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규제 가능한 발기인이란 무엇입니까? 그리고 그것을 어떻게 조절합니까?

규제 가능한 발기인이란 무엇입니까? 그리고 그것을 어떻게 조절합니까?



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나는 그들이 (S. cerevisae YNP5 균주에서) 특허를 읽고 있습니다.

기본 ERG9 프로모터를 조절 가능한 MET3 프로모터로 교체하여 ERG9 유전자를 하향 조절합니다.

규제 가능한 프로모터는 무엇이며 어떻게 규제합니까? 표현을 하향 조절하기 위해 국물에 무언가를 추가해야합니까?

나는 문화 매체에서 특별한 것을 볼 수 없습니다.


조절 가능한 프로모터는 이 프로모터의 다운스트림 유전자 발현이 유도되거나 억제될 수 있음을 의미합니다. Met3는 이러한 조절 가능한 프로모터의 예이며 배지에 메티오닌을 첨가하여 조절됩니다. 효모에서 Met3 유전자는 메티오닌 생합성 경로의 효소인 ATP 설퍼릴라제를 암호화합니다. 메티오닌을 추가하면 Met3 프로모터에 의해 구동되는 유전자가 억제됩니다. 그 발현 수준은 배지에 추가된 메티오닌의 농도와 역 상관관계가 있기 때문입니다(이 백서의 그림).


규제 가능한 발기인이란 무엇입니까? 그리고 그것을 어떻게 조절합니까? - 생물학

박테리아와 고세균에서 단일 생화학적 경로의 여러 단계를 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자와 같은 관련 기능을 가진 구조 단백질은 일반적으로 게놈 내에서 함께 암호화됩니다. 오페론 하나의 통제 하에 함께 전사됩니다. 발기인. 이것은 폴리시스트론 전사체를 형성합니다(그림 1). 그런 다음 프로모터는 이러한 구조적 유전자의 전사 조절을 동시에 제어합니다. 그 이유는 이들이 모두 동시에 필요하거나 전혀 필요하지 않기 때문입니다.

그림 1. 원핵생물에서 관련 기능의 구조 유전자는 종종 게놈에서 함께 구성되고 단일 프로모터의 제어 하에 함께 전사됩니다. 오페론의 조절 영역에는 프로모터와 운영자가 모두 포함됩니다. 억제인자가 조작자에게 결합하면 구조 유전자가 전사되지 않습니다. 대안적으로, 활성제는 조절 영역에 결합하여 전사를 향상시킬 수 있습니다.

프랑스 과학자 프랑수아 야곱 (1920–2013) 및 자크 모노 파스퇴르 연구소에서는 박테리아 유전자가 오페론으로 조직화되는 것을 최초로 보여주었다. 라크 오페론 NS 대장균. 그들은 그것을 발견했습니다. 대장균, 유당을 에너지원으로 사용하는 데 필요한 효소를 암호화하는 모든 구조 유전자는 유당(또는 라크) 단일 프로모터의 제어 하에 있는 오페론, 라크 발기인. 이 공로로 그들은 1965년 노벨 생리의학상을 수상했습니다.

진핵생물의 유전자는 오페론으로 조직화되어 있지 않지만, 원핵생물의 오페론은 일반적으로 유전자 조절에 대해 학습하기 위한 훌륭한 모델입니다. 진핵생물에는 오페론과 유사한 기능을 하는 유전자 클러스터가 있습니다. 많은 원리가 진핵생물 시스템에 적용될 수 있고 암과 같은 병리학적 변화를 초래할 수 있는 진핵생물의 유전자 발현 변화에 대한 우리의 이해에 기여할 수 있습니다.

각 오페론에는 조절 영역이라고 하는 영역에 위치한 자체 전사에 영향을 미치는 DNA 서열이 포함되어 있습니다. 조절 영역은 프로모터와 프로모터를 둘러싸는 영역을 포함하며, 전사 인자, 조절 유전자에 의해 암호화된 단백질은 결합할 수 있습니다. 전사 인자는 결합에 영향을 미칩니다. RNA 중합효소 프로모터에 전달하고 이의 진행이 구조 유전자를 전사할 수 있도록 합니다. NS 억제자 외부 자극에 대한 반응으로 유전자의 전사를 억제하는 전사인자로서 조절영역 내의 DNA 염기서열과 결합하여 외부자극 운영자, 프로모터의 RNA 중합효소 결합 부위와 첫 번째 구조 유전자의 전사 시작 부위 사이에 위치한다. 억제인자 결합은 RNA 중합효소가 구조 유전자를 전사하는 것을 물리적으로 차단합니다. 반대로, 활성제 RNA 중합효소가 프로모터에 결합하는 것을 촉진하여 외부 자극에 대한 반응으로 유전자의 전사를 증가시키는 전사 인자입니다. NS 유도자조절 분자의 세 번째 유형은 억제인자 또는 활성제와 상호작용하여 전사를 활성화하거나 억제하는 소분자입니다.

원핵생물에는 유전자 산물이 다소 일관되게 필요하고 따라서 발현이 조절되지 않는 오페론의 예가 있습니다. 이러한 오페론은 구성적으로 표현, 이는 세포에 일정한 중간 수준의 단백질 제품을 제공하기 위해 지속적으로 전사되고 번역됨을 의미합니다. 이러한 유전자는 핵심 대사에 관여하는 효소뿐만 아니라 DNA 복제, 복구 및 발현을 포함하여 세포 유지에 필요한 하우스키핑 기능에 관여하는 효소를 암호화합니다. 대조적으로, 필요할 때만 발현되고 억제인자, 활성인자 및 유도인자에 의해 조절되는 다른 원핵 오페론이 있습니다.


13.1: GAL1 프로모터의 조절

  • 제공: Clare M. O&rsquoConnor
  • Boston College 명예(생물학) 부교수

효모에서 해당과정은 에너지 생산에 중요한 역할을 하며 포도당은 선호하는 탄소원과는 거리가 멀다. 다른 탄소원의 대사에 관여하는 유전자는 일반적으로 포도당을 이용할 수 있을 때 억제됩니다. 그러나 포도당을 이용할 수 없을 때 효모는 갈락토스와 같은 다른 이용 가능한 에너지원을 대사하는 유전자를 활성화합니다. 갈락토오스는 갈락토오스를 세포로 수송하고 궁극적으로 해당과정의 중간체인 포도당-6-인산(G6P)으로 전환시키는 효소에 대한 여러 유전자의 전사를 증가시킵니다. 갈락토오스에 의해 유도된 경로의 첫 번째 유전자, 갈1, 갈락토오스를 갈락토오스-1-포스페이트로 인산화하는 갈락토키나아제를 암호화합니다. (체크 아웃 갈1 경로 링크는 SGD에 있습니다.) 갈1 프로모터는 pBG1805 및 pYES2.1 플라스미드 모두에서 ORF 부위의 업스트림에 통합되어 플라스미드 인코딩된 플라스미드의 전사를 제어합니다. 만나다/만나다 그리고 락지 형질전환된 세포의 유전자.

반대쪽 페이지의 그림은 유전자 발현에 대한 간단한 개요를 제공합니다.갈1 글루코스, 라피노스 및 갈락토스의 존재하에 프로모터. 프로모터는 DNA 서열 내에 암호화된 음성 및 양성 조절 부위를 모두 포함합니다. 포도당이 있는 경우 억제 단백질은 음성 조절 부위에 결합하여 전사를 억제합니다. Gal4p 전사 활성제는 양성 조절 부위에 결합합니다. Gal4p는 이합체로 DNA에 결합하는 전사 인자입니다. (이 장의 시작 부분에 있는 그림은 DNA와 복합된 Gal4p의 이합체화 도메인 및 결합 결합의 결정 구조를 보여줍니다.) 포도당이 있는 경우 Gal4p는 억제 단백질인 Gal80p에 결합되어 있기 때문에 비활성입니다.

포도당 억제는 라피노스와 같은 열악한 탄소원에서 세포를 성장시킴으로써 완화될 수 있습니다. 라피노스는 갈락토스, 과당 및 포도당으로 구성된 삼당류입니다. 라피노스는 높은 수치를 유도할 수 없습니다. 갈1 갈락토오스가 필요한 발현. 갈락토오스의 존재하에서 발현 갈1 유전자 증가

포도당이 있을 때 관찰되는 수준보다 1000배 높습니다. 이 자극은 주로 억제성 Gal80p 단백질에 더 이상 결합되지 않는 Gal4p의 활성으로 인한 것입니다. Gal4p는 갈락토스 대사의 마스터 레귤레이터 역할을 합니다. 활성화하는 것 외에도 갈1 전사, Gal4p는 또한 프로모터에 결합합니다. GAL7 그리고 갈10 인접해 있는 유전자는 갈1 효모 염색체 2의 유전자. 갈1, NS GAL7 그리고 갈10 유전자는 갈락토스 대사에 관여하는 단백질을 암호화합니다.

규제 갈1발기인. 포도당이 존재하면 억제 단백질이 조절 부위에 결합하기 때문에 전사가 억제됩니다.
DNA 및 Gal4p 전사 활성화제. 포도당 억제는 라피노스가 있으면 완화되지만 Gal4p는 비활성화 상태로 남아 있습니다.
Gal4p는 Gal80p 단백질의 제거로 인해 갈락토오스가 존재할 때 전사를 활성화합니다.


T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템을 사용한 발현

이 단원에서는 유전자를 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 제어 하에 두어 유전자의 발현을 설명합니다. T7 RNA 중합효소는 매우 활성적인 효소입니다. E. coli RNA 중합효소보다 몇 배 빠른 속도로 RNA를 합성하고 전사를 종료하는 빈도는 더 낮습니다. 전사는 플라스미드를 일주할 수 있어 플라스미드 길이의 몇 배에 달하는 RNA가 생성됩니다. . T7 RNA 중합효소는 또한 자체 프로모터 서열의 개시에 대해 매우 선택적이고 E. coli RNA 중합효소를 억제하는 리팜피신과 같은 항생제에 내성입니다. 결과적으로, T7 RNA 중합효소를 생산하는 세포에 리팜피신을 첨가하면 T7 RNA 중합효소 프로모터(p(T7))의 제어 하에 유전자가 독점적으로 발현됩니다. 기본 프로토콜에서 두 개의 플라스미드가 동일한 E. coli 세포 내에서 유지됩니다. 하나(발현 벡터)는 발현될 유전자의 업스트림에 p(T7)을 포함합니다. 두 번째는 열 유도성 대장균 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소 유전자를 포함합니다. 열 유도 시, T7 RNA 중합효소가 생성되고 발현 벡터에서 전사를 개시하여 p(T7)의 제어 하에 유전자(들)의 발현을 초래한다. 원하는 경우 최소 배지에서 절차를 수행하고 E. coli RNA 중합효소를 억제하기 위해 리팜피신을 첨가한 다음 [35S]메티오닌으로 단백질을 표지함으로써 유전자 산물을 고유하게 표지할 수 있습니다.


참고문헌

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발기인이란?

프로모터는 전사를 시작하는 유전자의 주요 조절 요소 중 하나입니다. 코돈 서열의 상류인 유전자 근처에 위치합니다. 프로모터의 크기는 100-1000bp일 수 있습니다. 반응 요소라고 하는 특정 DNA 서열은 RNA 중합효소와 RNA 중합효소를 모집하는 전사 인자 모두에 대한 초기 결합 부위를 제공합니다. RNA 중합효소는 전사를 담당하는 효소로, 상보적인 RNA 뉴클레오티드를 중합하여 mRNA 분자를 합성합니다.

그림 2: 프로모터

시그마 인자와 관련된 박테리아 RNA 중합효소는 프로모터에 결합할 수 있습니다. 시그마 인자는 세균의 전사 개시 인자입니다. 진핵생물에서는 RNA 중합효소를 모집하기 위해 약 7개의 서로 다른 기본 전사 인자가 프로모터에 결합되어야 합니다.


프로모터 서열과 유전자 발현 강도 간의 관계

프로모터 강도 또는 활성은 유전 공학 및 합성 생물학에서 중요합니다. 하나의 주어진 RNA에 대해 특정 강도를 갖는 구성적 프로모터는 종종 다른 RNA에 재사용될 수 있습니다. 따라서 한 프로모터의 강도는 주로 염기 서열에 의해 결정됩니다. 유전 공학 및 합성 생물학의 주요 어려움 중 하나는 주어진 수준에서 특정 단백질의 발현을 제어하는 ​​방법입니다. 이 목표를 달성하기 위해 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 전사 속도를 조절하는 데 사용할 수 있는 적절한 강도를 가진 하나의 프로모터를 선택하여 필요한 수준의 단백질 발현을 유도하는 것입니다. 이를 위해 지금까지 많은 프로모터 라이브러리가 실험적으로 구축되었습니다. 그러나 뉴클레오티드 서열에서 하나의 프로모터의 강도를 예측하는 이론적 방법이 바람직합니다. 이러한 방법은 특정 강도의 프로모터 설계에 유용할 뿐만 아니라 유전자 전사에서 프로모터의 메커니즘을 이해하는 데에도 의미가 있습니다. 이 연구에서는 다양한 테스트를 통해 프로모터 강도와 뉴클레오티드 서열 간의 관계를 설명하는 이론적 모델을 제시합니다. 우리의 분석은 프로모터 강도가 서열에 인접한 3개의 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 그룹에 의해 크게 영향을 받는다는 것을 보여줍니다. 한편, 프로모터 서열의 상이한 영역에 있는 뉴클레오티드는 프로모터 강도에 상이한 효과를 갖는다. 에 대한 실험 데이터를 기반으로 대장균 프로모터에서, 우리의 계산은 프로모터 서열의 -10 영역, -35 영역 및 판별자 영역의 뉴클레오티드가 간격 영역의 뉴클레오티드보다 프로모터 강도를 결정하는 데 더 중요함을 나타냅니다. 실험 데이터에 피팅하여 얻은 모델 매개변수 값으로 4개의 프로모터 라이브러리는 유전자 발현의 프로모터 강도에 대한 데이터가 이전에 측정된 해당 실험 환경에 대해 이론적으로 구축됩니다.

그래픽 요약

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결과

조건부 고갈 Lhx8 ~에 의해 Gdf9Cre 대규모 원시 난포 활성화를 유발합니다.

우리는 이전에 글로벌 녹아웃을 보고했습니다. Lhx8 출생 후 7일(PD7)까지 불임 및 난모세포 손실을 유발합니다[14]. 글로벌 녹아웃에서 Lhx8, 원시 같은 난포가 형성되지만(직경이 20μm 미만이고 편평한 과립막 세포로 둘러싸인 난모세포), 난모세포는 성장하지 않습니다. 부터 Lhx8 배아 및 출생 후 여성 생식 세포 모두에서 발현되며, Lhx8 출생 후 난모세포 고갈로 이어지는 초기 배아 경로를 방해합니다. 따라서 우리는 의 출생 후 기능을 조사했습니다. Lhx8 floxed를 사용하여 조건부 녹아웃 마우스를 생성하여 Lhx8 대립 유전자(Lhx8 플렉스/플렉스 ) [15] 및 Gdf9Cre 형질전환 마우스 [16]. NS Gdf9Cre 이식 유전자가 비활성화됩니다 Lhx8 특히 원시 난자에서. Gdf9Cre 난모세포에서 매우 효율적이며 둘 중 하나에 존재할 때 Lhx8 플렉스/플렉스 또는 Lhx8 플렉스// 같은 난소 표현형을 나타내는 동물. 우리는 사용했었다 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 의 효과를 연구하기 위해 Lhx8 난소 발달에 대한 원시 난포의 조건부 결핍.

PD7 및 PD14에서 LHX8 단백질이 고갈되었습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소와 대규모 난모세포 활성화가 원시 난포에서 발생했으며, 주변 편평한 과립막 세포의 상당한 변형 없이 직경이 20μm보다 큰 난모세포에 의해 나타납니다(그림 1a-f). PD7에서는 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 생쥐는 난소당 398 ± 53개의 활성화된 원시 난포를 가졌으나 난소당 16 ± 2개를 가졌습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 통제 수단. 원시 난포의 수는 1917±23개였다. Lhx8 플렉스/플렉스 에서 난소당 1043 ± 119로 크게 감소했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 마우스(그림 1c). 우리는 1차 모낭의 감소를 감지했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 생쥐는 활성화된 원시 모낭에서 일차 모낭으로의 전환이 차단되었음을 의미합니다. PD7에는 무시할 수 있는 수의 고급 난포 유형(과립막 세포의 여러 층으로 둘러싸인 난모세포)이 있었습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소에 비해 Lhx8 플렉스/플렉스 통제 수단.

출생 후 비활성화 Lhx8 원시 난포의 조기 활성화 및 난소 기능 부전을 유발합니다. NS 그리고 NS 항-LHX8 항체는 출생 후 7일(PD7)에 채취한 파라포름알데히드 고정 난소 및 헤마톡실린 대조염색 난소에서 난자를 검출하는 데 사용되었습니다. 난소는 대조군(Lhx8 플렉스/플렉스 , 가) 및 Lhx8 조건부 녹아웃(Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre, B) 마우스. 화살촉 에서 삽입 패널 A의 항-LHX8 항체로 염색되는 원시 모낭을 나타냅니다(갈색 신호). 화살촉 에서 삽입 패널 B에서 활성화된 원시 난포(입방형 과립막 세포가 없는 20μm보다 큰 난모세포)를 보여줍니다. NS, 이자형, NS 그리고 시간 PD14(D 및 E) 및 PD21(G 및 H) 난소 대조군(D 및 G) 및 과요오드산-쉬프(PAS) 염색 Lhx8 조건부 녹아웃(E 및 H) 마우스. 화살촉 에서 삽입 패널 D 및 E의 원시 활성화 원시 모낭을 나타냅니다. , NS 그리고 NS 난포 유형의 정량화 Lhx8 플렉스/플렉스 그리고 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 쥐. PD7(C), PD14(F) 및 PD21(I)의 5쌍의 난소를 파라핀에 포매하고 5μm 두께로 연속적으로 절편하고 난포를 계수하였다. Anti-NOBOX 항체는 모낭 형성 전반에 걸쳐 난모세포 핵을 염색하고 우리 카운트에서 난모세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 다섯 번째 섹션마다 계산되었습니다. 우리는 원시 난포(PF), 활성화된 원시 난포(Act. PF, 입방형 과립막 세포가 없는 20μm보다 큰 난모세포 직경), 일차 난포(PrF) 및 이차/전강 난포(SF/AF)를 채점했습니다. *NS < 0.05, **NS < 0.01. 눈금 막대: 100μm(A, B, D, E, G 및 H) 20μm(삽입 A, B, D 및 E)

PD14에서, Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소에는 난소당 847 ± 82개의 활성화된 원시 난포가 포함되어 있는 반면, Lhx8 플렉스/플렉스 통제 수단. 원시 난포의 수는 1753 ± 204에서 크게 감소했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 353 ± 58인치로 제어 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소(그림 1f). PD21까지, 원시에서 이차로의 총 난포 수는 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소(그림 1g-i). PD35에는 난모세포와 난포가 거의 검출되지 않았습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소(추가 파일 1 참조: 그림 S1C) 및 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 암컷은 불임이었다(추가 파일 2 참조: 그림 S2A). 우리의 연구는 출생 후의 비활성화가 Lhx8 원시 난포의 난모세포 내에서 대량 난모세포 활성화, 체세포 변형으로부터 난모세포 활성화의 분리, 난모세포 사멸 및 불임으로 이어집니다.

LHX8은 PI3K-AKT 경로와 상호 작용합니다.

우리는 PD7에서 PI3K-AKT-mTOR 경로의 중요한 구성원을 인코딩하는 유전자의 RNA 발현을 조사했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난모세포. 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)은 발현의 유의한 변화를 감지하지 못했습니다. 프텐, 악트, 폭스3, PDK1, 엠토르, Rps6, 뎁터, 릭터, 또는 Tsc1/2 (이 중 일부는 그림 2에 나와 있습니다.) 이러한 결과는 LHX8이 PI3K-AKT-mTOR 경로에서 단백질을 암호화하는 것으로 알려진 유전자 하위 집합의 전사에 직접적인 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 그런 다음 우리는 PI3K-AKT 경로가 단백질 수준에서 활성화되었는지 여부를 평가했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난모세포. AKT는 세포 사멸과 PFA에서 중요한 역할을 하는 세린/트레오닌 특이적 단백질 키나제입니다. 인산화된 AKT는 FOXO3 인산화를 포함한 여러 다운스트림 경로를 활성화하여 난모세포 활성화를 유발합니다[8]. PD7 난소의 난모세포에 대한 Western blot 분석은 S473과 T308의 두 부위에서 AKT의 인산화가 더 높은 것으로 나타났습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 대조군보다 난모세포가 많다(그림 2h). 그러나 흥미롭게도 활성화된 원시 모낭에서는 p-AKT(T308)만 검출되었습니다(추가 파일 3: 그림 S3 참조).

AKT는 다음에서 활성화됩니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난모세포. NSNS 난모세포는 PD7 대조군(Lhx8 플렉스/플렉스 , Ctrl) 및 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre (G9cKO) 마우스 난소 및 RNA는 cDNA 전환 및 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 위해 추출되었습니다. 데이터는 다음으로 정규화되었습니다. 갭드 표현이고 평균의 표준 오차를 나타내는 오차 막대와 함께 평균 상대량(대조군과 비교)으로 제공됩니다. 재학생 NS- 테스트를 사용하여 계산했습니다. NS 가치. 의 표현에서만 유의미한 차이가 나타났다. Lhx8, 예상대로. ** NS < 0.01. 시간 난모세포는 PD7 대조군에서 분리되었으며 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소에서 단백질을 추출하고 AKT와 2개의 인산화된 형태(S473 및 T308)에 대한 항체를 사용하여 3개의 독립적인 샘플에 대해 웨스턴 블롯 테스트를 수행했습니다. 히스톤 H3 면역 반응성을 대조군으로 사용했습니다.

이전 연구에서는 PI3K-AKT-mTOR 경로를 통한 FOXO3 핵세포질 전위 및 rpS6 인산화가 PFA와 연관되는 것으로 나타났습니다[5, 6, 8]. 우리는 PD7에서 FOXO3 핵세포질 전위 및 rpS6 인산화를 조사했습니다. 프텐 그리고 Lhx8 조건부 녹아웃(그림 3 및 추가 파일 4: 그림 S4). FOXO3 핵세포질 전위는 30 μm보다 큰 난모세포에서 두드러졌지만 20~30 μm 사이의 난모세포에서는 뚜렷한 전위를 보이지 않았다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 마우스(그림 3d–f, f', p). 원시 난포의 난모세포 프텐 그리고 Lhx8 조건부 단일 녹아웃 및 상응하는 대조군은 FOXO3 핵세포질 전위를 나타내지 않았다. 그러나 FOXO3 핵세포질 전위는 PD7 이중 세포의 원시(<20μm) 난모세포에서 유의하게 유도되었다(그림 3j-l, l', p). Lhx8/프텐 조건부 녹아웃(Lhx8 플렉스/플렉스 프텐 플렉스/플렉스 Gdf9Cre). 이러한 데이터는 FOXO3 핵세포질 전위에 대한 LHX8 및 PTEN 단백질의 상승 작용을 나타냅니다.

Lhx8 및 Pten FOXO3 현지화에 대한 조건부 녹아웃 효과. NS 대조군 마우스에서(Lhx8 플렉스/플렉스 ), FOXO3는 원시 난모세포(PF, 화살 ~에 '). NSNSLhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 생쥐에서 광범위한 핵세포질 전위는 20~30μm(aPF, 화살 ~에 NS') 그러나 30μm(aPF, 화살 F'). NSNS FOXO3 현지화의 유사한 발현 패턴이 존재합니다. 프텐 조건부 녹아웃(프텐 플렉스/플렉스 Gdf9Cre) 쥐. NS 화살 ~에 NS'는 30μm 미만의 활성화된 원시 난포(aPF)에서 FOXO3의 핵 및 세포질 발현과 FOXO3의 세포질 발현을 모두 갖는 원시 난포(PF)를 나타냅니다. 제이 그러나 조건부로 두 가지가 모두 결핍된 쥐의 경우 Lhx8 그리고 프텐 (Lhx8 플렉스/플렉스 프텐 플렉스/플렉스 Gdf9Cre), FOXO3 핵세포질 전위는 원시, 활성화 및 일차 난모세포에 존재합니다. 음성 대조군은 2차 항체의 존재 하에서의 면역형광이며 다음과 같이 표시됩니다. 미디엄영형. NS 박스 영역 C, F, I, L, O는 C', F', I', L', O'로 확대되어 표시됩니다. NS FOXO3 분포의 그래픽 표현(세포질만 또는 핵 및 세포질). 난모세포는 크기(직경)에 따라 20μm 미만, 20~30μm, 30μm 이상으로 분류되었습니다. 투명한 DAPI 핵 염색이 있는 난모세포만 계수했습니다. 눈금 막대: 50μm(A–C, D–F, G–I, J–L 및 M–O) 20μm(C', F', I', L' 및 O')

우리는 또한 이중의 효과를 조사했습니다. 프텐 그리고 Lhx8 rpS6의 결핍. mTORC1은 부분적으로 S6K1의 활성화(트레오닌 389의 인산화에 의한)와 eIF4E 결합 단백질의 인산화 및 비활성화를 통해 단백질 번역과 세포 성장을 촉진합니다. S6K1은 rpS6의 인산화 및 활성화를 담당하며, 이는 단백질 번역 및 리보솜 생합성을 향상시킵니다. 통제에서, Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre, 그리고 프텐 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소에서 rpS6은 PD7에서 성장하는 난포에서만 유의하게 활성화되었습니다(추가 파일 4: 그림 S4 참조). 그러나 PD7 Lhx8 플렉스/플렉스 프텐 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소는 원시(<20μm) 난모세포에서 rpS6의 상당한 활성화를 보여주었습니다(추가 파일 4: 그림 S4D, D' 참조). 이러한 결과는 Lhx8 그리고 프텐 경로는 상승적으로 상호 작용하여 PFA와 관련된 두 가지 이벤트(FOXO3 핵세포질 전위 및 rpS6의 인산화)를 가속화합니다.

린28a RNA 및 단백질 발현은 Lhx8flx/flxGdf9Cre 난모세포에서 상향 조절됩니다

LHX8은 전사인자로서 그 주요 효과는 RNA 수준에서 나타날 것으로 예상된다. 따라서 우리는 의 전사체를 분석했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 고처리량 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 통해 난소. 우리는 각 샘플에서 1억 8천만 개의 태그를 시퀀싱하고 PD7에서 파생된 PI3K-AKT-mTOR 경로의 유전자에 의해 인코딩된 RNA 태그의 상대적 풍부함을 비교했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 및 난소를 제어합니다. PI3K-AKT-mTOR 경로 유전자의 RNA 발현에는 유의한 차이가 없습니다(픽3r1, 픽3카, 전부, 키틀, Gsk3b, CDnd1, 위1, Cdkn1a/NS, , Mlst8, 맵캡1, Prr5, 그리고 Eif4ebp1) RNA-seq 실험에서 분명했습니다(추가 파일 5: 표 S1 참조).

알려진 PI3K-AKT-mTOR 유전자의 발현을 분석하는 것 외에도, 우리는 전사체의 전체적인 차이를 연구했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 및 난소를 제어합니다. 6배 증가를 감지했습니다. 린28a RNA 전사체 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 대조군 난소와 비교(그림 4b 및 추가 파일 5: 표 S1). 항-LIN28A 항체를 사용한 면역형광 및 웨스턴 블롯 분석은 LIN28A 단백질이 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 대조군과 비교한 난모세포(그림 4a, c).

Lhx8 억제하다 린28a 표현. NS 항-LIN28A 항체를 사용한 면역형광은 LIN28A가 난소 내의 난모세포에서 우선적으로 발현된다는 것을 보여줍니다. LIN28A 풍부함은 더 높습니다 Lhx8 조건부로 결핍된 난모세포(Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre) 대조군(Lhx8 플렉스/플렉스 ). NS 그리고 린28a 전사체와 단백질이 훨씬 더 많이 발현됩니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 대조군(Ctrl)과 달리 난모세포(G9cKO). NSNS 난모세포에서 항-LHX8 친화도 정제된 항체를 사용한 염색질 면역침전(ChIP) 분석. NS LHX8 결합 공통 서열에 완벽하게 맞는 추정 LHX8 DNA 결합 부위인 TGATTG[22]는 린28a 전사 개시 부위. 이자형 항-LHX8 항체는 TGATTG 결합 서열을 포함하는 게놈 DNA를 침전시킨다. 린28a ChIP-정량적 PCR(qPCR)에 의해 표시되는 프로모터 영역. 면역글로불린 G(IgG) 항체가 대조군으로 사용되었습니다. 백분율 입력 방법은 qPCR 데이터를 분석하는 데 사용됩니다. "입력"은 면역 침전 전 염색질 펠릿의 PCR 산물입니다. 삼중 평균 CT 조정된 입력으로 정규화된 값을 백분율 입력 계산에 사용했습니다. 두 세트의 프라이머(F1 및 R1) 및 (F2 및 R2)를 사용하여 ChIP-qPCR을 수행했습니다. NS F1/R1 및 F2/R2 프라이머 세트에 의한 정상 기니피그 IgG 및 항-LHX8 항체에 의해 침전된 DNA 뿐만 아니라 난모세포 입력 DNA의 PCR 증폭. 스케일 바: 50μm(A)

LIN28A는 세포의 생합성을 차단하는 RNA 결합 단백질입니다. 허락하다-7 초경의 시작을 포함하여 포유동물의 신체 크기 및 신진대사의 알려진 조절인자 및 마이크로RNA[17, 18]. 린28a 난모세포와 배아줄기세포에서 우선적으로 발현된다[19, 20]. 또한 PI3K-AKT-mTOR 경로는 LIN28A에 의해 활성화될 수 있습니다[21]. 따라서 LIN28A는 난모세포 활성화 및 성장에 역할을 할 수 있습니다.

LHX8은 LHX8 DNA 결합 모티프에 직접 결합할 수 있습니다. 린28a 발기인

우리는 LHX8이 린28a 발기인. LHX8은 DNA에 결합할 것으로 예상되는 난모세포 특이적 LIM 호메오도메인 전사 조절자입니다. 이전 연구에서는 LHX8 호메오도메인이 TGATTG DNA 모티프에 우선적으로 결합하는 것으로 나타났습니다[22]. 우리는 단일 TGATTG DNA 모티프 -531 ~ -536 bp 상류에서 추정되는 전사 개시 부위를 확인했습니다. 린28a 유전자(그림 4d). NS 린28a TGATTG 모티프는 인간을 포함한 다른 포유류에서 보존됩니다. 우리는 고도로 특이적이고 친화도가 높은 정제된 항LHX8 항체를 사용하여 야생형 난모세포에 대해 염색질 면역침전(ChIP) 실험을 수행했습니다[13]. 항-LHX8 항체는 우선적으로 면역 침전 린28a TGATTG 모티프를 포함하는 프로모터 DNA 단편(그림 4e, f). 이 데이터는 LHX8이 린28a 에 직접 바인딩하여 표현 린28a 발기인.

린28a 결핍은 부분적으로 구출 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 표현형

우리의 데이터는 LHX8이 린28a 표현. LIN28A는 난모세포에서 우선적으로 발현되는 성장 촉진 인자[17, 23]이기 때문에 우리는 다음과 같은 가설을 세웠다. 린28a 결핍이 구해줄 것이다 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre-유도된 PFA. 우리는 사육했다 린28a 그리고 Lhx8 floxed 생쥐 Gdf9Cre 생성 Lhx8/린28a 이중 조건부 녹아웃(Lhx8 플렉스/플렉스 린28a 플렉스/플렉스 Gdf9Cre).

우리는 이중 녹아웃이 PFA에 미치는 영향을 확인하기 위해 난소 형태 측정 분석을 수행했습니다. 사이에 형태학적 차이가 관찰되지 않았습니다. 린28a 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 및 PD7에서 대조군 암컷(도 5a, c, e). 예상대로, 우리는 훨씬 더 적은 수의 활성화된 원시 모낭을 관찰했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 린28a 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 에 비해 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소가 있지만 대조군과 비교하여 완전히 정상은 아니었습니다(그림 5a, b, d, f).

린28a 결핍 구출 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre-유도된 PFA. NSNS 통제의 대표적인 조직학(Lhx8 플렉스/플렉스 ), Lhx8 조건부 녹아웃(Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre), 린28a 조건부 녹아웃(린28 플렉스/플렉스 Gdf9Cre) 및 이중 Lhx8/린28a 조건부 녹아웃(Lhx8 플렉스/플렉스 린28 플렉스/플렉스 Gdf9Cre) 난소. 더블 Lhx8/린28a 조건부 녹아웃은 활성화된 원시 모낭의 감소된 수를 보여줍니다. Anti-Nobox 항체를 사용하여 난모세포 핵(짙은 갈색)을 표시했습니다. PF: 원시 난포 aPF: 활성화된 원시 난포. 이자형 NS 린28 플렉스/플렉스 Gdf9Cre (Lin28G9cKO) 마우스는 대조군(Ctrl) 마우스와 유사한 표현형을 가지며 원시 모낭 수는 총 모낭의 백분율로 표시됩니다. NS 제어 중인 활성화된 원시 난포의 정량화, Lhx8 조건부 및 이중 Lhx8/린28a 조건부 녹아웃. 원시 난포(PF) 및 활성화된 원시 난포(aPF)의 백분율이 표시됩니다. 3쌍의 난소에서 Lhx8 조건부 녹아웃 및 더블 Lhx8/린28a 조건부 녹아웃 마우스를 연속적으로 절편화하고 5번째 절편마다 계수했습니다. NS AKT 인산화는 이중으로 감소합니다. Lhx8/린28a 조건부 녹아웃. 우리는 의 원시 및 활성화된 원시 모낭에서 형광 p-AKT(T308) 발현에 의해 정량화했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre (G9cKO) 및 Lhx8 플렉스/플렉스 린28a 플렉스/플렉스 Gdf9Cre (G9dKO) PD7의 난소. AKT 인산화의 현저한 감소가 있었다. Lhx8 플렉스/플렉스 린28a 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 원시 및 활성화된 원시 모낭에 비해 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre. 재학생 NS- 테스트를 사용하여 계산했습니다. NS 가치. *NS < 0.05, **NS < 0.01. 눈금 막대: 50μm(A–D)

부분적 구출 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre-유도 PFA 린28a 결핍은 다음과 같이 주장한다. 린28a 난모세포 성장의 조절제이다. 활성화된 원시 모낭의 감소된 수 Lhx8 플렉스/플렉스 린28a 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소는 AKT 경로 활성화도 감소함을 시사합니다. 우리는 의 원시 및 활성화된 원시 모낭에서 p-AKT(T308) 신호를 분석했습니다. Lhx8 플렉스/플렉스 린28a 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 그리고 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소(그림 5g)에서 그 발현이 Lhx8 플렉스/플렉스 린28a 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 난소는 난소에 비해 Lhx8 플렉스/플렉스 Gdf9Cre 쥐.

Lhx8 1차에서 2차로의 난포 이행을 조절합니다.

이전 연구에 따르면 PTEN 조절 경로는 원시 난모세포 활성화에 중요하지만 일차 난모세포에서는 중요하지 않습니다[24]. 우리는 의 역할을 연구했습니다. Lhx8 생성하여 일차 난모세포에서 Lhx8 플렉스/플렉스 Zp3Cre 쥐. Zp3Cre 1차 난모세포에서 특이적으로 발현되며, Lhx8 플렉스/플렉스 Zp3Cre 난소는 원시 난모세포가 아닌 원시에서 LHX8을 계속 발현합니다. 형태학적 분석은 Lhx8 플렉스/플렉스 Zp3Cre conditional knockout ovaries did not significantly differ from Lhx8 flx/flx (control) mice at PD0 and PD7 (Fig. 6a–f). However, at PD14, we counted 159 ± 23 primary follicles and 29 ± 7 secondary/antral follicles per ovary in the Lhx8 flx/flx Zp3Cre mice, compared to 79 ± 6 primary follicles and 108 ± 7 secondary/antral follicles per ovary in the control mice (Fig. 6g–i). The relative increase of primary follicles at PD14 and the relative decrease of multilayer follicles in the Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovary indicated that the transition from primary follicles to secondary follicles was blocked, which was consistent with the observation in Lhx8 flx/flx Gdf9Cre mice (Fig. 1f). At PD21 and PD30, we observed that many primary follicles were devoid of oocytes (Fig. 6k, n). We stained for LIN28A in PD21 ovaries and found that LIN28A was strongly expressed in Lhx8 deficient oocytes of the Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovary, but no expression was detected in the empty follicles (see Additional file 6: Figure S5). However, excluding these empty primary follicles, the number of primary follicles between control and Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries was not significantly different at PD21 or PD30 (Fig. 6l, o). For secondary/antral follicles, the number sharply dropped to 17 ± 3 at PD21 and to 2 ± 1 at PD30 in Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries, compared to 170 ± 2 and 104 ± 4, respectively, in control mice. These findings imply that the growing follicle pool continued to be eliminated from the Lhx8 flx/flx Zp3Cre 쥐. Lhx8 flx/flx Zp3Cre mice were infertile (see Additional file 2: Figure S2A) and superovulation treatment of Lhx8 flx/flx Zp3Cre mice did not produce oocytes (see Additional file 2: Figure S2B). This result was in accord with the sharp fall of secondary/antral follicles in the Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovary at PD21. Taken together, these data show that the folliculogenesis of Lhx8 flx/flx Zp3Cre mice is blocked in the transition from the primary to secondary follicle stage and results in primary oocyte death and infertility. The relative stability of the primordial follicle pool from PD14 to PD30 suggests that the PFA into primary follicles was not affected by the diminution in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries.

Lhx8 inactivation in primary follicles (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) abolishes follicle growth. Histomorphological analysis was done on control (Lhx8 flx/flx ) 그리고 Lhx8 deficient ovaries (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) at various stages of postnatal ovarian development ranging from newborn (PD0) to postnatal day 30 (PD30). NSNS Periodic acid–Schiff (PAS) staining and counting of different follicle types in the newborn and PD7 ovaries showed no significant differences between control and Lhx8 deficient ovaries. NS영형 Anti-NOBOX antibodies were used to stain oocytes (brown immunoreactivity) in ovaries from PD14 (G and H), PD21 (J and K), and PD30 (M and N) mice. At PD14, the Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries showed a significantly higher number of primary follicles (PrF) and significantly diminished number of secondary/preantral (SF/AF) follicles characterized by two or more layers of granulosa cells. At PD21 and PD30, the primary follicle pool did not differ significantly between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries however, there was a marked decrease in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in conditional knockouts including degenerating follicles without oocytes (marked by asterisks ~에 insets in K and N). The primordial follicle (PF) pool remained relatively stable between PD14 and PD30, with no significant difference between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries. **NS < 0.01. Scale bars: 100 μm (A, B, D, and E) 200 μm (G, H, J, K, M, and N) 50 μm (insets of K and N)


Tetracycline-inducible Empty Backbones

Find a construct that will allow you to insert and induce your gene of interest.

ID Plasmid Description Co-expressed tTA, rtTA, or TetR On or Off 파이
21916 Tet-pLKO-neo 3rd generation lentiviral plasmid for inducible expression of shRNA neomycin selection plasmid 21915 has puromycin selection TetR Wiederschain
41393 pCW57.1 Lentiviral vector for inducible expression for Gateway cloning selection cassette in format: PGK-rtTA-2A-puro see article for tagged insert options rtTA 뿌리
11651 pLVUT-tTR-KRAB Lentiviral vector for inducible expression of transgene or shRNA see article for detailed information about cloning and additional plasmids tetR-KRAB Aebischer & Trono
16542 pBI-MCS-EGFP Expression of your gene of interest (MCS with a &beta-globin poly A) & EGFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA 없음 Vogelstein
25735 pSLIK-Neo Lentiviral vector for inducible expression of a miR-shRNA selection cassette in format: rtTA3+IRES+Neo see article for additional selection options third-generation rtTA 프레이저
44012 pInducer20 Lentiviral vector for shRNA expression see article for additional tookit plasmids third-generation rtTA Elledge
19407 pTREtight2 Promoter contains a modified TRE that is silent in absence of binding tTA or rTA has high copy E. coli origin 없음 어느 하나 Ralser
64238 pTet-IRES-EGFP Lentiviral plasmid for inducible expression of transgene of interest and EGFP 없음 어느 하나 Lung
11662 pPRIME-TET-GFP-FF3 Lentiviral, miRNA expression (PRIME) system for application in knockdown of gene expression at a single copy in mammalian cells Expresses firefly luciferase hairpin and GFP under pTREtight promoter 없음 어느 하나 Elledge
35625 pAAV-Ptet-RFP-shR-rtTA AAV shRNA cloning vector for evaluation of shRNA efficacy using fluorescence use with pGFPns-reporter for cDNA target rtTA
60495 pSBtet-GP Sleeping Beauty transposon system has luciferase in cloning site see article for additional selection and FP option rtTA Kowarz
16623 pBI-GFP Expression of your gene of interest & GFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA 없음 어느 하나 Vogelstein
100521 pCW57.1-MAT2A Lentiviral Tet-Off all in one plasmid derived from pCW57.1. rtTA was replaced with tTA, and Puromycin was replaced with Blasticidin selection. Please NOTE, this vector contains an insert (MAT2A) which would need to be replaced by the gene of interest. tTA 끄다 Sabatini
92099 AAVS1_Puro_Tet3G_3xFLAG_Twin_Strep Bidirectional promoter controls expression of gene of interest with Strep-Tag and Tet-On 3G transactivator, creating an auto-regulated Tet-On 3G System. Contains homology arms for integration into AAVS1 Genomic Safe Harbor Locus. Tet-On 3G Doyon
58245 pGLTR-X-GFP Single vector lentiviral Gateway RNAi system for conditional cell line generation contains expression cassette for TetR-P2A-GFP see article for additional constructs TetR Geley


실시예 4

In experiments using 에스. 아우레우스 cells grown in culture, intracellularly expressed ssJT01ss bound to and inhibited a specific essential cellular target in a manner similar to that of an antimicrobial drug. Hence induction of expression of this peptide during an infection should have the effect of an antibiotic. An established animal infection model was used to test this concept (Onyegji, C. O. et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38:112-117, 1994).

Six groups of CD-1 female mice (5 mice per group, Charles River Laboratories, Wilmington, Ma.) weighing 20-24 grams were used in this experiment. The inoculum was prepared from CYL316tt/pC 3 883 (encoding a ssJT01ss peptide-GST fusion protein under the control of the tet operon) which was cultured at 37° C. for 17 hours in TS broth containing erythromycin and kanamycin. 1.6×10 10 cfu (colony-forming units) of 에스. 아우레우스 CYL316tt/pC 3 883 (OD 600 of 0.1=10 8 cfu/ml) from the overnight culture were diluted to 20 ml with 0.01 M PBS (Sigma P-0261) containing 8% hog gastric mucin (Sigma M-2378) as well as 50 μg/ml kanamycin and 10 μg/ml erythromycin. Each mouse of groups 1 through 4 was injected with 0.5 ml of the inoculum intraperitoneally (i.p.), equivalent to 4×10 8 cfu/mouse (lethal dose). Groups 5 and 6 served as vector controls. Each mouse of these two groups was injected with 4×10 8 cfu of CYL316tt/pC 3 875, which was cultured and processed the same way as CYL316tt/pC 3 883. One half hour and four hours after the inoculation, groups 1 and 5 received a saline injection i.p. at 10 ml/kg groups 2 and 6 received i.p. injections of tetracycline (Sigma T-3383) at 8 mg/kg group 3 received i.p. injections of tetracycline at 4 mg/kg group 4 received i.p. injections of ciprofloxacin (Bayer 851510, dissolved in water) at 50 mg/kg. The injection volume for all the animals was 10 ml/kg. Surviving mice were counted at 7 days post inoculation. Ciprofloxacin given at 50 mg/kg protected all infected animals from lethal infection.

The data summarized in Table 2 demonstrate that induction of intracellular expression of the ssJT01ss peptide can be achieved in an animal infection. 억제 에스. 아우레우스 MetRS by the intracellularly expressed ssJT01ss peptide cured a lethal infection in a mouse model.

TABLE 2
억제 에스. 아우레우스 growth in mice by intracellular production
NS 에스. 아우레우스 MetRS inhibitor
# of Mice# of Mice
Experimental ConditionTested활착
M1 Peptide
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C255
Expression Control
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C250

The relevant teachings of all references cited herein are hereby incorporated by reference herein in their entirety.

While this invention has been particularly shown and described with references to preferred embodiments thereof, it will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.

28 1 33 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 1 acgggtcgac tcatatcttt tattcaataa tcg 33 2 32 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 2 ccggaaagct tacttattaa ataatttata gc 32 3 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 3 taagtaagct taaggaggaa ttaatgatgt ctag 34 4 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 4 acgggtcgac ttaagaccca ctttcacatt taag 34 5 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 5 ctcggtaccg agctaaaatt cggaggcata tcaaatgagc tctgg 45 6 44 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 6 ggcatatcaa atgagctctg gaggtggagg catgtcccct atac 44 7 31 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 7 aggcctaggt taatccgatt ttggaggatg g 31 8 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 8 ctgatccgaa tacgtggcag ttgcggtggc ctatgcatag ct 42 9 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 9 atgcataggc caccgcaact gccacgtatt cggatcagag ct 42 10 48 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 10 tcgagttcat gaaaaactaa aaaaaatatt gacatcccta tcagtgat 48 11 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 11 agagataatt aaaataatcc ctatcagtga tagagagctt gcatg 45 12 29 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 12 caagctctct atcactgata gggattatt 29 13 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 13 ttaattatct ctatcactga tagggatgtc aatatttttt ttagtttttc atgaac 56 14 58 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 14 aataaaaaac tagtttgaca aataactcta tcaatgatag agtgtcacaa aaaggagg 58 15 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 15 gatagagtgt caacaaaaag gaggaattaa tgatgtcccc tatactaggt tattgg 56 16 36 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 16 ggattaaggt aaccttaatc cgattttgga ggatgg 36 17 12 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 17 Asp Pro Asn Thr Trp Gln Leu Arg Trp Pro Met His 1 5 10 18 6 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 18 Gly Gly Arg Gly Gly Met 1 5 19 54 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 19 gatcctaata catggcagtt gaggtggcct atgcatggcg gccgcggagg tatg 54 20 66 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 20 agctctgatc ctaatacatg gcagttgagg tggcctatgc attcttcagg cggccgcgga 60 ggtatg 66 21 21 PRT Artificial Sequence peptide 21 Ser Arg Trp Glu Lys Tyr Ile Asn Ser Phe Glu Leu Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 22 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 22 tctagatggg aaaaatatat taattctttt gaattagatt ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 23 21 PRT Artificial Sequence peptide 23 Ser Ser Gln Gly Thr Met Arg Trp Phe Asp Trp Tyr Arg Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 24 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 24 agctctcaag gtactatgag atggtttgat tggtatagat ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 25 49 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 25 agcaccttgg cggccgcgga ggtgctagca aaggagaaga actcttcac 49 26 37 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 26 aactgaggta acctcagttg tacagttcat ccatgcc 37 27 52 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 27 tttaccttgg cggccgcgga ggtaaactga agaaggtaaa ctggtaatct gg 52 28 40 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 28 acttagggta accttaagtc tgcgcgtctt tcagggcttc 40


Identification of the Omega4514 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus that is transcribed in vitro by the major vegetative RNA polymerase

Omega4514 is the site of a Tn5 lac insertion in the Myxococcus xanthus genome that fuses lacZ expression to a developmentally regulated promoter. DNA upstream of the insertion site was cloned, and the promoter was localized. The promoter resembles vegetative promoters in sequence, and sigma(A) RNA polymerase, the major form of RNA polymerase in growing M. xanthus, initiated transcription from this promoter in vitro. Two complete open reading frames were identified downstream of the promoter and before the Omega4514 insertion. The first gene product (ORF1) has a putative helix-turn-helix DNA-binding motif and shows sequence similarity to transcriptional regulators. ORF2 is most similar to subunit A of glutaconate coenzyme A (CoA) transferase, which is involved in glutamate fermentation. Tn5 lac Omega4514 is inserted in the third codon of ORF3, which is similar to subunit B of glutaconate CoA-transferase. An orf1 disruption mutant exhibited a mild sporulation defect, whereas neither a disruption of orf2 nor insertion Omega4514 in orf3 caused a defect. Based on DNA sequence analysis, the three genes are likely to be cotranscribed with a fourth gene whose product is similar to alcohol dehydrogenases. ORF1 delays and reduces expression of the operon during development, but relief from this negative autoregulation does not fully explain the regulation of the operon, because expression from a small promoter-containing fragment is strongly induced during development of an orf1 mutant. Also, multiple upstream DNA elements are necessary for full developmental expression. These results suggest that transcriptional activation also regulates the operon. Omega4514 is the first example of a developmentally regulated M. xanthus operon that is transcribed by the major vegetative RNA polymerase, and its regulation appears to involve both negative autoregulation by ORF1 and positive regulation by one or more transcriptional activators.

피규어

Physical map of the Ω4514…

Physical map of the Ω4514 insertion region and summary of upstream segments tested…

Developmental expression of 락지 under…

Developmental expression of 락지 under the control of the Ω4514 promoter. Developmental β-galactosidase…

Localization of an mRNA 5′…

Localization of an mRNA 5′ end within the Ω4514 upstream region. Low-resolution S1…

Primer extension analysis of Ω4514…

Primer extension analysis of Ω4514 mRNA. RNA was isolated from wild-type DK1622 cells…

Developmental expression of 락지 from…

Developmental expression of 락지 from a small segment containing the Ω4514 promoter. Developmental…

In vitro transcription from the…

In vitro transcription from the Ω4514 promoter. DNA fragments containing the Ω4514 promoter…

Western blot analysis of σ…

Western blot analysis of σ A in growing and developing 엠. 크산투스 cells.…

의 효과 orf1 그리고 orf2…

의 효과 orf1 그리고 orf2 mutations on developmental 락지 expression under the control…

Level of ORF1 protein and…

Level of ORF1 protein and β-galactosidase specific activity during growth and development. (NS)…

Sequences of promoters transcribed in…

Sequences of promoters transcribed in vitro by 엠. 크산투스 σ A RNAP. The…


비디오 보기: Бмв е39 525 за что смотреть при покупке bmw e39 (팔월 2022).