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8: 전사 - 생물학

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DNA는 정보 저장을 위한 훌륭한 매체이지만, DNA를 매우 안정적으로 만들고 본질적으로 자가 수정하는 특성(이중 가닥)으로 인해 해당 유전 정보를 사용하여 세포 구성 요소를 만들기도 어렵습니다. 분자의 정보 부분(질소 염기)은 사다리 내부에 잠겨 있기 때문에 그것을 읽는 것은 두 가닥을 함께 유지하고 있는 모든 수소 결합을 깨뜨리는 에너지 비용이 많이 드는 작업을 필요로 합니다. 세포가 필요로 하는 각 단백질의 모든 단일 사본에 대해 그렇게 하려면 많은 에너지가 필요할 뿐만 아니라 많은 시간이 소요됩니다. 대신에, DNA에서 정보를 한 번(또는 몇 번) 가져온 다음 그 단일 정보에서 단백질의 많은 복사본을 만드는 메커니즘이 있어야 합니다. 그 메커니즘은 전사입니다.

Thumbnail: mRNA 합성 및 처리의 단순화된 다이어그램. (CC BY 3.0 - 이식되지 않음, Kelvinsong).


8: 전사 - 생물학

이 섹션이 끝나면 다음을 수행할 수 있습니다.

  • 진핵생물 전사의 단계 나열
  • 전사에서 RNA 중합효소의 역할 토론
  • 세 가지 RNA 중합효소 비교 및 ​​대조
  • 전사 인자의 중요성 설명

원핵생물과 진핵생물은 몇 가지 주요 차이점을 제외하고 근본적으로 동일한 전사 과정을 수행합니다. 원핵 생물과 진핵 생물의 가장 중요한 차이점은 진핵 생물의 막 결합 핵과 세포 소기관입니다. 유전자가 핵에 결합된 상태에서 진핵 세포는 mRNA를 세포질로 운반할 수 있어야 하고 mRNA가 번역되기 전에 분해되지 않도록 보호해야 합니다. 진핵생물은 또한 각각 다른 유전자 하위 집합을 전사하는 세 가지 다른 중합효소를 사용합니다. 진핵생물의 mRNA는 일반적으로 단일 유전자이므로 단일 단백질을 지정합니다.


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유전자 발현은 전사 및 번역의 조절과 같은 여러 기능에 의해 제어됩니다.

진핵생물에서 특정 전사 인자가 세포질에서 핵으로 이동할 때 전사 또는 표적 유전자가 자극되거나 억제될 수 있습니다. 표적 유전자만 전사된다는 것은 특정 단백질이 만들어지는 것을 의미한다. 각 유형의 신체 세포는 서로 다른 표적 세포를 가지고 있어 서로 다른 특성을 제공합니다. 즉, 신경 세포는 적혈구와 다릅니다. 전사 인자는 전사 속도를 변경할 수 있으며 그 과정은 다음과 같습니다.

  • 전사 인자는 세포질에서 핵으로 확산에 의해 이동합니다.
  • 핵에 있을 때 프로모터 서열(표적 유전자의 시작인 서열)에 결합할 수 있습니다.
  • 전사 인자는 프로모터 서열에 결합했는지 여부에 따라 전사 속도를 증가시키거나 감소시킵니다.

일부 전사 인자는 전사율을 증가시키는 활성제라고 합니다. 이것은 RNA 중합효소가 프로모터 서열에 결합하여 전사를 활성화하는 것을 돕는 전사 인자에 의해 수행됩니다. 다른 것들은 전사율을 감소시키는 리프레서(repressor)라고 불립니다. 이것은 RNA 중합효소가 결합하는 것을 방지하는 프로모터 서열에 결합하는 전사 인자에 의해 수행됩니다. 이렇게 하면 전사가 중지됩니다.

에스트로겐은 표적 유전자의 전사를 시작할 수 있습니다. 주의: 때로는 전사 인자가 억제자가 될 수 있습니다. AQA 시험을 위해 이것을 알 필요는 없습니다. 전사 인자는 억제제가 프로모터 서열에 결합하는 것을 막는 억제제에 결합될 수 있습니다. 에스트로겐은 에스트로겐-에스트로겐 수용체 복합체를 만드는 전사 인자에 결합하고 억제제가 결합되는 부위(DNA 결합 부위라고 함)를 변경합니다. 이것은 억제제가 분리되어 전사 인자가 프로모터 서열에 부착되도록 하는 것을 의미합니다. 주의: 억제제의 이름을 알 필요는 없습니다. 또한 에스트로겐이 결합하는 동안 전사 인자의 DNA 결합 부위는 변경된 상태로 유지됩니다.

진핵생물과 일부 원핵생물에서 표적 유전자에서 생성된 mRNA의 번역은 RNAi로 알려진 RNA 간섭에 의해 억제될 수 있습니다. miRNA로 알려진 마이크로 RNA와 같은 짧은 RNA 분자와 siRNA로 알려진 작은 간섭 RNA는 단백질과 함께 RISC로 알려진 RNA 유도 침묵 복합체를 형성합니다. 주의: 개정 가이드나 교과서에서 이중 가닥으로 알려진 작은 RNA 분자는 혼란스럽기 때문에 단일 가닥인 miRNA와 siRNA로 프로세스를 시작하는 것이 좋습니다. RNA는 RNA 가수분해효소라는 효소인 단백질과 복합체를 형성합니다. miRNA는 RNA 가수분해효소와 복합체를 형성하는 것이 아니라 다른 단백질을 형성합니다. 이 RNA 분자는 각각 하나 이상의 단백질로 RISC를 만들 수 있으며 관련된 단백질은 AQA에 대해 알려질 필요가 없습니다. 복합체는 각각 표적 mRNA 서열에 부착되어 다양한 방식으로 번역을 방지합니다. 이것은 각각의 작은 RNA 분자에 대해 수행되는 방법입니다.

  • 식물의 siRNA/miRNA:
  • siRNA의 염기는 상보적 염기쌍에 의해 mRNA의 염기에 부착됩니다.
  • RNA 가수분해효소는 mRNA 가닥을 단편으로 가수분해하여 전체 폴리펩타이드 사슬이 만들어지지 않기 때문에 번역이 일어나지 않도록 합니다.

주의: 단편이 처리체에서 분해된다는 것을 알 필요는 없습니다. 이것을 배우고 싶다면 아무런 해가 없습니다.

  • 포유류의 miRNA:
  • miRNA의 염기는 상보적 염기쌍을 통해 mRNA의 염기에 부착됩니다.
  • 리보솜은 mRNA 가닥에 부착되어 번역이 일어나는 것을 막습니다.

주의: 여기서도 mRNA가 분해되거나 처리체에 저장된다는 사실을 알 필요는 없습니다.

후성유전학은 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 기능의 유전적 변화를 수반합니다. 이러한 변화는 다음과 같은 방법으로 전사를 억제하는 환경 변화(오염에 더 많이 노출됨)로 인해 발생합니다.

  • DNA의 메틸화 증가:메틸 그룹(후성 유전적 표시로 알려짐)은 포스포디에스테르 결합에 의해 구아닌에 부착된 뉴클레오티드의 일부여야 하는 시토신에 부착됩니다. 주의: 당신은 지금 혼란스러울 수 있지만 한 가닥의 DNA에 대한 아래 다이어그램을 보고 메틸 그룹이 결합하는 시토신 뉴클레오티드를 주목하십시오. 가닥의 맨 오른쪽에 있는 뉴클레오티드와 왼쪽에서 세 번째에 있는 뉴클레오티드는 구아닌을 염기로 하는 뉴클레오티드 옆에 있지 않기 때문에 메틸기가 없습니다. 메틸 그룹의 연결은 잘못된 것이므로 다른 가닥의 구아닌에 상보적인 시토신에 연결함으로써 혼동되어서는 안 됩니다. 또한 메틸기 –CH3 –은 기본 시퀀스가 ​​아니라 구조를 변경합니다. 구조가 변하면서 효소가 DNA에 달라붙어 유전자 발현을 멈추게 하는 것이 더 어려워졌다. 종양 억제 유전자가 전사되지 않으면 암을 유발할 수 있습니다.

  • 관련 히스톤 감소: 아세틸기 – COCH3–은 히스톤 단백질에 부착되어 염색질(히스톤 단백질 주위에 감긴 DNA 혼합물)이 덜 응축되어 쉽게 유전자 발현이 일어나도록 하는 또 다른 후성유전적 표지입니다. 문제는 히스톤 디아세틸라제가 히스톤 단백질과 아세틸기 사이의 결합을 끊을 때 발생합니다. DNA는 고도로 응축되어 효소가 유전자 발현을 수행하기 어렵게 만듭니다. 주의: 히스톤 데아세틸라아제는 HDAC로 축약될 수 있지만 전체 이름을 그대로 사용하는 것이 가장 좋습니다.

DNA에 대한 후성적 변화는 다행히 가역적이므로 후성적 발생의 영향을 막기 위한 약물의 좋은 표적이 됩니다. 이러한 약물은 DNA 메틸화를 멈추거나 히스톤 탈아세틸화효소를 억제하여 아세틸기가 DNA에 부착된 상태로 유지되도록 할 수 있습니다.


전사 인자는 어떻게 작동합니까?

활성제

억제인자


추상적 인

산화된 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린(Ox-PAPC)은 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 또는 지질다당류와 같은 전형적인 염증 매개체에 의해 유도되는 것과는 다른 염증성 사이토카인 및 접착 분자의 스펙트럼을 상향 조절합니다. 흥미롭게도 Ox-PAPC는 또한 케모카인 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-1) 및 인터루킨(IL)-8을 포함하는 TNF-α 또는 지질다당류에 의해 유도된 것과 유사한 단백질 세트의 발현을 유도합니다. Ox-PAPC에 의해 유도된 유전자 발현의 분자 메커니즘을 설명하고 Ox-PAPC와 TNF-α와 같은 다른 염증 매개체가 일반적인 신호 경로를 사용하는지 여부를 결정하기 위해 우리는 Ox-PAPC와 TNF-α에 의한 IL-8의 전사 조절을 조사했습니다. 인간 대동맥 내피 세포의 α. Ox-PAPC와 TNF-α는 모두 용량 의존적 방식으로 IL-8 mRNA의 발현을 유도했지만, 두 리간드 사이의 IL-8 mRNA 축적 동역학은 달랐다. Ox-PAPC로 유도된 IL-8 mRNA는 빠르면 30분에 나타났고, 4시간에서 8시간 사이에 최고조에 달했으며, 24시간까지 실질적으로 감소했습니다. 대조적으로, TNF-α-유도된 IL-8 mRNA 합성은 30분에 상승하였고, 2시간에 최고조에 이르렀고, 6시간에 기초/검출 불가능한 수준에 도달하였다. Actinomycin D 실험은 Ox-PAPC와 TNF-α가 모두 전사 수준에서 IL-8의 발현을 조절한다고 제안했습니다. 더욱이, 두 리간드에 대한 IL-8 mRNA의 반감기는 유사했으며(<30분), 이는 mRNA 안정성이 2개의 리간드 사이의 IL-8 축적 동역학의 차이에 책임이 없음을 시사한다. 1.48kb의 IL-8 프로모터를 포함하는 리포터 구성을 사용한 일시적 형질감염 연구는 IL-8 프로모터의 -133 및 -1481bp 사이에서 Ox-PAPC-특이적 반응 영역을 확인했습니다. 대조적으로, IL-8 프로모터의 TNF-α 활성화는 IL-8 프로모터의 -70 및 -133 bp 사이에 존재하는 핵 인자-κB 및 활성화 단백질-1 반응 요소를 통해 거의 전적으로 매개되었다. 따라서, Ox-PAPC와 TNF-α가 둘 다 IL-8 합성을 유도했지만, 우리의 데이터는 2개의 리간드가 IL-8 전사 조절에서 서로 다른 메커니즘을 활용함을 시사합니다.

우리는 이전에 산화된 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn최소 변형 LDL(MM-LDL)의 주요 생리 활성 성분인 글리세로-3-포스포릴콜린(Ox-PAPC)은 동맥경화 병변 및 기타 만성 염증 부위에 존재합니다. 1,2 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 같은 다른 염증성 사이토카인과 유사하게, Ox-PAPC는 내피 세포를 활성화하여 부분적으로 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-1)과 같은 케모카인의 유도를 통해 단핵구-내피 상호 작용을 향상시킵니다. ) 및 인터루킨(IL)-8. 3,4 흥미롭게도, TNF-α가 아닌 Ox-PAPC(또는 MM-LDL)는 β1-인테그린의 활성화를 매개하여 단핵구-내피 결합을 향상시켜 피브로넥틴의 연결 세그먼트-1 도메인을 인대 표면에 침착시킵니다. 내피 세포. 5 반면에, TNF-α는 Ox-PAPC에 의해 영향을 받지 않는 E-selectin 및 혈관 세포 부착 분자-1의 유도를 통해 내피-단핵구 상호작용을 향상시킨다. 6 따라서, Ox-PAPC와 TNF-α는 유사하고 뚜렷한 유전자 발현 유도 패턴을 모두 활용하여 내피-단핵구 상호작용을 시작합니다. TNF-α에 의한 유전자 유도의 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지만 Ox-PAPC가 (1) 내피 세포에서 기능적 변화를 시작하고 (2) 내피-단핵구 상호 작용을 향상시키는 표적 수용체, 신호 경로 및 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 모두 다 아는.

CXC 케모카인 계열의 구성원인 IL-8은 처음에 호중구 화학주성 및 활성화 인자로 특성화되었습니다. 7,8 IL-8은 이후 많은 생리학적 및 병태생리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었습니다. 9,10 보다 최근에, IL-8은 혈관신생 동안 단핵구 활성화 및 내피 주화성에 연루되어 있습니다. 11 IL-8 mRNA는 인간 죽상동맥경화증의 죽상동맥경화 병변과 인간 죽종에 있는 대식세포 거품 세포에서 상승된 것으로 밝혀졌습니다. 12 Ox-LDL 처리 및 콜레스테롤 로딩은 대식세포에서 IL-8 mRNA를 유도합니다. 13 Gerszten et al14은 IL-8이 활성화된 내피 세포에 대한 단핵구의 견고한 접착에 중요하다는 것을 입증했습니다. CXC 수용체-2(인간 IL-8 수용체의 이종상동체)가 결핍된 마우스에서 LDL 수용체 결핍 마우스로의 골수 이식은 수용자의 대동맥에서 동맥경화증 발달의 감소를 초래했습니다. 15 이 데이터는 IL-8이 죽상동맥경화증의 발병에 기여함을 시사합니다.

TNF-α 및 지질다당류와 같은 다수의 리간드는 내피 세포를 비롯한 다수의 세포 유형에서 IL-8 합성을 유도합니다. 16-18 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 lipopolysaccharide에 의한 IL-8 유도는 전사 수준에서 조절됩니다. 18,19 IL-8 프로모터는 핵 인자-κB(NF-κB), CCAAT 인핸서 결합 단백질-β(C/EBPβ) 및 활성화 단백질-1(AP-1)에 대한 공통 결합 부위를 포함하며, 모두 다음 위치에 있습니다. 인간 IL-8 프로모터의 -70 ~ -133 bp 사이의 근위 영역. 20 대식세포와 상피세포에서, TNF-α와 다른 염증성 사이토카인은 근위 프로모터의 -70 ~ -133 bp 내의 복합 인핸소솜에 이들 3개의 전사 인자의 협력 결합에 의해 IL-8 프로모터를 활성화합니다. 21-24 Ox-PAPC 및 MM-LDL은 인간 대동맥 내피 세포(HAEC) 상층액에서 IL-8 단백질의 축적을 유도하지만 Ox-PAPC 유도 IL-8 합성의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. Ox-PAPC가 IL-8 유전자 발현을 유도하는 분자 메커니즘을 결정하기 위해 우리는 HAEC에서 Ox-PAPC와 TNF-α에 의한 IL-8의 조절을 조사했습니다.

행동 양식

시약

조직 배양 배지 및 시약은 Irvine Scientific Inc.에서 얻었습니다. 태아 소 혈청(FBS)은 Hyclone에서 얻었습니다. PAPC는 Sigma에서 구입했으며 Ox-PAPC는 이전에 설명한 대로 준비했습니다. 2 산화는 질량 분석에 의해 모니터링되었고 PAPC의 >90%가 산화되었을 때 종료되었다. 이러한 조건 하에서, 리소포스파티딜콜린의 최소 형성이 관찰되었습니다. 따라서, 본 연구에 사용된 Ox-PAPC의 질량 분석 프로파일은 이전에 표시된 것과 유사했습니다. 2 인지질 용액의 내독소 농도는 <0.1pg/mL였습니다. TNF-α는 R&D에서 구입했습니다. AP-1(5'-CTAGTGATGAGTCAGCCGGATC-3'), NF-κB(5'-GATCCAGGGGACTTTCCCTAGC-3') 및 Oct-1(5'-TGTCGAATGCAAATCACTAGA-3') 올리고뉴클레오티드는 전기영동 이동성 변화 분석을 위해 Santa에서 구입했습니다. 크루즈 바이오테크놀로지. 방사성 동위원소는 Amersham Pharmacia Biotech에서 구입했습니다. HeLa 세포 배양용 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)/고포도당 배지 및 HAEC 배양용 M199 배지는 Gibco/BRL에서 구입했습니다.

세포 배양

HAEC를 이전에 설명한 대로 이식된 기증자 심장의 대동맥 고리에서 분리하고 20%(vol/vol) FBS, 페니실린-스트렙토마이신(각각 Gibco/BRL 100U/mL 및 100μg/mL)이 보충된 M199 배지에서 배양했습니다. , 피루브산나트륨(1mmol/L), 헤파린(90㎍/mL, Sigma) 및 내피 세포 성장 인자(20㎍/mL, Fisher Scientific). HeLa 세포(American Type Culture Collection, Manassas, Va)는 10%(vol/vol) FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM/고글루코스 배지에서 배양되었습니다.

플라스미드 및 부위 지정 돌연변이 유발

더 긴 인간 IL-8 프로모터(-1481 ~ +44 bp), 더 짧은 IL-8 프로모터(-133 ~ +44 bp) 및 개별 NF-κB, C/EBPβ의 다중 사본을 갖는 루시퍼라제 리포터 플라스미드의 구성, 또는 AP-1 요소는 이전에 설명되었습니다. 25 -1481에서 +44 bp(p[-1481/+44]-Luc)까지의 더 긴 IL-8 프로모터를 포함하는 루시퍼라제 리포터 구성의 맥락에서 NF-κB 및 AP-1 요소의 돌연변이는 a로 생성되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 부위 지정 돌연변이 유발 키트(QuickChange, Stratagene) 및 제조업체에서 제공한 프로토콜. 3개 요소의 돌연변이 프라이머는 이전에 설명된 대로 26,27 설계되었으며 Invitrogen에서 맞춤화되었습니다. NF-κB 요소가 TGAATTTCCT에서 TGGAATTT로 돌연변이되었습니다.아아 TGACTCA에서 TGACT로의 AP-1 요소GT.

일시적 형질감염

HeLa 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM/고글루코스 배지에서 6-웰 배양 접시(웰당 2 x 10 5 세포)에 플레이팅하였다. 모든 형질감염은 제조업체의 프로토콜에 따라 Superfect Reagent(웰당 8μL, Qiagen)를 사용하여 DNA 웰당 총 1μg으로 수행되었습니다. 형질감염 4시간 후, 세포를 DMEM/고포도당 배지/1% FBS에서 Ox-PAPC 또는 TNF-α로 자극하였다. 12시간 후, 전체 세포 용해물을 수집하고 루시퍼라제 분석 시스템 키트(Promega)를 사용하여 루시퍼라제 활성에 대해 분석했습니다. 루시페라제 활성은 동시형질감염된 pSV-β-갈락토시다제(Promega)의 활성으로 정규화되었습니다.

효소 면역 분석법

HAEC 상층액의 IL-8 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 IL-8 ELISA 키트(Quantikine, R&D)를 사용하여 측정되었습니다.

노던 블로팅

총 세포 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Trizol 시약(Gibco/BRL)을 사용하여 HAEC 및 HeLa 세포에서 분리되었습니다. 인간 IL-8 cDNA 프로브(1.2kb 에코인간 IL-8 cDNA의 RI 단편)은 무작위 프라이밍 방법에 의해 [α-32P]dCTP로 방사성 표지되었다. 정규화를 위해 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase probe가 포함되었으며, phosphoimager(Kodak)를 이용한 모든 실험에서 정량적 분석을 수행하였다.

핵 단백질의 추출 및 전기영동 이동성 이동 분석

HeLa 세포를 1% FBS 함유 DMEM/고포도당 배지와 함께 1일 동안 사전 인큐베이션했습니다. 세포를 Ox-PAPC, TNF-α 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(Sigma)로 30분 동안 처리하였다. 그런 다음 세포를 수확하고 50μL의 세포 용해 완충액(10mmol/L HEPES pH 7.9, 10mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl)에 재현탁했습니다.2, 0.5mmol/L 디티오트레이톨[DTT] 및 0.1% NP-40)을 첨가하고 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션했습니다. 세포 용해물을 간단히 혼합하고 4°C에서 10분 동안 10,000rpm으로 원심분리했습니다. 다음으로, 펠릿을 15μL의 핵 용해 완충액(20mmol/L HEPES pH 7.9, 1.5mmol/L MgCl2, 5mmol/L DTT, 0.5mmol/L EDTA, 5mmol/L PMSF, 25% 글리세롤 및 0.42mol/L NaCl) 및 15분 동안 얼음에서 인큐베이션. 핵 용해물을 간단히 혼합하고 4°C에서 15분 동안 14,000rpm으로 원심분리했습니다. 상층액을 수집하고 향후 전기영동 이동성 변화 분석 연구를 위해 -80°C에 보관했습니다. 단백질 농도는 Bradford 방법에 의해 결정되었습니다.

전기 영동 이동성 이동 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다. 28 간단히 말해서, 올리고뉴클레오티드는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 [γ-32P]ATP로 말단 표지되었고 Microspin 컬럼(Bio-Rad)에서 정제되었습니다. 각 10μL 반응에 대해 8μg의 핵 추출물 단백질 및 1μL의 정제된 표지된 올리고뉴클레오티드를 1μL의 dI-dC(1μg/μL) 및 1μL의 10X 결합 완충액(10mmol/L Tris- HCl pH 7.5, 50mmol/L NaCl, 0.5mmol/L EDTA, 1mmol/L MgCl2, 0.5mmol/L DTT, 및 4% 글리세롤) 실온에서 20분 동안. 샘플을 100V에서 1시간 동안 0.5X Tris-borate-EDTA 완충액에서 4% 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동했습니다. 겔을 건조시키고 건조된 겔의 방사능 강도에 따라 2시간에서 밤새 32P 포스포이미저에 노출시켰다.

결과

Ox-PAPC 유도 IL-8 mRNA 및 HAEC에서 단백질 합성

우리는 이전에 Ox-PAPC가 HAEC 상층액에서 IL-8 단백질의 축적을 유도한다는 것을 보여주었습니다. 3 Ox-PAPC로 유도된 IL-8 단백질 축적이 새로운 IL-8 mRNA 합성의 결과인지 확인하기 위해 다양한 농도의 Ox-PAPC와 PAPC로 처리한 HAEC에 대해 Northern blotting 분석을 수행했습니다. Ox-PAPC는 용량 의존적 방식으로 IL-8 mRNA 합성을 유도했습니다(그림 1A). 미처리 및 PAPC 처리(최대 100μg/mL) HAEC는 IL-8 메시지가 있는 경우 매우 최소화했습니다(그림 1A). Ox-PAPC는 또한 용량 의존적 방식으로 HAEC 상층액에서 IL-8 단백질 축적을 유도했습니다(그림 1B).

그림 1. Ox-PAPC는 IL-8 메시지와 단백질을 유도합니다. HAEC는 다양한 농도의 Ox-PAPC(0~100μg/mL) 및 PAPC(0~100μg/mL)로 처리되었습니다. 4시간 후, 총 RNA 및 상청액을 수집하여 Ox-PAPC-유도 IL-8 mRNA(A) 및 단백질(B)의 수준을 결정하였다. 결과는 4개의 개별 실험을 나타냅니다. 오차 막대는 1개의 실험에서 동일한 조건의 3중으로 통계적으로 결정되었습니다.

IL-8 mRNA 축적의 역학은 Ox-PAPC 처리 및 TNF-α 처리 HAEC에서 다릅니다.

다음으로 HAEC에서 TNF-α 유도 및 Ox-PAPC 유도 IL-8 메시지 축적의 시간 경과를 조사했습니다. Ox-PAPC로 유도된 IL-8 전사체는 빠르면 30분(3배 증가)에 나타났고, 4시간에서 8시간 사이에 최고조에 달했으며(60배 증가), 24시간까지 크게 감소했습니다(그림 2A 및 2B). 대조적으로, TNF-α-유도된 IL-8 mRNA 수준은 2시간까지 최대였지만(300배 유도) 6시간까지 기준선으로 복귀했습니다(그림 2A 및 2B). Cycloheximide의 존재 하에서 IL-8 mRNA는 여전히 65배 증가했으며, 이는 새로운 단백질 합성이 Ox-PAPC에 의한 이러한 연장된 유도에서 역할을 하지 않는다는 것을 시사합니다. IL-8 단백질은 Ox-PAPC 처리된 HAEC 상층액에서 2시간 만에 검출되었으며 수준은 24시간에도 여전히 증가하고 있었습니다(그림 2C). TNF-α로 유도된 IL-8 단백질은 빠르면 1시간에 축적되어 8시간에서 12시간 사이에 최고조에 달했습니다. 12시간 후 IL-8 수준에는 유의한 차이가 없었습니다(그림 2D). 이들 데이터는 IL-8 단백질 축적이 2개의 작용제에 의한 IL-8 mRNA 유도와 유사함을 시사한다.

그림 2. Ox-PAPC 및 TNF-α는 IL-8 mRNA와 단백질을 유도하지만 역학은 다릅니다. HAEC는 Ox-PAPC(50μg/mL) 또는 TNF-α(2ng/mL)로 처리되었습니다. 총 RNA 및 배지를 다른 시간 간격(0~24시간)으로 수집했습니다. A, 노던 블롯은 Ox-PAPC-(상단 패널) 또는 TNF-α-(하단 패널) 처리된 HAEC에서 추출된 총 RNA 5㎍으로 수행되었습니다. B, Ox-PAPC 및 TNF-α에 의해 유도된 IL-8 mRNA의 노던 블롯의 인광 이미지 분석. 모든 IL-8 메시지 수준은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 수준으로 정규화되었습니다. C 및 D에서, ELISA는 상이한 시간 간격(0 내지 24시간)에서 Ox-PAPC(C) 및 TNF-α(D)에 의해 유도된 IL-8 단백질 합성 수준을 결정하기 위해 HAEC 상청액에 대해 수행되었다. 결과는 3개의 개별 실험을 나타냅니다.

Ox-PAPC 전사 증가에 의한 IL-8 mRNA 축적 증가

IL-8 mRNA 축적이 전사 수준에서 발생하는지 여부를 결정하기 위해 HAEC를 30분 동안 악티노마이신 D(400nmol/L)로 전처리한 다음 Ox-PAPC(50μg/mL) 또는 TNF-α(20 ng/mL) 2시간 동안. 노던 블롯 분석(그림 3A)은 악티노마이신 D가 Ox-PAPC와 TNF-α 모두에 의해 IL-8 전사를 완전히 억제한다는 것을 보여주었습니다(각각 87% 및 91% 감소, 그림 3B). IL-8의 전사 후 조절의 차이가 Ox-PAPC 및 TNF-α에 의한 IL-8 유도 역학의 차이를 설명하는지 여부를 결정하기 위해 HAEC를 악티노마이신 전에 2시간 동안 Ox-PAPC 또는 TNF-α로 처리했습니다. D(400 nmol/L) 처리 및 IL-8 mRNA를 다양한 시점에서 정량화하였다. IL-8 mRNA 전사체는 TNF-α 및 Ox-PAPC 모두에 대해 1시간까지 완전히 분해되었으며(도 3B), 이는 둘 모두에 대한 IL-8 mRNA의 반감기가 유사함을 나타냅니다(<30분). These data suggest that both Ox-PAPC-induced and TNF-α-induced IL-8 expression is regulated at the level of transcription in HAECs (Figure 3C).

그림 3. Ox-PAPC and TNF-α regulate IL-8 message at the level of transcription. HAECs were treated with or without actinomycin D (400 nmol/L) for 30 minutes and then with Ox-PAPC (40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL). Two hours later, total RNA were extracted and IL-8 message induced by TNF-α and Ox-PAPC was determined by Northern blot (A) and quantified by phosphoimage analysis (B). All IL-8 message levels were normalized to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase levels. The stability of induced IL-8 mRNA by both ligands was determined by measuring the message half-life. HAECs were first treated with either Ox-PAPC or TNF-α. Two hours later, actinomycin D (400 nmol/L) was added to inhibit any further synthesis of new message. Total RNA was extracted at different time intervals (0, 1, 2, and 4 hours) after addition of actinomycin D. Northern blots and phosphoimager analysis were performed to quantify the levels of IL-8 mRNA (expressed as the percentage of IL-8 message amount at 0 hours) induced by Ox-PAPC (solid line) or TNF-α (dashed line). Results are representative of 2 separate experiments.

Ox-PAPC and TNF-α Activated Reporter Constructs Containing a 1.48-kb IL-8 Promoter

Both Ox-PAPC and TNF-α induced IL-8 protein synthesis in HeLa cells (data not shown) therefore, IL-8 promoter regulation study was performed in this easily transfected cell type. To determine whether Ox-PAPC can induce transcriptional activation of the human IL-8 promoter, HeLa cells were transiently transfected with a luciferase reporter plasmid containing −1481 to +44 bp of the human IL-8 promoter and were then treated with various concentrations of Ox-PAPC. Ox-PAPC induced luciferase activity in a dose-dependent fashion, suggesting that Ox-PAPC response elements are present in the first 1.48 kb of the IL-8 promoter (Figure 4).

그림 4. Ox-PAPC and TNF-α activate luciferase reporter constructs containing the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected for 2 hours with 0.8 μg per well of p(−1481/+44)-Luc, together with 0.2 μg per well of β-galactosidase expression plasmid, as described in Methods. Transfected cells were treated with various concentrations of Ox-PAPC (from 25 to 40 μg/mL) or TNF-α (2 ng/mL) for 12 hours. Cell lysates were collected and assayed for luciferase and β-galactosidase activities. Luciferase activities were expressed in arbitrary units after being normalized against β-galactosidase activities. Results are representative of 3 separate experiments.

Studies on NF-κB, AP-1, and Oct-1 Activation

To determine whether NF-κB, C/EBPβ, or AP-1 response elements participate in Ox-PAPC-mediated transcriptional activation, reporter constructs containing multiple NF-κB (p[NF-κB]3-Luc), C/EBPβ (p[C/EBPβ]3-Luc), or AP-1 (p[AP-1]3-Luc) elements were transiently transfected into HeLa cells. TNF-α strongly activated p[NF-κB]3-Luc by 7-fold, whereas Ox-PAPC had no effect (Figure 5A). On the other hand, Ox-PAPC mildly activated the p[AP-1]3-Luc construct (Figure 5B), whereas TNF-α had no effect. Plasmid p[C/EBPβ]3-Luc was not activated by either TNF-α or Ox-PAPC (data not shown). Furthermore, nuclear extracts from cells treated with TNF-α but not Ox-PAPC showed increased binding activity to a [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB consensus sequence from the human IL-8 promoter (Figure 5C). TNF-α did not affect AP-1 binding activity in HeLa nuclear extracts, whereas a minimal increase was seen with Ox-PAPC (Figure 5C). Phorbol 12-myristate 13-acetate, an AP-1 activator, served as a positive control. Previous studies had shown that the induction of IL-8 may be the result of downregulation of Oct-1, a constitutive repressor of the C/EBPβ response element. 29 Because Ox-PAPC did not induce NF-κB and only minimally induced AP-1 activity, we hypothesized that Oct-1 binding activity might be decreased by Ox-PAPC and result in induction of IL-8. However, nuclear extracts from HeLa cells treated with Ox-PAPC or TNF-α showed no decrease in Oct-1 binding activity on the electrophoretic mobility shift assay (Figure 5C).

그림 5. Activation of NF-κB, AP-1, and Oct-1. HeLa cells were transiently transfected with 0.8 μg of (A) p[NF-κB]3-Luc or (B) p[AP-1]3-Luc as per the aforementioned protocol in the legend to Figure 4. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (solid black bar) or 2 ng/mL TNF-α (dotted bar) for 12 hours. Results were shown in luciferase activity units that were normalized against β-galactosidase activities. p[NF-κB]3-Luc is a luciferase reporter construct with 3 copies of the NF-κB responsive element and p[AP-1]3-Luc, with 3 copies of the AP-1 responsive element. C, HeLa cell nuclear extracts were harvested after 30 minutes of stimulation with Ox-PAPC (40 μg/mL), TNF-α (2 ng/mL), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 20 ng/mL), or control media (C). [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB, AP-1, and Oct-1 oligonucleotides were individually incubated with 5 μg of nuclear extracts at room temperature for 20 minutes. Reaction products were run on nondenatured gels and exposed to phosphoimage analysis. These image values were used to calculate the fold induction (above lanes) compared with untreated cells, and all values obtained were well within the linear range of phosphoimage measurement. Results are representative of 2 separate experiments.

An Ox-PAPC-Responsive Element Is Located in the Upstream Region of the Human IL-8 Promoter

To determine the sequences in the IL-8 promoter important for Ox-PAPC-induced transcription, reporter constructs containing different lengths of the IL-8 promoter (−1481 to +44 and −133 to +44) were transiently transfected into HeLa cells. The IL-8 promoter construct containing p[−1481/+44]-Luc was activated by Ox-PAPC however, the construct containing p[-133/+44]-Luc was only mildly activated by Ox-PAPC (Figure 6B). In contrast, TNF-α activated both the longer p[−1481/+44]-Luc and the shorter p[−133/+44]-Luc constructs (>17-fold, Figure 6A). Thus, deletion of the upstream region of the IL-8 promoter from −1481 to −133 bp resulted in a 75% reduction in promoter activation by Ox-PAPC (Figures 6A and 6B), suggesting that an Ox-PAPC-response region resides between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. Individual mutations in the conserved response elements (NF-κB and AP-1) generated in the context of the longer construct p[−1481/+44]-Luc] resulted in significant inhibition of TNF-α-induced IL-8 promoter activation but only slightly decreased Ox-PAPC-induced activation (Figures 6A and 6B).

그림 6. Ox-PAPC mediates IL-8 promoter activation through an Ox-PAPC-specific response region between −133 and −1481 bp of the IL-8 promoter. HeLa cells were transiently transfected with 2 luciferase reporter plasmids, p[−1481/+44]-Luc and p[−133/+44]-Luc, or with 3 separate p[−1481/+44]-Luc constructs containing site-directed mutations of the NF-κB or AP-1 element, as described in Methods. Transfected cells were treated with either 30 μg/mL Ox-PAPC (A) or 1 ng/mL TNF-α (B). Results are shown as the fold induction above control. P-1481 indicates p[−1481/+44]-Luc P-133, p[−133/+44]-Luc. Results are representative of 3 separate experiments.

논의

This study is the first to examine the mechanism by which Ox-PAPC, an oxidatively fragmented lipid component of MM-LDL, regulates transcription. In this study, Ox-PAPC was compared with the more thoroughly characterized regulation of IL-8 by TNF-α. Our results demonstrate that the major effect of Ox-PAPC on the IL-8 promoter is involved with an upstream sequence between −1481 and −133 bp. There are several responsive elements present in this region of the human IL-8 promoter that have been known for years, eg, the glucocorticoid responsive element and the hepatocyte nutrition factor-1 binding site, which are located at positions −330 to −325 bp and −381 to −376 bp, respectively, upstream from the TATA box. 20 Neither has been demonstrated to have a transcription-enhancing property in fact, activated glucocorticoid responsive element mediates the downregulation of NF-κB-activated transcription by interfering with the binding of NF-κB p65 to its 시스-element 30 or by directly interfering with transactivation of the NF-κB p65 subunit. 31 There is no other 시스-element in the human IL-8 promoter that has been described. Thus, we propose that there is a novel 시스-element located in the 5′-flanking region between −1481 and −133 bp of the human IL-8 promoter. One likely candidate for this putative distant enhancer may be the peroxisome proliferator-activated receptor response element (PPRE).

Recently, work from our laboratory has shown that MM-LDL and Ox-PAPC activate PPRE and peroxisome proliferator-activated receptor-α activators and stimulate the production of MCP-1 and IL-8 in HAECs. 3 Additionally, the PPRE has been reported to function as an indispensable 시스-enhancing element that may be located as far as −2 kb upstream from the transcription initiation site. 32 These observations support the notion that the PPRE may be the 시스-enhancing element responsive to Ox-PAPC in the 5′-flanking sequence of the human IL-8 promoter.

In our current study, by using both gel shift assays and transient transfection experiments, neither the NF-κB nor AP-1 signaling pathway was activated by Ox-PAPC. This result is different from previous data showing activation of NF-κB and AP-1 signaling by Ox-LDL, 33–35 MM-LDL, 36 or oxidized phospholipids, such as platelet-activating factor-like lipids. 37 Activation of NF-κB by Ox-LDL was demonstrated to be a result of enhanced phosphorylation of inhibitor-κB in monocytes. 34 Platelet-activating factor-like lipids, enzymatically oxidative fragmentation products of ether-containing phosphatidylcholine, activate NF-κB signaling in the cells expressing platelet-activating factor receptors, such as monocytes. 37 MM-LDL was also shown by electrophoretic mobility shift assay to activate binding to an NF-κB consensus sequence. 36 Although Ox-PAPC activates the AP-1 element in isolation, it only minimally increased AP-1 binding on the electrophoretic mobility shift assay and activated the longer IL-8 promoter with the AP-1 mutation. Thus, we have demonstrated that unlike Ox-LDL, the AP-1 element is not important in the human IL-8 promoter activation by Ox-PAPC.

The difference in the effects of Ox-LDL, MM-LDL, platelet-activating factor-like lipids, and Ox-PAPC may be related to the different cell types used for these studies. Furthermore, they may be related to the different bioactive lipid components in Ox-PAPC versus Ox-LDL and platelet-activating factor-like lipids. We found that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine, an oxidative fragmented product purified from Ox-PAPC, is the major bioactive lipid that enhances monocyte binding to endothelial cells. 38 The level of this phospholipid is quite low in Ox-LDL furthermore, Ox-PAPC, being ester derived, does not contain platelet-activating factor-like lipids. In a separate study, it will be shown that 1-palmitoyl-2-(5,6-epoxyisoprostane E2)-sn-glycero-3-phosphocholine and its dehydration product are the lipids in Ox-PAPC that are mainly responsible for inducing IL-8 in HAECs.

In summary, this current study has provided information on the mechanism by which Ox-PAPC induces IL-8 transcription. We have demonstrated that Ox-PAPC transcriptionally regulates IL-8 and causes a prolonged increase in transcription, compared with TNF-α. This prolonged increase was not secondary to new protein synthesis. We have also shown that the induction of IL-8 by Ox-PAPC, unlike that by Ox-LDL or TNF-α, is not mediated by way of the NF-κB signaling pathway. IL-8 upregulation by Ox-PAPC is also not a result of activation of NF-κB, C/EBPβ, and AP-1 or of downregulation of a constitutive transcriptional repressor Oct-1. Rather, we have demonstrated that Ox-PAPC induces IL-8 expression by activation of a putative 시스-enhancer element in the upstream IL-8 promoter sequence. Our results showing differential regulation of the IL-8 promoter by Ox-PAPC compared with that by TNF-α provide a basis for the differences previously reported in genes activated by the 2 agents.

This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grant HL30568 and NIH training grant 5T32HL07895.

Received July 16, 2001 revision accepted July 27, 2001.

We thank Dr Yin Tintut for her technical support in several key experiments in this work.


Transcription: from DNA to mRNA

Both prokaryotes and eukaryotes perform fundamentally the same process of transcription, with the important difference of the membrane-bound nucleus in eukaryotes. With the genes bound in the nucleus, transcription occurs in the nucleus of the cell and the mRNA transcript must be transported to the cytoplasm. The prokaryotes, which include bacteria and archaea, lack membrane-bound nuclei and other organelles, and transcription occurs in the cytoplasm of the cell. In both prokaryotes and eukaryotes, transcription occurs in three main stages: initiation, elongation, and termination.

개시

Transcription requires the DNA double helix to partially unwind in the region of mRNA synthesis. The region of unwinding is called a transcription bubble . The DNA sequence onto which the proteins and enzymes involved in transcription bind to initiate the process is called a promoter . 대부분의 경우 프로모터는 조절하는 유전자의 상류에 존재합니다. The specific sequence of a promoter is very important because it determines whether the corresponding gene is transcribed all of the time, some of the time, or hardly at all (Figure 2).

그림 2: The initiation of transcription begins when DNA is unwound, forming a transcription bubble. Enzymes and other proteins involved in transcription bind at the promoter.

연장

Transcription always proceeds from one of the two DNA strands, which is called the template strand . The mRNA product is complementary to the template strand and is almost identical to the other DNA strand, called the nontemplate strand , with the exception that RNA contains a uracil (U) in place of the thymine (T) found in DNA. During elongation, an enzyme called RNA polymerase proceeds along the DNA template adding nucleotides by base pairing with the DNA template in a manner similar to DNA replication, with the difference that an RNA strand is being synthesized that does not remain bound to the DNA template. As elongation proceeds, the DNA is continuously unwound ahead of the core enzyme and rewound behind it (Figure 3).

그림 3: During elongation, RNA polymerase tracks along the DNA template, synthesizes mRNA in the 5′ to 3′ direction, and unwinds then rewinds the DNA as it is read.

종료

일단 유전자가 전사되면, 원핵생물 중합효소는 DNA 주형에서 분리되고 새로 만들어진 mRNA를 유리시키도록 지시해야 합니다. Depending on the gene being transcribed, there are two kinds of termination signals, but both involve repeated nucleotide sequences in the DNA template that result in RNA polymerase stalling, leaving the DNA template, and freeing the mRNA transcript.

On termination, the process of transcription is complete. In a prokaryotic cell, by the time termination occurs, the transcript would already have been used to partially synthesize numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently using multiple ribosomes (polyribosomes) (Figure 4). 대조적으로, 진핵 세포에서 핵의 존재는 동시 전사 및 번역을 배제합니다.

그림 4: 다수의 중합효소는 단일 박테리아 유전자를 전사할 수 있는 반면 다수의 리보솜은 mRNA 전사체를 폴리펩티드로 동시에 번역합니다. 이러한 방식으로 특정 단백질은 박테리아 세포에서 빠르게 고농도에 도달할 수 있습니다.


전사와 번역의 관계는 무엇입니까?

전사 유전자 서열의 RNA 사본을 만드는 과정입니다. 번역 단백질 합성 과정에서 전령 RNA 분자의 서열을 아미노산 서열로 번역하는 과정이다. 따라서 두 프로세스 사이의 관계는 둘 다 단백질 합성에 관여하고 전사가 첫 번째이고 번역이 두 번째라는 것입니다. 궁극적으로 이것이 유전적 측면에서 전사와 번역에 대해 우리가 알고 있는 전부입니다. 전사 및 번역에 대해 더 알고 싶다면 계속 읽으십시오. 서비스에 대해 이야기할 때.

공개 연설, 인터뷰, 시장 조사 또는 재무 보고서에 관계없이 메시지가 가능한 한 많은 청중에게 전달되기를 바란다면 이를 전사한 다음 대상 언어로 번역하는 것을 고려해야 합니다. 자, 시작합니다!

전사

유전학에서와 마찬가지로 전사가 먼저 일어나야 합니다. Merriam Webster에 따르면, 말한 단어의 서면, 인쇄 또는 타이핑된 사본을 만드는 행위입니다. 예를 들어, 오디오 및 비디오 파일의 문서화된 텍스트 형식을 갖는 것은 비즈니스에 절대적으로 필요합니다. 말하는 내용을 추적하고 더 잘 이해하는 실용적인 방법입니다. 아이디어가 마음에 들면 녹음에 익숙하지 않은 사람이 오디오 레코드를 일반 텍스트 문서로 변환하는 데 많은 시간이 걸리므로 신중하게 계획하십시오. 팁: 이 피곤하고 지루한 작업은 기밀성, 정확성 및 최고 품질을 보장하는 전문 전사에게 맡기십시오.

번역

번역본이 준비되고 교정되면 번역을 계속 진행할 수 있습니다. 기본적으로 한 언어를 다른 언어로 변경하는 행위입니다. 그러나 실제로는 단순히 단어를 다른 언어로 해당 단어로 바꾸는 것이 아닙니다. 양질의 번역은 원본 텍스트의 단어가 나온 맥락과 문화적 배경을 알고, 새롭고 다른 문화적 맥락에서 원본의 내용과 의미를 가장 잘 전달할 수 있는 새로운 언어로 된 단어와 구를 선택하는 것을 포함합니다. 이 모든 일이 발생하지 않으면 메시지가 잘못 해석되거나 손실될 수 있습니다. 또한 이 서비스를 위해 리소스를 투자할 예정이라면 최적의 타이밍, 단순성 및 청중 적응을 추구해야 합니다.


Regulated nuclear translocation of the Mig1 glucose repressor.

Glucose represses the transcription of many genes in bakers yeast (Saccharomyces cerevisiae). Mig1 is a Cys2-His2 zinc finger protein that mediates glucose repression of several genes by binding to their promoters and recruiting the general repression complex Ssn6-Tup1. We have found that the subcellular localization of Mig1 is regulated by glucose. Mig1 is imported into the nucleus within minutes after the addition of glucose and is just as rapidly transported back to the cytoplasm when glucose is removed. This regulated nuclear localization requires components of the glucose repression signal transduction pathway. An internal region of the protein separate from the DNA binding and repression domains is necessary and sufficient for glucose-regulated nuclear import and export. Changes in the phosphorylation status of Mig1 are coincident with the changes in its localization, suggesting a possible regulatory role for phosphorylation. Our results suggest that a glucose-regulated nuclear import and/or export mechanism controls the activity of Mig1.


비디오 보기: Transcription DNA to mRNA (칠월 2022).


코멘트:

  1. Corbett

    당연하지. 발생합니다. 우리는이 주제에 대해 의사 소통 할 수 있습니다. 여기 또는 오후에.

  2. Mezigar

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