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(마이크로)어레이 데이터 분석 자료

(마이크로)어레이 데이터 분석 자료



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저는 현재 사이토카인 어레이 데이터를 분석하고 있습니다. 이러한 데이터의 통계 분석에 사용할 수 있는 자료는 만족스럽지 않습니다. 유전자 마이크로어레이 및 MALDI-TOF 프로테옴 데이터의 분석에 많은 노력을 기울이고 있기 때문에 이러한 방법을 내 사이토카인 어레이에 적용하려고 합니다.

마이크로어레이 분석, 특히 품질 관리 및 오류 추정에 대한 좋은 소개 텍스트는 무엇입니까?


시작하기에 좋은 곳은 마이크로어레이 데이터 분석을 위한 통계적 방법입니다. 또한 Terry Speed, Gary Churchill, John Quackenbush 및 Gordon Smyth의 연구실에서 나온 논문을 제안합니다.

또한 귀하의 정확한 문제, 즉 DNA 마이크로어레이용으로 개발된 방법을 단백질 어레이 분석에 적용하는 방법을 구체적으로 반영하는 몇 가지 논문을 찾았습니다.

  • 에켈-파소우 et al. 항체 마이크로어레이의 실험적 설계 및 분석: cDNA 어레이의 방법 적용. 암 입술. 2005년 4월 15일;65(8):2985-9.
  • 로이스 et al. 기존 DNA 마이크로어레이 통계를 타일링 및 단백질 마이크로어레이 기술로 외삽합니다. 방법 Enzymol. 2006;411:282-311.

최고의 마이크로어레이 데이터 분석 소프트웨어

고품질 이미지 처리 및 적절한 데이터 분석은 마이크로어레이 실험의 중요한 단계입니다. 이 BiologyWise 기사에서는 마이크로어레이 실험에서 통계적으로나 생물학적으로 중요한 정보를 추출하는 데 사용할 수 있는 최고의 마이크로어레이 데이터 분석 소프트웨어에 대해 간략히 설명합니다.

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알고 계셨나요?
단일 마이크로어레이는 약 10 5 – 10 6 데이터 조각을 생성합니다.

저희를 위해 글을 쓰시겠습니까? 글쎄, 우리는 소문을 퍼뜨리고 싶은 좋은 작가를 찾고 있습니다. 연락주시면 상담해드리겠습니다.

생성된 엄청난 양의 데이터에 대한 정확한 분석에 이은 마이크로어레이 실험은 유전자 기능, 유전자 발현, 경로 분석, 게놈 비교 등 생물학의 여러 측면과 관련하여 풍부한 정보 소스로 발전했습니다.

다음은 전처리, 정규화, 필터링, 클러스터링, 그리고 마지막으로 마이크로어레이 데이터의 생물학적 해석 및 분석을 가능하게 하는 가장 훌륭하고 가장 많이 사용되는 포괄적인 소프트웨어입니다. 또한 특정 유형의 분석을 위한 도구를 제공하는 특정 소프트웨어에 대해서도 설명했습니다.

유형: 무료 및 오픈 소스
유지 관리: 프레드 허친슨 암 연구 센터
운영 체제: 윈도우, 리눅스, 맥 OS X
기능: 포괄적 인

이 개방형 개발 프로젝트는 2001년에 시작되었으며 R 프로그래밍 언어를 기반으로 합니다. 이는 DNA 마이크로어레이 이미지 처리 및 데이터 분석, 서열 분석, SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 데이터 분석을 위한 통계, 그래픽 및 기타 계산 도구를 제공하는 R 패키지로 구성됩니다. Affymetrix와 같은 여러 상용 마이크로어레이 플랫폼에 맞는 특정 패키지를 사용할 수 있습니다.

유형: 무료 및 오픈 소스
에 의해 유지: 유전체연구소 및 기타 기고자
운영 체제: 윈도우, 리눅스, 맥 OS X
기능: 포괄적 인

TM4 Microarray Software Suite는 Java 및 C/C++로 개발된 다음 애플리케이션을 제공합니다.

  1. MADAM(마이크로어레이 데이터 관리자) 마이크로어레이 데이터는 물론 실험 설계, 매개변수, 프로토콜 등과 같은 관련 정보를 관리 및 저장하기 위해 개발되었습니다. 이 데이터는 MIAME(Minimal Information About a Microarray Experiment) 표준에 따라 MySQL 데이터베이스에 저장됩니다.
  2. MIDAS(마이크로어레이 데이터 분석 시스템) 얻은 데이터를 정규화하고 필터링하기 위해 개발되었습니다. 결과 출력은 MADAM 관련 데이터베이스에 .tav 형식으로 저장됩니다.
  3. 스팟파인더 유전자 발현을 정량화하기 위해 각 지점에서 신호의 신속한 이미지 처리 및 정량화를 위해 설계되었습니다.
  4. MeV(다중 실험 뷰어) 정규화 및 필터링된 마이크로어레이 데이터를 분석할 수 있습니다. 클러스터링 및 분류, 그래픽 시각화, 통계 분석 및 주석을 위한 도구를 제공합니다.
  5. AMP(자동화된 마이크로어레이 파이프라인) Affymetrix CEL 파일 형식의 마이크로어레이 데이터를 추가 분석을 위해 제출할 수 있는 웹 기반 응용 프로그램입니다. 워크플로 또는 파이프라인은 정규화 및 통계 분석에 이어 유전자 분류 및 주석을 위해 지정할 수 있습니다. AMP는 비교적 사용자 친화적이며 결과를 웹 기반 형식으로 표시하여 쉽게 저장하고 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

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유형: 무료 및 오픈 소스 및 공개 웹 서버 형태
유지 관리: 브로드 인스티튜트
운영 체제: Windows, Linux, Ubuntu, SuSE, CentOS, Mac OS 10.7 이상
기능: 포괄적 인

R 프로그래밍 언어를 사용하여 개발된 이 시스템은 사용자 친화적인 시스템이며 쉽게 정렬하고 상호 연결하여 맞춤형 파이프라인을 형성할 수 있는 여러 분석 모듈로 구성됩니다. 마이크로어레이 데이터는 유전자 발현 패턴에 대해 정규화, 전처리 및 분석, 원하는 유전자 클래스 예측, 유전자 클래스 클러스터링 및 발견, 경로 분석이 가능합니다.

유형: 무료 및 오픈 소스
유지 관리: GenMAPP.org
운영 체제:
기능: 특정한

Visual Basic 6.0, GenMAPP 또는 Gene Map Annotator 및 Pathway Profiler를 사용하여 개발된 이 제품은 신호 경로뿐 아니라 동화 및 이화 경로와 같은 생물학적 경로를 이해하고 식별하기 위한 게놈 마이크로어레이 데이터 분석을 위해 특별히 설계되었습니다.

여기에는 다음을 포함하여 선택된 모델 유기체에 대한 유전자 데이터베이스가 포함되어 있습니다. 대장균, human, mouse, zebrafish 등. 맞춤형 및 상업용 마이크로어레이에서 얻은 유전자 발현 데이터를 분석할 수 있으며, 표시된 기준에 따라 색상으로 구분된 형식을 사용하여 원하는 유전자를 경로 형태로 시각화할 수 있습니다. 사용자에 의해. 유전자 주석에 대한 이전 정보를 사용하여 경로를 구성하고 수정하는 도구를 제공합니다.

유형: 광고
에 의해 제공: 바이오디스커버리
운영 체제: 윈도우, 맥, 리눅스
기능: 포괄적 인

이것은 거의 모든 플랫폼과 마이크로어레이 유형의 데이터를 분석하기 위한 Java 기반 상용 소프트웨어입니다. Agilent 244K, 4x44K, 44K 어레이 등과 같은 표준 마이크로어레이 플랫폼을 위해 바로 사용할 수 있는 템플릿도 제공합니다.

마이크로어레이 데이터 분석은 마이크로어레이의 유형과 연구 설계에 따라 다릅니다. 편리함과 함께 마이크로어레이 데이터 분석 소프트웨어와 통계 분석 도구의 선택은 실험 조건과 정확한 목적을 신중하게 고려한 후에 이루어져야 합니다.

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검토

마이크로어레이 구조

전형적인 마이크로어레이는 유리 슬라이드의 표면에 부착된 수십 개의 뉴클레오티드(nt)인 올리고뉴클레오티드로 구성됩니다. 적절한 포토리소그래피 마스크를 사용하여 단일 염기 A, C, T 또는 G가 한 번에 부착되므로 알려진 DNA 또는 RNA의 특징적인 단편에 상보적인 수십만 개의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열로 마이크로어레이를 구성할 수 있습니다. 시퀀스. 이러한 특징적인 단편은 프로브라고 하는 세트로 배열됩니다[49]. DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 샘플은 마이크로어레이의 표면에 펼쳐져 있고 그 구성요소는 마이크로어레이에 걸쳐 여러 사본에 위치한 상보적 프로브와 특이적으로 혼성화합니다(그림  1). 주어진 프로브에 혼성화되는 물질의 양은 형광 기반 방법에 의해 결정되며, 그 관계는 선형이 아니지만 형광 강도는 샘플에서 주어진 유전자의 DNA 또는 RNA의 양을 반영한다[50]. 이 접근 방식을 통해 비교적 짧은 시간에 수천 개의 유전자 전사 수준을 정량화할 수 있습니다.

마이크로어레이 회로도. NS 주어진 유전자의 특징적인 단편에 해당하는 프로브는 어레이의 다른 위치에 배치됩니다. NS 단일 프로브는 유전자의 동일한 영역에 해당하는 세트로 배열됩니다. 프로브에 혼성화하는 DNA는 형광 리포터 시스템을 사용하여 검출할 수 있습니다. cDNA가 올바르게 혼성화하는 프로브의 수를 늘리면 이 프로브 세트 간의 대비가 증가합니다(프로브 세트 A) 및 기타 프로브 세트(프로브 세트 B)

가장 널리 사용되는 마이크로어레이는 Affymetrix 3′IVT(3′ 시험관 내 전사), 즉 HG-U133A 또는 HG-U133_Plus_2, 25 nt 서열로 구성된 11세트의 완전 일치(PM) 프로브로 조립되며, 대부분의 경우 3&# 근처에 위치한 600 nt 서열 단편 중에서 선택됩니다. x02032 특정 성적표의 끝. 마이크로어레이의 모든 PM 프로브에 대해 MM(미스매치) 프로브가 존재하며, 여기서 하나를 제외한 모든 뉴클레오티드는 해당 PM 프로브의 것과 동일하지만 원래의 13번째 뉴클레오티드는 상보적이지 않은 것으로 대체됩니다. 비록 이 개념의 유용성이 의심스럽긴 하지만 MM 프로브 뒤에 있는 근거는 비특이적 혼성화의 수준을 측정하는 것입니다[51].

HuGene 1.0ST와 같은 가장 최근 세대의 Affymetrix 마이크로어레이는 표준 PM 프로브와 유사한 프로브를 사용하여 구성되지만 3′ 말단의 비암호화 부분이 아니라 주어진 전사체의 개별 엑손에 친화력이 있습니다. 이 설계에서 MM 프로브는 다양한 시퀀스 특성의 프로브에 대한 배경 강도 수준을 평가하도록 설계된 배경 강도 프로브(BGP)로 대체됩니다. BGP는 약 1000개의 프로브 세트로, 서열에서 GC 뉴클레오티드의 비율이 가변적이며 인간 유전자 서열과 상보적이지 않습니다. 이 접근 방식은 MM 프로브와 비교하여 마이크로어레이 전반에 걸친 비특이적 혼성화를 더 잘 평가할 수 있게 하며, MM 프로브에 대한 신호는 프로브 특이적 효과로 인해 종종 PM 신호를 초과합니다[52]. 또한, 비특이적 혼성화를 평가하는 프로브의 수를 줄이면 훨씬 더 많은 수의 PM 프로브를 삽입할 수 있습니다. 새로운 세대의 전체 전사체 마이크로어레이의 프로브 세트는 엑손 및 유전자 수준의 두 가지 수준으로 구성됩니다. 엑손 프로브 세트에는 평균 4개의 프로브가 포함되어 있으며, 이는 개별 엑손에 맞게 조정된 다음 일반적으로 약 25개의 그룹으로 클러스터링되어 개별 유전자에 대한 세트를 생성합니다. 이 접근 방식을 사용하여 개별적으로 접합된 성적표의 수준을 결정할 수 있습니다.

또 다른 인기 있는 시스템은 60 nt 길이의 상당히 긴 프로브를 사용할 수 있는 SurePrint 기술을 사용하여 구축된 Agilent 마이크로어레이 플랫폼입니다. 프로브는 Affymetrix 시스템보다 길지만 유전자당 프로브 수는 상당히 낮아 가장 비싼 엑손 마이크로어레이 세트에서 평균 8개(2 ×� k) 또는 가장 저렴한 플랫폼( 8 ×� k). Agilent 프로브가 Affymetrix 마이크로어레이의 프로브보다 길기 때문에 시스템이 보다 특이적인 경향이 있어 이는 분명한 이점이지만, 다른 한편으로는 유전자당 프로브 수가 적기 때문에 Agilent 마이크로어레이는 단일 뉴클레오티드 변형에 더 민감합니다. 후자는 증폭 오류로 인한 경우 신호에 영향을 미치지 않아야 하지만[53], 분석된 샘플의 특징적인 특징으로 인한 발현 추정에 영향을 미칠 수 있습니다. Affymetrix 마이크로어레이 시스템의 경우 이러한 오류 소스는 전사체 또는 전사체 특정 프로브 세트에 대한 개별 프로브의 신호에만 영향을 미치기 때문에 사소한 영향만 미칩니다. 단일 염기 다형성은 혼성화를 차단하지 않지만 효율성을 낮추는데, 이는 유전자 발현의 현저한 감소로 해석될 수 있으며, 이는 불일치 프로브를 사용하여 비특이적 혼성화 수준을 추정하거나 대립형질 빈도를 평가하는 데 사용되는 기능입니다[54, 55]. SNP 마이크로어레이 사용[56]. Affymetrix 시스템에서는 염기서열 데이터베이스의 부정확한 데이터를 기반으로 할 수 있는 잘못 설계된 프로브의 신호가 유전자 발현 추정치의 정확도를 크게 감소시키지 않으면서 추가 분석에서 쉽게 제거할 수 있습니다[41]. 반면 Agilent 시스템에서는 동일한 설계 결함이 유전자 발현 수준 평가에 상당한 어려움을 야기할 수 있습니다.

마이크로어레이는 수천 개의 유전자에 대한 발현 데이터를 제공하지만 플랫폼 차이는 마이크로어레이의 낮은 정확도에 기여하고 이러한 이유로 연구된 실험 조건에서 잠재적으로 중요한 유전자를 식별하는 데에만 사용됩니다. 이러한 중요하다고 생각되는 유전자의 발현 수준에 대한 정확한 평가는 대규모 분석에 적합하지 않은 실시간 PCR(중합효소 연쇄 반응)과 같은 보다 정확한 방법을 사용하는 추가 연구가 필요합니다. 그러나 마이크로어레이 프로토콜의 일부 단계는 유효성 검사 방법에서 공유되어 유사한 방식으로 데이터 품질에 영향을 미칩니다.

마이크로어레이 실험의 생물학적 배경

마이크로어레이 실험은 각 개별 단계의 정확도가 유전자 발현 추정에 영향을 미칠 수 있는 다단계 프로세스입니다. 각 단계에 대한 정확한 이해는 실험자뿐만 아니라 데이터 전처리를 수행하는 사람에게도 매우 중요합니다. 실험 중 발생하는 실수를 피하기 위해 Fig.  2 와 같이 다양한 단계를 거쳐 그 정확도와 생물학적 물질의 상태를 조절한다. 마이크로어레이 실험에 사용된 절차는 여러 플랫폼에서 매우 유사하므로 단순화를 위해 다음 설명은 Affymetrix 마이크로어레이에 사용된 절차를 기반으로 합니다.

마이크로어레이 실험의 개별 단계. 샘플 mRNA를 분리한 후(1) cDNA(상보적 DNA, 단계) 사슬의 합성이 올리고(dT) 프라이머의 추가로 시작되고(2) cDNA가 증폭되어 cRNA(상보적 RNA)가 생성되고 비오틴(3)으로 표지됩니다. ) 및 나중에 조각화됩니다(4). 이러한 준비 후 샘플 cRNA는 마이크로어레이 프로브(5)와 혼성화할 준비가 되어 있고 최종 염색 과정(6)이 준비됩니다.

단계 I: RNA 분리

첫 번째 단계에서 RNA는 세포에서 분리되고 그 농도와 분해 정도는 분광광도계(양)와 생물분석기(품질)를 사용하여 제어됩니다. 고품질 RNA 시료에서 ribosomal RNA(rRNA)는 전체 RNA의 80 % 이상을 차지하며, 세균학 및 계통발생학 이외의 분야에서 연구 대상이 거의 없음에도 불구하고 그 농도는 좋은 지표입니다. 실험 전후의 전체 RNA 품질. 혼성화 전에 RNA 분해 정도는 RNA 전기영동이나 RNA 무결성 번호(RIN)를 벤치마크로 사용하는 생물분석기로 평가할 수 있습니다[57]. Fig.  3은 agarose gel에서 전기영동을 하여 만든 이미지의 예를 보여주고 있다. 처음 두 레인은 분리 직후 RNA를 보여줍니다. 2개의 가장 구별되는 밴드는 18 및 28S rRNA에 해당하며 이들 밴드가 없으면 RNA가 고도로 분해되었음을 나타냅니다[58].

마이크로어레이 실험의 다양한 단계에서 얻은 생성물의 전기영동 분석. 레인 1 및 2, 분리된 RNA 3 및 4, 정제된 cRNA 5 및 6, 단편화된 cRNA(이미지 제공: Herok R. - 미공개 데이터)

RNA 품질은 또한 특정 하우스키핑 유전자(그룹 1) 또는 rRNA(그룹 2)를 표적으로 하도록 설계된 특정 그룹의 대조군 프로브 세트(표  1 참조)의 결과를 분석하여 실험 후에 평가할 수 있습니다. 그러나 다른 프로브 세트와 마찬가지로 단일 표현 강도는 임의의 단위로 표현되는 값이 샘플의 특성[59], 실험 조건, 예를 들어 실험실의 오존 수준[59]에 따라 달라지기 때문에 정보가 되지 않습니다. 60], 그리고 사용된 데이터 전처리 방법[61]. 이러한 이유로 단일 발현 강도에만 기반한 임의의 기준은 일반적으로 비효율적이며 어레이 간 또는 프로브 세트 간의 비교가 필요합니다.

1 번 테이블

전형적인 Affymetrix 3’IVT 마이크로어레이에서 발견된 참조 유전자. 증폭 및 혼성화 제어 RNA는 마지막 열에 표시된 대로 다양한 비율과 양으로 추가됩니다. 증폭 제어 전사체는 연구 RNA 샘플에서 6,667개당 1개에서 100,000개 전사체에 이르는 추정된 카피 수를 초래하는 다양한 희석을 사용하여 추가됩니다. 하이브리드화 제어는 1.5~100pM 범위의 최종 농도를 초래하는 다양한 양으로 첨가된 비오틴화 및 단편화된 cRNA로 구성됩니다.

그룹유형이름설명
1가사도우미 유전자AFFX-HSAC07/ <"유형":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"X00351","term_id":"28251","term_text":"X00351">> X00351ACTB - 세포 구조를 담당하는 β-액틴 유전자
AFFX-HUMGAPDH/ <"유형":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"M33197","term_id":"182976","term_text":"M33197">> M33197해당과정에 참여하는 GAPDH – 효소
AFFX-HUMISGF3A/ <"유형":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"M97935","term_id":"2281070","term_text":"M97935">> M97935STAT1 – 전사 인자
2리보솜 RNAAFFX-HUMRGE/ <"유형":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"M10098","term_id":"337376","term_text":"M10098">> M1009818S rRNA 소단위를 코딩하는 유전자
AFFX- <"유형":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"M27830","term_id":"337384","term_text":"M27830">> M2783028S rRNA 서브유닛을 코딩하는 유전자
AFFX-r2-Hs18SrRNA18S rRNA 서브유닛에 대한 유전자 코딩 - 버전 2
AFFX-r2-Hs28SrRNA28S rRNA 서브유닛에 대한 유전자 코딩 - 버전 2
3증폭 제어(Poly-A 스파이크)AFFX-DapX / AFFX-r2-Bs-dap의 Dap 유전자 B.서브틸리스 박테리아 - 비율 1:6,667
AFFX-ThrX / AFFX-r2-Bs-thr의 유전자 B.서브틸리스 박테리아 - 비율 1:25,000
AFFX-PheX / AFFX-r2-Bs-phe의 유전자 B.서브틸리스 박테리아 - 비율 1:50:000
AFFX-LysX / AFFX-r2-Bs-lys의 Lys 유전자 B.서브틸리스 박테리아 - 비율 1:100,000
4혼성화 제어(세균 스파이크)AFFX-BioB / AFFX-r2-Ec-bioBBioB 유전자 대장균 박테리아 – 수량 1.5 pM
AFFX-BioC / AFFX-r2-Ec-bioCBioC 유전자 대장균 박테리아 – 수량 5 오후
AFFX-BioDn / AFFX-r2-Ec-bioDBioD 유전자 대장균 박테리아 – 수량 25 pM
AFFX-CreX / AFFX-r2-P1-creP1 박테리오파지 – 양 100 pM의 Cre 유전자

각각의 대조 프로브 세트는 선택된 전사체의 다른 영역(중앙 부분과 3′-및 5′-말단)을 대상으로 하는 세 가지 변이체로 존재합니다. 이를 통해 3′/5′ 프로브 세트 신호 비율을 검사하여 개별 전사체의 분해 속도를 평가할 수 있습니다. 이는 제조업체가 정의한 임계값과 비교할 수 있으며 다른 마이크로어레이에 대해 얻은 비율을 비교하여 균질성을 평가할 수 있습니다. 개별 샘플에 대한 분해 수준. 실험 후 RNA 분해의 평가를 돕기 위해 RNA 분해 플롯[62] 또는 개별 프로브 및 전사 특성에 기반한 혼합 효과 모델[63]을 포함하는 보다 복잡한 방법이 개발되었습니다.

단계 II: cDNA 합성

이 단계의 시작 부분에서 외부 RNA 제어(ERC)가 추가되어 입력 물질의 부피 및 상태와 독립적으로 cDNA 합성의 제어 역할을 합니다. 이 목적을 위해 알려진 인간 유전자와 상동성이 없는 박테리아 RNA(소위 폴리-A 스파이크)가 사용됩니다. 그 후, cDNA 합성 과정은 oligo-dT(짧은 deoxy-thymine 염기서열을 가진 프라이머) 또는 random primer를 사용하여 수행됩니다. Oligo-dT는 mRNA의 poly-A 꼬리에 결합하여 역전사 과정에서 상보적 가닥의 합성을 시작합니다(Fig.  4). 이 과정은 mRNA 분자와 달리 poly-A 꼬리가 없기 때문에 rRNA 분자에는 작동하지 않으며 이러한 이유로 이 과정 전에 rRNA를 제거할 필요가 없습니다. 그러나 어떤 경우에는 rRNA가 인간 세포에서 폴리아데닐화될 수 있으며[64], 역으로 모든 mRNA가 폴리-A 꼬리를 가지는 것은 아니며, mRNA가 폴리아데닐화된 것과 폴리아데닐화되지 않은 두 가지 형태로 존재한다는 보고도 있습니다[65]. .

상용 T7-올리고(dT) 프라이머를 기반으로 하는 cDNA 합성. 화살표는 합성 방향을 나타내고, 빨간색 글꼴은 증폭에 사용된 프로모터 서열을 나타냅니다. 녹색 영역은 프라이머와 (T)를 분리하는 시퀀스 스페이서입니다.24 주제

cDNA의 두 번째 가닥은 첫 번째 가닥을 주형으로 사용하여 생성됩니다. 리보뉴클레아제의 첨가는 비특이적 부위에서 RNA 절단을 일으켜 cDNA에 부착된 짧은 단편만을 남깁니다(그림  2). 그런 다음 이 단편은 cDNA의 두 번째 가닥을 합성하는 중합효소의 프라이머로 사용되어 도중에 발견된 나머지 mRNA 단편을 제거합니다. 다양한 샘플에 걸쳐 표준화할 수 있는 cDNA 농도 측정은 추가 cDNA 정제가 필요한 분광광도 측정에 영향을 미치는 다른 핵산 종의 존재로 인해 진핵 세포에 대한 표준 실험 절차의 일부가 아닙니다. 이 단계는 (5′-말단에서) 절단된 mRNA의 생성으로 이어지는 이전의 RNA 분해에 의해 크게 영향을 받습니다[66]. cDNA 합성 중에 oligo-dT 프라이머를 사용하는 경우 이러한 절단된 mRNA는 3′-말단에서 절단 위치까지만 판독되고 나머지 부분은 폴리-A의 부족으로 인해 손실됩니다. 이러한 상황에서 3′-end에서 더 멀리 위치한 프로브는 일반적으로 낮은 신호 강도를 나타내며, 이는 mRNA 품질을 평가하는 데 사용되는 RNA 분해 플롯의 기초가 되는 현상입니다[62]. 이 효과를 줄이기 위해 3′IVT 마이크로어레이에서 단일 세트의 프로브는 mRNA의 3′-말단에 가까운 600਋p의 매우 작은 영역을 기반으로 선택됩니다. 이러한 편향을 더욱 줄이기 위해 신호 강도를 수정하기 위해 프로브가 목표로 하는 영역의 위치를 ​​고려하는 정교한 방법이 개발되었습니다[67, 68].

3′-end bias는 cDNA 합성에 random primer를 사용하는 경우 발생하지 않습니다. Random primer는 3′-end 뿐만 아니라 mRNA의 어느 부위에도 붙을 수 있기 때문에 poly-A tail이 필요하지 않으며, 3′ ➔ 5′ 방향으로 합성을 촉진하고 매우 강력합니다. 5′-end bias는 ref와 같이 관찰될 수 있습니다. [69].

사용 가능한 많은 cDNA 합성 키트에는 oligo-dT와 무작위 프라이머의 조합이 포함되어 있지만 oligo-dT에만 기반한 키트는 특히 3′-UTR 서열이 가장 중요한 3′-IVT 플랫폼에 일반적으로 사용됩니다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 표적이 되기 때문입니다.

올리고-dT 기반 cRNA 합성은 마이크로어레이 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있는 추가 편향을 도입합니다. 우선 mRNA 분해 문제 때문에 oligo-dT 프라이머는 관심 영역이 3′-UTR 부근에 위치하는 경우에만 좋은 선택입니다. -A는 표현 수준 추정의 정밀도를 감소시킬 수 있습니다[70]. 개별 엑손이 분석되는 WT(전체 전사) 마이크로어레이 플랫폼의 경우와 같이 분석에 전체 전사가 필요한 경우 무작위 프라이머가 필요합니다. 또한, oligo-dT는 전사체의 폴리-A 꼬리에만 결합하는 것으로 가정되며, 그림  2 에서 보는 바와 같이 A 뉴클레오티드의 긴 연속 가닥이 필요합니다. 그러나 부분 프라이머 상보성(즉, 프라이머 서열에서 단 8개의 아데닌 뉴클레오티드의 상보성)은 반응 개시에 충분하며 부착의 무작위 특성으로 인해 UTR에서 일반적으로 발견되는 A-가닥에도 결합할 수 있습니다. [71]. 또한, 올리고-dT의 농도가 증가함에 따라 다중 올리고뉴클레오티드를 단일 mRNA에 부착할 가능성이 증가합니다. 이러한 상황에서 합성은 두 개의 별개 영역에서 시작될 수 있지만 3′-말단에 더 가까운 반응은 두 번째 반응에 의해 차단되어 다시 잘린 cDNA 생성물을 생성할 수 있습니다[71]. 따라서 이 현상은 해당 서열이 주로 A 뉴클레오티드로 구성된 단순 반복을 포함하는 경우 표적 전사체의 전체 프로브 세트 신호 강도에 영향을 미칠 수 있습니다.

단계 III: 증폭 및 라벨링

이 단계에서 새로 합성된 cDNA는 다음과 같은 과정에서 복제(증폭)됩니다. 시험관 내 전사. 이 단계의 목표는 후속 단계에서 요구되는 비오틴화된 C 및 U 뉴클레오티드를 포함하는 다량의 cRNA를 얻는 것입니다[58]. 이 목적을 위해 T7 박테리오파지 중합효소의 프로모터 역할을 하는 oligo-dT의 또 다른 단편이 사용됩니다.

이 반응의 효율성과 샘플 간의 일관성은 최종 실험 결과에 결정적인 영향을 미칩니다[72]. GC 함량에 따라 중합효소[73]의 효율성에 영향을 미치고 이차 구조[74]를 형성할 수 있는 cDNA 자체의 구조적 특성을 포함하여 이 반응의 효율성에 영향을 미치는 많은 요인이 있습니다. 이 단계는 샘플의 총 반응 수율 및 순도를 제어할 수 있는 cRNA의 정제 및 정량화로 완료됩니다. 증폭 반응의 산물은 전기 영동 겔의 레인 3과 4에서 관찰할 수 있습니다(Fig.  3 ). rRNA는 더 이상 보이지 않으며 cRNA의 길이가 다양하기 때문에 젤에서 쉽게 구별할 수 있는 밴드가 없습니다.

cRNA 수준 변화의 실험 후 제어는 cDNA 합성 전에 추가된 참조 RNA(폴리-A 스파이크)를 표적으로 하는 프로브의 신호 및 모든 샘플에서 유사한 수준에 있어야 하는 하우스키핑 유전자의 신호를 활용합니다. 폴리-A 스파이크는 5개의 전사체를 포함합니다. B. 서브틸리스 분리된 RNA에 다양한 비율로 추가되는 유전자(Dap, Lys, Phe, Thr 및 Trp). 그것들은 모두 poly-A 꼬리를 포함하기 때문에 조건과 무관하게 분석된 RNA와 동일한 절차를 거칩니다. 마이크로어레이의 민감도 수준에 가까운 최저 농도(전체 RNA의 1:100,000)로 Lys 유전자 RNA를 첨가합니다. 주어진 실험의 마이크로어레이의 적어도 절반에서 검출은 적절하게 수행된 절차의 좋은 지표입니다. 나머지 참조 RNA는 농도를 증가시키면서 추가됩니다. Lys < Phe < Thr <�p이 가장 높고 포화 수준이 Dap인 프로브에 가깝습니다.

증폭 산물에는 더 이상 T7 프로모터가 없지만 프로모터와 (T) 사이의 스페이서 서열이 있습니다.24 프라이머(그림  3에서 녹색)도 증폭됩니다[75]. 이 단편은 각 cRNA와 함께 복제되기 때문에 그 양이 매우 많고, 유사한 서열을 갖는 프로브에 결합할 수 있기 때문에 신호 강도에 영향을 미칠 수 있다[69]. 증폭 과정은 실험 조건과 전사 구조에 크게 의존하기 때문에 샘플 간의 불일치 신호의 원인이 될 수 있으며 [74, 76] 필요하지 않은 마이크로어레이 프로토콜 개발의 주요 동기가 됩니다. RNA 증폭 [77].

IV 및 V 단계: cRNA 단편화 및 혼성화

이전 단계에서 얻은 cRNA는 전기영동 겔의 5번째 레인과 6번째 레인에 표시된 50� nt 단편으로 절단됩니다(Fig.ਃ). 그 후, P1 박테리오파지 및 대장균 박테리아(박테리아 스파이크라고 함)가 RNA 풀에 추가됩니다. 폴리-A 스파이크와 유사하게, 박테리아 RNA는 다음 관계를 만족하는 다양한 농도로 추가됩니다. BioB, bioC 및 bioD는 대장균 비오틴 합성에 사용되는 유전자인 반면 Cre는 유전자 산물이 재조합효소로 작용하는 P1 박테리오파지에서 분리됩니다[78]. 이 박테리아 스파이크는 이미 cRNA로 전환되고 단편화되어 cRNA를 얻기 위한 이전 단계에서 사용된 표지 및 증폭의 효율성과 독립적으로 혼성화 과정을 제어할 수 있습니다[58]. 그 후 다양한 cRNA의 혼합물이 마이크로어레이 칩으로 옮겨져 혼성화 과정이 시작됩니다.

하이브리드화는 전체 마이크로어레이 절차 중 가장 시간이 많이 걸리는 단계입니다. 마이크로어레이가 45 ଌ로 설정된 하이브리드 오븐에서 배양되는 약 16 h 동안, cRNA는 마이크로어레이 칩의 유리 표면에 부착된 특정 프로브에 결합합니다. 혼성화 과정의 역학은 증폭 단계에서와 같이 실험 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있는 개별 cRNA 분자의 반응 조건과 구조적 특성 모두에 의존하는 많은 요인에 의존합니다[79, 80]. 장기간 혼성화하면 샘플이 건조되고 칩 표면에 재료가 고르지 않게 분포될 수 있습니다. 또한 일부 물의 증발은 완충액의 염 농도를 변화시키고 공정의 효율성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다[81].

하이브리드화 단계 전에 추가된 박테리아 스파이크의 주요 목적은 전체 마이크로어레이 성능을 평가하여 모든 샘플에 걸쳐 하이브리드화 조건의 일관성을 제어하는 ​​것입니다[82]. 실험 절차의 결함은 발현 강도 범위의 변화 또는 개별 bioB, bioC, bioD 및 Cre 전사체 간의 관계를 유발하지만, 혼성화 과정의 결함은 다른 전사체에도 영향을 미친다는 것을 기억해야 합니다. 이러한 이유로 혼성화 불일치는 폴리-A 스파이크 제어를 포함하여 다른 cRNA를 표적으로 하는 프로브 세트에서도 볼 수 있어야 합니다. 변이가 박테리아 스파이크에만 존재하는 경우 문제는 준비의 부정확성 또는 사전 하이브리드화된 cRNA의 농도에서 비롯될 가능성이 큽니다. 하우스키핑 유전자, 폴리-A 및 박테리아 스파이크 제어에 대한 모든 가능한 시나리오는 표  2에 요약되어 있습니다.

표 2

다른 제어 프로브 세트에 의해 감지된 문제 및 가능한 원인

가사도우미 유전자폴리 A스파이크박테리아 스파이크가능한 이유
오류좋아요좋아요분석된 mRNA의 열악한 품질
오류오류좋아요증폭/라벨링 중 문제
오류오류오류교잡/세척 중 문제
좋아요좋아요오류세균 스파이크의 부정확한 준비
좋아요오류좋아요세균성 poly-A 스파이크의 부정확한 준비

다른 가능한 오류 조합은 실제로 거의 발생하지 않습니다.

Bacterial spike controls are a good indicator of problems that may occur during the hybridization procedure, although they fail to detect uneven hybridization, since the probe-set intensity is obtained after summarizing signals of over 20 individual probes, spread over the entire surface of the microarray (3′IVT arrays) or located in a small region at the middle of the array (WT arrays). For this purpose the quality control of each sample should include the analysis of an image of the microarray surface, which is either a complete scan saved in a DAT file, or more commonly a recreated image based on the individual probe intensities stored in a CEL file [83, 84].

The main assumption made in design of a microarray is that probes targeting a single transcript are placed randomly on its surface. For this reason, variations in the signal intensity of specific regions suggest reasons other than the biological variation between the analyzed mRNAs. Such differences among regions, termed image artifacts, are mostly caused by bubbles of air or small levels of impurities, which were added into the microarray cartridge with the experimental solutions [85]. Such artifacts appear very commonly, although they usually have a very small size and are handled efficiently by summarization methods, which are insensitive to a small number of outlying values. The main problem occurs when the artifact covers a significant percentage of the array surface or its intensity is extremely high and close to the saturation level of the probes. Such artifacts are mainly caused by uneven hybridization and affect not only the expression estimates from probes located in its region, but also the remaining probe signals. This latter effect is due to data processing, which utilizes expression levels of all or of a significant fraction of the probes on the microarray [38].

Microarray surface artifacts can be visualized by either creating an image, based on single probe expression intensities in a convenient (usually logarithmic) scale, or by analyzing differential images created by subtracting the signal of each probe on a single microarray from that on another reference array created by, for example, calculating the median intensity level of each probe across all microarrays in a single experiment [37]. If a defective array is found, probes affected by an aberration may be separated and removed from the subsequent data analysis or even recreated using imputation techniques [38, 37, 85, 86]. Microarrays affected by a very large aberration should be removed from the study, as they no longer serve as a reliable source of information.

Step VI: Washing and staining

Washing follows the cRNA hybridization and is used to remove cRNA non-specifically bound to the microarray surface. Again, in this step small variations in the reaction conditions may affect the expression estimates [87]. Depending on the conditions of the washing process (temperature, salt concentration, calcium and magnesium ion levels in the buffer) non-specifically bound cRNA is removed with varying efficiency, affecting the sensitivity and background level of the entire microarray. The binding strength of cRNAs depends not only on their complementarity level but also on the temperature of the hybridization and their sequence characteristics, mainly the GC content [88] and specific base positions inside the sequence [44]. Separation between the binding strength of non-specifically bound GC-rich cRNA and GC-poor cRNA with perfect complementarity is not very sharp, affecting the final intensity level of cRNAs depending on their sequence characteristics [50], which can be only reduced using sequence-based normalization approaches during the data pre-processing step [89, 90].

The washing process is followed by staining of the hybridized cRNA using a streptavidin-phycoerythrin complex (Fig.  2 ). Streptavidin is a protein with high binding affinity to the biotinylated nucleotides used in the cRNA preparation, while phycoerythrin is a fluorescent dye used for quantitation of the hybridized cRNA. The quality of the fluorophore used significantly affects the fluorescence intensity of the microarray, decreasing its sensitivity if it is exposed for too long to daylight [91].

Step VII: Scanning

In this step the microarray cartridge is placed in the microarray scanner where the fluorescence of the phycoerythrin bound to the cRNA is excited using a laser. The level of fluorescence is measured by the scanner’s detector and is assumed to be proportional to the amount of cRNA bound to the corresponding probe. The length of this process depends on the size of the microarray and in most cases lasts around 10 min for a single array. During the scanning process all arrays are placed inside the scanner’s chamber so that the fluorescence intensity is not affected by differences in the length of exposure to daylight, which could increase the differences among microarrays in both the scale of the measurements and the sensitivity level. It is advised to scan each microarray only once, since each subsequent scan decreases the fluorescence intensity by 10� %, due to decay of the fluorophore [92]. The fluorescence intensity of cyanine-based dyes also used in microarray experiments, such as Cy5, can be further affected by the ozone concentration in the laboratory, a factor which is both time- and location-dependent, and can become a major source of among-experiment inconsistencies [60, 93].

Step VIII: Data pre-processing

The last stage involves data pre-processing which starts by analyzing the microarray image stored in the DAT file, whose goal is to obtain single fluorescence intensity for each probe based on the 16 pixels of the original microarray image. This step is performed by the Affymetrix software and returns a CEL file as an output, in which each probe, at a specific position on the microarray, has a signal intensity assigned to it. These individual probe intensities are used in the subsequent preprocessing steps, during which each array is standardized by first estimating and then subtracting the background signal in order to reduce the effect of non-specific hybridization [44]. Following step is to perform normalization procedure which reduces the differences in probe intensities that originate from differences in experimental conditions and cRNA concentration [31, 94]. The final step of pre-processing is the summarization, in which a single expression estimate is calculated for each probe-set based on the intensity of the individual probe signals [95]. Summarization step is highly dependent on the quality of the probe and probeset definitions which are in many cases low due to inaccurate transcriptome data at the time of microarray design. This can result in probesets targeting transcripts of multiple genes due to low probe specificity, probes that do not map any of the known transcripts [41, 42] or multiple probesets that map the same gene [39, 40], requiring the development of methods used for the validation of existing probes and for probeset redefinition [41, 42, 96].

Selection of the pre-processing strategy can have a very large impact on the experimental outcomes [94] and often requires a few assumptions which are not always acceptable. The main assumption made by pre-processing methods is that the total level of mRNA in the cell does not vary significantly among samples, regardless of the experimental conditions and cell lines used. This assumption is required for the standardization approaches based on mean and median scaling or more complex approaches, such as quantile normalization [31], and its natural consequence is that the amount of differentially-expressed features with increased or decreased levels will be always similar. For example, in the case of global transcript level changes in cells with inhibited transcription, one might expect to detect predominantly transcript down-regulation, whereas after applying quantile normalization it is very probable that a significant number of up-regulated transcripts will be observed, due to intensity distribution transformations.

Another important assumption is forced by the massively parallel experimentation of the microarray technique which allows for assessing expression level of thousands of genes simultaneously. We have to assume that the reaction conditions for each individual gene were similar while knowing that due to various molecular properties of the analyzed RNA/DNA fragments it is impossible to properly optimize each of the individual reactions. Most of the data processing methods make this assumption although some standardization methods also exist that utilize probe and RNA/DNA sequence information in order to reduce the signal differences resulting from sub-optimal amplification and hybridization conditions that affect gene expression estimates to a varying degree [89, 90].


Advanced Analysis of Gene Expression Microarray Data

This book focuses on the development and application of the latest advanced data mining, machine learning, and visualization techniques for the identification of interesting, significant, and novel patterns in gene expression microarray data.

Biomedical researchers will find this book invaluable for learning the cutting-edge methods for analyzing gene expression microarray data. Specifically, the coverage includes the following state-of-the-art methods:

• Gene-based analysis: the latest novel clustering algorithms to identify co-expressed genes and coherent patterns in gene expression microarray data sets

• Sample-based analysis: supervised and unsupervised methods for the reduction of the gene dimensionality to select significant genes. A series of approaches to disease classification and discovery are also described

• Pattern-based analysis: methods for ascertaining the relationship between (subsets of) genes and (subsets of) samples. Various novel pattern-based clustering algorithms to find the coherent patterns embedded in the sub-attribute spaces are discussed

• Visualization tools: various methods for gene expression data visualization. The visualization process is intended to transform the gene expression data set from high-dimensional space into a more easily understood two- or three-dimensional space.


저자 소개

Dr. Ujjwal Maulik is Professor of Computer Science and Engineering at Jadavpur University (India). He is the editor or author of five books and coauthor of more than 150 articles. Dr. Maulik is a Senior Member of IEEE and also a Humboldt Fellow.

Dr. Sanghamitra Bandyopadhyay is Professor at the Indian Statistical Institute. She is the editor or author of six books and coauthor of more than 180 articles. Dr. Bandyopadhyay is a Senior Member of IEEE and also a Humboldt Fellow.

Dr. Jason T. L. Wang?is a Professor and Director of the Data and Knowledge Engineering Lab at the New Jersey Institute of Technology. He is the editor or author of six books and?Executive Editor of the World Scientific Book Series on Science, Engineering, and Biology Informatics.


Types of Microarrays

Depending upon the kind of immobilized sample used construct arrays and the information fetched, the Microarray experiments can be categorized in three ways:

1. Microarray Expression Analysis: In this experimental setup, the cDNA derived from the mRNA of known genes is immobilized. The sample has genes from both the normal as well as the diseased tissues. Spots with more intensity are obtained for diseased tissue gene if the gene is over expressed in the diseased condition. This expression pattern is then compared to the expression pattern of a gene responsible for a disease.

2. Microarray for Mutation Analysis: For this analysis, the researchers use gDNA. The genes might differ from each other by as less as a single nucleotide base.

A single base difference between two sequences is known as Single Nucleotide Polymorphism (SNP) and detecting them is known as SNP detection.

3. Comparative Genomic Hybridization: It is used for the identification in the increase or decrease of the important chromosomal fragments harboring genes involved in a disease.


Table of contents (17 chapters)

Normalization of Affymetrix miRNA Microarrays for the Analysis of Cancer Samples

Methods and Techniques for miRNA Data Analysis

Cristiano, Francesca (et al.)

Bioinformatics and Microarray Data Analysis on the Cloud

Classification and Clustering on Microarray Data for Gene Functional Prediction Using R

Kleine, Liliana López (et al.)

Querying Co-regulated Genes on Diverse Gene Expression Datasets Via Biclustering

MetaMirClust: Discovery and Exploration of Evolutionarily Conserved miRNA Clusters

Analysis of Gene Expression Patterns Using Biclustering

Using Semantic Similarities and csbl.go for Analyzing Microarray Data

Ontology-Based Analysis of Microarray Data

Integrated Analysis of Transcriptomic and Proteomic Datasets Reveals Information on Protein Expressivity and Factors Affecting Translational Efficiency

Integrating Microarray Data and GRNs

Biological Network Inference from Microarray Data, Current Solutions, and Assessments

A Protocol to Collect Specific Mouse Skeletal Muscles for Metabolomics Studies

Functional Analysis of microRNA in Multiple Myeloma

Martino, Maria Teresa, Ph.D. (et al.)

Microarray Analysis in Glioblastomas

Analysis of microRNA Microarrays in Cardiogenesis

Erratum to: Classification and Clustering on Microarray Data for Gene Functional Prediction Using R


Material on the analysis of (micro)array data - Biology

Book Title :Microarray Data Analysis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology)

In this new volume, renowned authors contribute fascinating, cuttingedge insights into microarray data analysis. This innovative book includes indepth presentations of genomic signal processing, artificial neural network use for microarray data analysis, signal processing and design of microarray time series experiments, application of regression methods, gene expression profiles and prognostic markers for primary breast cancer, and factors affecting the crosscorrelation of gene expression profiles. Also detailed are use of tiling arrays for large genome analysis, comparative genomic hybridization data on cDNA microarrays, integrated highresolution genomewide analysis of gene dosage and gene expression in human brain tumors, gene and MeSH ontology, and survival prediction in follicular lymphoma using tissue microarrays.

Author(s) :Michael J. Korenberg (2007)

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ProtoArray Prospector Software v5.2.3

ProtoArray Prospector v5.2.3 generates a list of positive interactions between the probe of interest and the immobilized proteins on the array. Beginning with data from either GenePix image quantification software or in 4-column, tab-delimited format, ProtoArray Prospector v5.2.3 provides rapid analysis of single and multiple microarray results generated in Protein-Protein Interaction, Kinsase Substrate Identification, Ubiquitin Ligase Substrate Identification, Small Molecule Profiling, or Immune Response Biomarker Profiling assays.

ProtoArray Prospector is available free of charge with the purchase of ProtoArray Protein Microarray Products.


리뷰

Praise for the First Edition
The book by Draghici is an excellent choice to be used as a textbook for a graduate-level bioinformatics course. This well-written book with two accompanying CD-ROMs will create much-needed enthusiasm among statisticians.
— Journal of Statistical Computation and Simulation , Vol. 74

I really like Draghici's book. As the author explains in the Preface, the book is intended to serve both the statistician who knows very little about DNA microarrays and the biologist who has no expertise in data analysis. The author lays out a study plan for the statistician that excludes 5 of the 17 chapters (4-8). These chapters present the basics of statistical distributions, estimation, hypothesis testing, ANOVA, and experimental design. What that leaves for the statistician is the three-chapter primer on microarrays and image processing, plus all of the data analysis tools specific to the microarray situation. … it includes two CDs with trial versions of several specialised software packages. Anyone who uses microarray data should certainly own a copy.
— Technometrics , Vol. 47, No. 1, February 2005


비디오 보기: hello C (팔월 2022).