor proteins along elongated DNA have been measured using single-molecule imaging techniques [121,122]. This implies the existence of transient intermediates involving non-specific binding modes. PRE experiments allow the characterization of these transient intermediates and have been used to show diffusion of the DNA-binding domain along the non-specific DNA aiming to find its specific target [14]. Using different paramagnetic labelling positions on an oligonucleotide containing the HOXD9 homeodomain target site [15], PRE values could be extracted in various ionic strength conditions. At low ionic strength, PRE data are consistent with the previously described solution structure of the specific protein–DNA complex. However, at high ionic strength, several significant differences appear in the PRE data which indicate the existence of other modes of binding. This work provides for the first time NMR evidence of the one-dimensional diffusion along the DNA helix towards the recognition site. Interestingly, the PRE experiments give access to the dynamic of the DNA–protein interaction. Intermolecular jumping from one double-stranded DNA to another has also been observed using this method [14]. Theoretical studies and other evidence highlight the role of protein and DNA conformational flexibility on the rates of one-dimensional diffusion and hopping [123,124].

9. Conclusions and perspectives

Solution-state NMR developments have generated new methods to collect structural restraints on protein–DNA complexes. Mapping the interaction surfaces, using chemical shift mapping or cross-saturation experiments, gives answers with the lowest resolution and helps with modelling the complex. If detailed residue-specific knowledge is required, intermolecular restraints are needed. Various kinds of data can be extracted with different levels of difficulty. Intermolecular NOEs appear to be the most precise for interface definition but are time-consuming, requiring residue and atom-specific NOE assignments. Alternatively, intermolecular restraints can be represented by angular restraints with RDCs as intervector projection angles or by long-range distances with PRE. These approaches can be combined in order to increase structural accuracy. In some cases, combination of RDC and SAXS low-resolution shape restraints has been described as a powerful approach. NMR is limited by the size of the macromolecular edifice but offers useful possibilities in terms of dynamic characterization. During the last decade, dynamic descriptions of protein–DNA interactions have played an increasing role in understanding recognition specificity and kinetics.


독자 상호작용

코멘트

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in depth information you present. It’s great to come across a
blog every once in a while that isn’t the same out of date rehashed material.
Wonderful read! I’ve saved your site and I’m including your RSS
feeds to my Google account.

Fascinating information thank you. What do you think of the electric hydrogen makers on the market? There seems to be an abundance of them. I am not sure how they work but get the impression that they split the water molecule into oxygen and hydrogen.

If we were supposed to consume more hydrogen would nature not have added more to the air or a different ration in our water supply?

Hydrogen is most often produced by electrolysis (the splitting of the water molecule) although there are variations on the theme. A good article can be found here: http://energy.gov/eere/fuelcells/hydrogen-production-electrolysis. There is significant evidence to indicate that the early Earth atmosphere contained MUCH more hydrogen that it does today (see page 70 in Dancing with Water)

In our continued work with Deuterium-depleted water, we have found that the degree to which water can be depleted often depends on the minerals in the water (influencing hydrogen/deuterium bond strength) We had the water tested by a certified lab in Eastern Europe where they have more experience with this kind of testing and found that the process we originally posted removed very little deuterium, so since the process was so involved, we felt it was not worth people’s time.

What is your opinion of the John Eliis E5, which makes deuterium depleted water? It is expensive, but if it works it is worth it. Unless you can recommend another effective machine that makes DDW.

The last time we looked into it, there was no information on the degree to which the Ellis distiller may reduce deuterium. We use the word “may” because there is no evidence of testing or analytical work to support the claims. Any reduction in deuterium would depend on the nature of the source water and the kind (and amount) of minerals present. If the distiller does reduce deuterium, we are of the opinion that in some instances it may be so small as to be insignificant. Perhaps that is why there is an obvious lack of information on the subject. You don’t have to reduce the deuterium by much to say that it is “depleted” but whether or not it is significant enough to produce any results is another story.
The level of expertise required to produce deuterium-depleted drinking water of reputable quality (and with low levels of deuterium) is quite high and has only been achieved by a handful of companies so far. Unfortunately none of those companies are in the US.

Shalom, I have tested the output of Ellis water and the ppm of Deuterium increased by 1ppm.
That machine is NOT a DDW producing machine as it is not designed to take it’s “distilled” output and run it through the machine again repeatedly.
I owned one to carry out this research at an ISO 17925 accredited lab by Health Canada.
I asked Mr. Ellis to remove his ad for false advertising and he fails to do so, therefore my comment here.
DDW is produced by vapour distillation towers that are designed to capture to the “light isotopes” which evaporate “UP”.
They are up to 20 feet tall and about 15cm in diameter.
The Ellis machine is sold on mainly third party claims. I have several taped calls with the man.
Mr. Ellis could not substantiate or even name the methods or means to measure the hydrogen bond angle he repeats in his messaging.

We tried a method similar to this, (based on the fact that heavy water freezes before deuterium-depleted water) But we were not able to reduce the deuterium content–even by repeating the process several times.


EXAMPLE IV

This example describes the capture of polypeptides and modification of captured phosphopeptides.

Polypeptides from a sample are captured on beads essentially as described in Example I. The captured polypeptides are modified essentially as described in Zhou et al., 네이처바이오텍. 19:375–378 (2001), which is incorporated herein by reference.

Briefly, the captured polypeptides are modified by the following steps. (1) Amino protection: peptide amino groups are optionally protected using t-butyl-dicarbonate (tBoc) chemistry to eliminate the potential for intra- and intermolecular condensation in subsequent reactions. (2) Condensation reaction: carbodiimide catalyzes condensation reactions between the peptides and excess amine to form amide and phosphoramidate bonds at the carboxylate and phosphate bonds of the peptides, respectively. (3) Phosphate regeneration: free phosphate groups are regenerated by brief acid hydrolysis of the phosphoramidate bonds. (4) Condensation and reduction: a carbodiimide-catalyzed condensation reaction attaches a cystamine to the regenerated phosphate group(s). Reduction of the internal disulfide of cystamine next generates a free sulfhydryl group for every phosphate of the captured phosphopeptides. (5) Release of modified polypeptides: the captured polypeptides are released from the solid support by cleavage of the chemical cleavage group, for example, using light as described in Example I. (6) Solid-phase capture: the released polypeptides, including the modified phosphopeptides containing a free sulfhydryl, are attached to a second solid phase by reacting the free sulfhydryl groups in the peptides with iodoacetyl groups immobilized on glass beads. (7) Phosphopeptide recovery: following stringent washing of the resin, phosphopeptides are recovered by cleavage of phosphoramidate bonds using trifluoracetic acid (TFA) at a concentration that also removes the tBoc protection group, thus regenerating peptides with free amino and phosphate groups. The carboxylate groups remain blocked from step (2).

The chemical reactions are carried out as described below in more detail. The solid phase containing captured polypeptides is incubated in 50% (vol/vol) of 0.1 M phosphate buffer, pH 11, and acetonitrile. 0.1 M tBoc is added for 4 h at room temperature. Acetonitrile is then removed. The solid phase containing captured polypeptides is incubated in 1M ethanolamine, 25 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), and 0.5 M of N,N′-dimethylaminopropyl ethyl carbodiimide HCL (EDC) and incubated for 2 h at room temperature. 10% TFA is added and incubated 30 min at room temperature. The solid phase is washed to remove excess reagents and to desalt, and 1 M imidazole, pH 6.0, is added. 0.5 M EDC is added for 3 hours at room temperature. The solid phase is washed and then incubated with 1 M cystamine, pH 8.0, for 2 h at 50° C. The solid phase is washed with water and then reduced with 10 mM dithiothreitol (DTT) to generate free sulfhydryl groups. The solid phase is washed to remove DTT, and then the captured molecules are released by cleavage of the cleavable functional group.

The released polypeptides, including the phosphopeptides modified with sulfhydryl groups, are incubated for at least 2 h with a second type of solid phase beads, which have iodoacetyl groups and are titrated to pH 8.0 with 1 M Tris, pH 8.0, 50 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Beads with immobilizede iodoacetyl groups are prepared by a 2 h reaction between 3 equivalents of iodoacetic anhydride and 1 equivalent of amino beads (G4643 Sigma St. Louis Mo.) with 3.3 equivalents of diisopropylethylamine in dimethylformide. Since a tyrosine adduct with carbodiimide is a possible side reaction, the captured phosphopeptides modified with sulfhydryl groups are incubated in 1 M hydroxylamine, pH 10, for 2 h at room temperature to restore any modified tyrosines. The beads are then washed sequentially with 2 M NaCl, methanol and water to remove nonspecifically bound molecules. The beads are incubated with 100% TFA for 30 min to recover phosphopeptides and concurrently remove tBoc protection from tBoc modified groups. The recovered phosphopeptides are then analyzed, for example, by mass spectrometry.

The molecules captured on the first solid support are generally released just prior to re-capture on the second solid phase, which selectively captures the modified phosphopeptides, allowing efficient washing and removal of chemicals used to modify the captured polypeptides. However, the peptides can be released at an earlier stage, even after the initial capture, if binding to the first solid phase is intended only to transfer a label or tag to the captured polypeptides. Alternatively, the modification of phosphopeptides can be carried out essentially as described in Zhou et al., and then the recovered phosphopeptides captured and labeled essentially as described in Example I.

This example demonstrates the selective modification and isolation of phosphopeptides.

Throughout this application various publications have been referenced. The disclosures of these publications in their entireties are hereby incorporated by reference in this application in order to more fully describe the state of the art to which this invention pertains.

Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, those skilled in the art will readily appreciate that the specific experiments detailed are only illustrative of the invention. It should be understood that various modifications can be made without departing from the spirit of the invention.



코멘트:

  1. Erymanthus

    오히려 재미있는 대답

  2. Yehuda

    나는 당신이 옳지 않다고 생각합니다. 나는 확신한다. 나는 그것을 증명할 수 있습니다.

  3. Micah

    또한 12 월 10 일을 기다릴 수 없습니다. 레알 마드리드가 Zenith에 반대 할 때….

  4. Kajilabar

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  5. Russel

    우연히 포럼에 일어 났 으며이 주제를 보았습니다. 조언을 구할 수 있습니다. 함께 우리는 정답에 도달 할 수 있습니다.



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