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대장균의 재조합 단백질 분획

대장균의 재조합 단백질 분획



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단백질이 T7 프로모터 하에서 E. coli에서 이종적으로 발현된다면, 세포 내 총 단백질 농도의 몇 분율이 이종성으로 발현되는 단백질인가? 최대 농도는 얼마입니까? 그것은 단백질의 크기에 크게 의존합니까, 아니면 저/고 발현에 대한 특정 크기 임계값이 있습니까?


Miroux와 Walker(1996) 대장균의 단백질 과잉 생산: 높은 수준에서 일부 막 단백질과 구형 단백질의 합성을 허용하는 돌연변이 숙주. J Mol Biol. 260: 289-298

저자들은 세포에서 막 단백질을 과발현하는 문제에 대해 보고합니다. 대장균 T7(pET) 시스템을 사용합니다. 그들은 부모 균주인 BL21(DE3)과 비교하여 개선된 수준의 발현을 나타내는 돌연변이 균주를 분리합니다. 표 1에는 대조군으로 GFP를 포함하여 17개 단백질의 발현 수준이 나와 있습니다. GFP는 37 mg/L 수준에서 가용성 및 봉입체 단백질의 조합으로 발견되었습니다.-1 BL21(DE3) 및 140mg/L-1 돌연변이 균주(C41(DE3)) 중 하나에서. 그들이 관찰한 최고 발현 수준은 300mg/L였습니다.-1 소 OSCP용.

불행히도 저자는 분석한 배양물의 총 단백질 함량이나 세포 밀도를 기록하지 않습니다.

배양물이 10e9 세포 mL라고 가정해 봅시다.-1 = 10e12 셀 L-1.

이 출처(Neidhardt F.C. Escherichia coli 및 Salmonella: Cellular and Molecular Biology. Vol 1. pp. 14, ASM Press 1996 인용)에 따르면, 대장균 셀은 2.8e-13g입니다.

일반적으로 인정되는 단백질의 건조 중량 비율 대장균 = 0.55

이 숫자에서 1540mg 단백질 L 값을 계산합니다.-1. 위에서 설명한 세 가지 단백질 발현 수준의 경우 이는 다음을 의미합니다.

BL21(DE3)의 GFP = 2.4%

C41(DE3)의 GFP = 9.6%

C41(DE3)의 소 OSCP = 19.4%

나는 (이 숫자와 개인적인 경험에서) 과발현 수준이 매우 다양하고 균주 및 단백질 의존적일 것이라고 결론지었습니다. 1-20% 총 세포 단백질 범위의 값이 예상될 수 있습니다.


이 연구에서 활성 단백질 분자의 높은 회수율을 위해서는 가용화 및 재접힘 부분이 고정밀이어야 한다는 것이 분명합니다. 봉입체는 재조합 단백질의 폴리펩타이드로 구성됩니다. 그것들은 비활성 2차 &ndashlike 구조입니다. 따라서 단백질의 분리 및 정제가 간단합니다. 펼쳐진 단백질의 활성은 온화한 가용화 조건을 사용하여 가져올 수 있습니다. 이는 높은 카오트로픽제를 사용한 용해도에 비해 생체 활성 단백질의 높은 회수율에 도움이 될 것입니다.

봉입체로부터 재조합 단백질을 생산하기 위해 다음 다운스트림 처리 단계를 사용할 수 있습니다. 재조합 대장균은 플라스미드를 기반으로 하는 카나마이신 또는 암피실린 또는 클로람페니콜과 같은 항생제가 포함된 LB 배지에서 성장합니다. 플라스크를 약 150 -250의 rpm에서 진탕하고 온도를 섭씨 37도에서 유지합니다. 세포가 대수기에 도달한 후, 이 연구는 IPTG가 추가되고 4-6시간 동안 추가로 흔들린다는 것을 설명합니다. 세포를 원심분리하고 50mM 인산나트륨 완충액에 재현탁합니다.

세포는 균질화기 또는 초음파 분쇄기를 사용하여 용해됩니다. 세포 현탁액을 원심분리하고 0.45μm 폴리에테르설포네이트 막을 사용하여 여과한다. E.coli에서 재조합 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 많은 단백질 특이적 방법을 사용할 수 있습니다. 가용성 단백질을 회수하기 위해 요소, 구아니디늄 염산염과 같은 강한 변성제가 사용됩니다. 가용화는 환원 조건에서 수행됩니다. 이러한 봉입체는 가용화 전에 잘 세척되어야 합니다. 티오레독신과 같은 가용화제는 단백질의 용해도를 향상시키는 것으로 알려져 있습니다.

유전자 융합 기술은 단백질 분리에 동등하게 우수합니다. 말토오스 결합 단백질과 글루타티온-S-트랜스퍼라제는 단백질과 잘 결합하는 것으로 밝혀졌으며 친화성 크로마토그래피 기술을 사용하여 제거할 수 있습니다. 리폴딩은 낮은 버퍼에서 희석 또는 정용여과를 사용하여 수행됩니다.


대장균에서 재조합 단백질 생산

대장균 대장균 (이자형. 대장균) 유전학은 수십 년 동안 연구되어 왔으며 이 유기체는 실험실에서 피할 수 없는 핵심 요소가 되었습니다.
단기간 생성과 관련된 유전 공학 및 합성 생물학의 발전과 주어진 유전 정보를 이용할 수 있는 유연성은 대장균을 재조합 단백질 생산을 위한 선택 숙주로 정의합니다.
유전자 공학, 발효 및 단백질 생산의 노하우를 바탕으로 재조합 단백질 생산 기술과 서비스를 개발했습니다.

우리의 기술 Staby®Express는 우리가 일반적으로 사용하는 사용 가능한 기술을 개선한 것입니다. 규제 기관의 권고에 따라 항생제 내성 유전자를 제거하고 에너지 바이오버든을 감소시키면서 완벽한 플라스미드 안정화를 보장합니다.

당사의 재조합 단백질 생산 서비스는 당사 기술을 사용하거나 사용하지 않고 수행되며 귀하의 생산을 위한 몇 가지 조정/최적화를 포함합니다.

  • 서열 및 코돈 최적화
  • 유전자 합성
  • 발기인 선정
  • 단백질 정제 또는 식별을 위한 태그 추가

발현 벡터의 유전자 구성 후 배양 및 발현 조건을 최적화하기 위해 소량의 발현 테스트를 수행합니다. 그런 다음 정제 과정을 결정하는 가용성 또는 불용성 분획에서 단백질의 존재를 평가합니다.

발현 조건의 검증 후에 우리는 당신이 선택한 규모로 단백질을 생산하고 정의된 프로토콜에 따라 그것을 정제할 것입니다.

단백질은 쉐이크 플라스크 또는 발효기(5L ~ 50L)에서 생산할 수 있습니다.
우리는 mg에서 몇 그램 규모의 정제된 단백질을 제공합니다.


표적 수정을 피하는 전략

일부 단백질은 촉매 특성에 의해 숙주의 세포 대사에 직접적인 영향을 미치지만 일반적으로 재조합 단백질의 발현은 "대사 부담"을 유발합니다. 대사 부담은 외래 DNA의 유지 및 발현을 위해 숙주 대사에서 회수되는 자원(원재료 및 에너지)의 양으로 정의된다[6]. 봉입체의 형성은 변성 단백질의 축적에 대한 반응으로 발생합니다. 대사 부담과 봉입체 형성은 직접적으로 연결되어 있지는 않지만 용해성 재조합 단백질을 생산하는 세포의 능력을 결정하는 주요 요인 중 하나입니다. 변성 단백질의 축적과 대사 부담은 여러 환경 요인에 의해 제어될 수 있기 때문에 우리는 부분적으로 가용성 단백질의 형성을 제어할 수 있습니다 생체 내.

감소된 온도에서 단백질 발현

제한하는 잘 알려진 기술 생체 내 재조합 단백질의 응집은 감소된 온도에서의 배양으로 구성됩니다[7]. 이 전략은 인간 인터페론 α-2, 서브틸리신 E, 리신 A 사슬, 박테리아 루시퍼라제, Fab 단편, β-락타마제, 쌀 리폭시게나제 L-2, 대두 리폭시게나제 L-1을 비롯한 여러 난해한 단백질의 용해도를 개선하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. , 카나마이신 뉴클로티딜트랜스퍼라제 및 토끼 근육 글리코겐 포스포릴라제([8] 및 여기에 인용된 참고 문헌 참조).

응집 반응은 일반적으로 응집 반응을 결정하는 소수성 상호작용의 강한 온도 의존성으로 인해 더 높은 온도에서 선호됩니다[9]. 온도 감소의 직접적인 결과는 과발현 조건에서 유도되는 열 충격 프로테아제의 부분적 제거입니다[10]. 또한, 다수의 활동과 표현 대장균 샤페론은 약 30°C의 온도에서 증가합니다[11, 12]. 낮은 온도에서 향상된 안정성과 올바른 접힘 가능성은 부분적으로 이러한 요인에 의해 설명됩니다.

그러나 배양 온도의 ​​급격한 감소는 복제, 전사 및 번역을 억제한다[13]. 재조합 단백질 발현을 위한 벡터에 사용되는 전통적인 프로모터는 효율성 측면에서도 큰 영향을 받습니다[14]. 적당히 강하거나 약한 프로모터가 사용되거나 강한 프로모터가 부분적으로 유도될 때 유사한 전사 효과가 달성된다. 낮은 유도 수준은 더 많은 양의 가용성 단백질을 생성하는 것으로 밝혀졌습니다[15]. 이것은 폴딩을 선호하는 세포 단백질 농도의 감소의 결과입니다. 그러나 박테리아의 성장이 감소하여 바이오매스의 양이 감소합니다.

저온에서 재조합 단백질의 발현을 최적화하기 위한 다양한 전략은 다음과 같습니다.

를 기반으로 한 시스템 cspA 프로모터는 저온에서 단백질의 발현을 위해 개발되었다[16]. NS cspA 프로모터는 저온에서 높게 유도되고 37°C 이상에서 잘 억제됩니다. 독성이 있는 TolAI-β-lactamase 융합 단백질을 암호화하는 서열 대장균 37°C에서 급속하게 분해되는 것은 cspA 발기인. 15 또는 23°C로 온도를 낮추면 융합 단백질의 분해가 사라지고 37°C에서 발현과 관련된 독성 표현형이 억제되었습니다. 이 시스템은 막에 걸쳐 있는 도메인이나 불안정한 유전자 산물을 포함하는 단백질 생산에 유용한 도구라고 제안되었습니다. 대장균.

4°C에서 단백질 발현과 접힘을 허용하는 원리가 최근에 발표되었습니다[17]. 이 원리는 표적 단백질과 호냉성 박테리아의 샤페론의 동시 발현을 기반으로 합니다. 두 명의 보호자(Cpn60 및 Cpn10 남극 올레이스피라 RB8 T ) 허용 대장균 4°C에서 빠른 속도로 성장합니다[12]. 에스테라제 O. 남극 RB8 T는 Cpn60 및 Cpn10과 함께 공동 발현되었습니다. 대장균 4°C에서 이 절차는 37°C에서 배양하여 제조된 효소와 비교하여 정제된 에스테라제의 비활성을 180배 증가시켰습니다. 낮은 온도가 폴딩에 유리하다는 결론을 내렸고 이 시스템은 세포질에서 재조합 단백질의 발현과 올바른 폴딩을 위한 도구로 제안되었다. 대장균.

대장균가용성 발현을 개선하는 데 사용되는 균주

높은 수준의 단백질 발현과 관련된 대사 부담을 극복하기 위해 수많은 특수 숙주 균주가 개발되었습니다.

대장균 돌연변이 균주는 어려운 재조합 단백질의 가용성 발현에 크게 기여했습니다. C41(DE3) 및 C43(DE3)은 부모 균주 BL21(DE3)에서 높은 수준으로 발현될 수 없는 일부 구형 및 막 단백질의 과발현을 허용하는 돌연변이입니다[18]. F의 표현1NS영형 이들 균주, 특히 C43(DE3)에서 ATP 합성효소 소단위 b 막 단백질은 세포내 막의 증식을 동반하며 봉입체는 존재하지 않는다[19]. 이 균주는 현재 Avidis http://www.avidis.fr에 의해 상업화되었으며 어려운 단백질의 발현에 사용되는 많은 보고서가 발표되었습니다[20-23]. 최근 연구에서는 독성 단백질을 암호화하는 플라스미드의 안정성이 C41(DE3), 특히 C43(DE3)에서 증가한다고 보고합니다[24].

시스테인 대장균 세포질은 thioredoxin reductase와 glutaredoxin을 포함하는 경로에 의해 능동적으로 감소된 상태로 유지됩니다. Novagen의 Origami 균주에서 이황화 결합 의존적 접힘 이종 단백질이 개선되었습니다. 방해 trxB 그리고 고르 두 환원효소를 암호화하는 유전자는 대장균 세포질. NS trxB (노바젠 AD494) 및 trxB/gor (Novagen Origami) 음성 균주 대장균 여러 표현 상황에서 선택되었습니다[25-27]. 표적 단백질의 접힘 및 이황화 결합 형성은 티오레독신 환원효소가 결핍된 균주에서 티오레독신과의 융합에 의해 향상됩니다.trxB) [28]. 세포질에서 periplasmic foldase DsbC의 과발현은 이황화 결합 형성을 더욱 자극합니다[27].

가용성 단백질을 얻기 위한 배양 전략의 수정

재조합 단백질을 생산하는 가장 간단한 방법은 배치 배양입니다. 여기에서는 성장에 필요한 모든 영양소가 처음부터 공급되며 과정 중에 성장을 제한적으로 제어합니다. 이러한 제한은 종종 기질 고갈뿐만 아니라 pH 및 용존 산소 농도의 변화와 같은 성장 배지의 변화로 이어집니다. 또한 다양한 대사 경로의 억제 산물이 축적됩니다. 세포 밀도와 생산 수준은 배치 배양에서 보통 수준입니다.

유가식 재배에서 에너지원의 농도는 소비율에 따라 조정할 수 있습니다. 바이오매스당 표적 단백질의 관점에서 최대 생산 수준을 얻기 위해 몇 가지 다른 요인도 조절될 수 있습니다. 유가식 배양에서 봉입체의 형성은 유세포 분석에 의한 고유 광산란의 변화를 모니터링하여 추적할 수 있습니다[29]. 이는 낮은 수준에서도 봉입체가 감지되고 봉입체 형성을 잠재적으로 피할 수 있는 즉시 성장 조건의 실시간 최적화를 허용합니다[30].

일부 단백질의 접힘에는 특정 보조인자의 존재가 필요합니다. 배양 배지에 이러한 보조인자 또는 결합 파트너를 추가하면 가용성 단백질의 수율이 극적으로 증가할 수 있습니다. 이것은 헴이 과도할 때 가용성 생성물의 축적이 개선된 헤모글로빈의 재조합 돌연변이체에 대해 입증되었습니다[31]. 유사하게, gloshedobin에 대한 용해도의 50% 증가는 대장균 재조합체는 0.1mM Mg 2+ 존재하에서 배양되었다[32]. 재조합 단백질의 가용성 발현에서 중요한 요소는 배지 구성 및 최적화입니다. 이것은 대부분 시행 착오를 통해 달성되지만 그럼에도 불구하고 유익할 수 있습니다.

분자 샤페론은 재조합 단백질의 접힘을 유도합니다

봉입체 형성을 방지하기 위한 가능한 전략은 분자 샤페론의 공동 과발현입니다. 이 전략은 매력적이지만 샤페론이 재조합 단백질 용해도를 향상시킨다는 보장은 없습니다. 대장균 일부는 접힘 시도를 유도하는 반면 다른 일부는 단백질 응집을 방지하는 샤페론을 암호화합니다[4, 11, 33]. 새로 합성된 단백질이 세포의 출구 터널을 떠나자마자 대장균 그들은 방아쇠 인자 샤페론과 연관시키는 리보솜 [34]. 새로 합성된 단백질에 노출된 소수성 패치는 의도하지 않은 분자간 또는 분자내 상호작용으로부터 유발 인자와의 결합에 의해 보호되어 조기 폴딩을 방지합니다. 단백질은 유발 인자에서 방출된 후 원래 상태로 접힘을 시작하거나 계속할 수 있습니다. 비천연 및 응집 경향이 있는 형태에 갇힌 단백질은 DnaK 및 GroEL의 기질입니다. DnaK(Hsp70 chaperone family)는 잘못 접힌 단백질의 응집을 줄이고 단백질 분해를 촉진하여 봉입체의 형성을 방지합니다[11]. DnaK 및 ClpB(Hsp100 chaperone family)를 포함하는 bi-chaperone 시스템은 단백질의 가용화 또는 분해를 매개합니다[35]. GroEL(Hsp60 chaperone family)은 가용성 및 불용성 단백질 분획 사이의 단백질 이동을 작동하고 분해 및 봉입체 형성에 적극적으로 참여합니다. 작은 열 충격 단백질 lbpA 및 lbpB는 비가역적 응집으로부터 열 변성 단백질을 보호하고 봉입체와 관련된 것으로 밝혀졌습니다[36, 37].

샤페론 인코딩 유전자와 재조합 표적 단백질의 동시 과발현은 여러 사례에서 효과적인 것으로 입증되었습니다. 재조합체에서 유발 인자의 공동 과발현은 마우스 엔도스타틴, 인간 산소 조절 단백질 ORP150, 인간 리소자임 및 기니피그 간 트랜스글루타미나제의 응집을 방지했습니다[38, 39]. 가용성 발현은 트리거 인자와 함께 GroEL-GroES 및 DnaK-DnaJ-GrpE 샤페론 시스템의 공동 과발현에 의해 추가로 자극되었습니다[39]. 샤프롱 시스템은 협력적이며 가장 유리한 전략은 GroEL, DnaK, ClpB 및 리보솜 관련 샤페론 유발 인자 계열에 속하는 샤페론 조합의 공동 발현을 포함합니다[40-42].

상호작용 파트너와 단백질 접힘

단백질 불용성 대장균 세포질은 부분적으로 단백질 표면의 소수성 잔기 분포와 관련이 있습니다. 따라서 이종 다량체 단백질의 서브유닛의 가용성 발현은 적절한 결합 파트너의 부재 하에 봉입체 형성을 겪는 경우가 있다.

가용성 표현 대장균 박테리오파지 T4 유전자 23 산물(주요 캡시드 단백질)의 산물은 유전자 산물 31(파지 co-chaperonin gp31)의 공동 발현을 필요로 했습니다[43]. 올바른 상호작용 파트너의 발현은 gp23이 올바르게 접혀서 세포질에서 길고 규칙적인 구조를 형성할 수 있게 했습니다. 대장균.

또 다른 연구에서는 각 소단위(페로막세인 A 및 C)를 티오레독신에 융합하여 발현시켜 이종이량체 복합체를 정제했다고 보고합니다[44]. 각 소단위체는 티오레독신이 단백질 분해적으로 제거되었을 때 용액에 용해된 채로 남아있었고, 오직 다른 소단위체가 있을 때만 존재했습니다.

결론적으로 상호 작용 파트너는 잠재적으로 선호합니다. 생체 내 표적 단백질의 용해도. 복잡한 구조에 관련된 여러 단백질의 공동 발현을 위한 새로운 시스템은 이러한 전략을 가능하게 합니다[1].


재료 및 방법

플라스미드 구성, 클로닝 및 대장균 변환

코돈 사용 분석 후, codon-optimized RMCP1 2개의 제한 부위가 측면에 있는 유전자 서열(NM_001082294.1), 엔코나와 pUC57(RMCP1/pUC57)의 I은 GeneCust(Dudelange, Luxembourg)에 의해 생성되었습니다(그림 1). 그런 다음 RMCP1/pUC57을 사용하여 대장균 TOP10F' 균주(TOP10) 세포는 플라스미드 DNA를 증폭합니다. 세포를 37℃ 및 200rpm에서 테트라사이클린(10㎍/mL)을 함유하는 Luria-Bertani(LB) 브로쓰(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에서 성장시켰다. 그런 다음 제조사의 지침(서울, 한국)에 따라 SolGent Plasmid Mini Prep 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고 나와 엔코I. 소화 생성물을 아가로스 겔 및 RMCP1- 함유 단편을 GeNet Bio Kit(대전, 한국)를 사용하여 겔 추출하여 정제하였다. 정제된 단편을 나- 그리고 엔코I-digested pET28a 벡터(Pasteur Institute, Tehran, Iran), TOP10 세포를 형질전환하는데 사용. 모든 TOP10 변환은 염화칼슘 및 열 충격 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. His를 인코딩하는 시퀀스6-태그는 바로 뒤에 존재합니다. pET28a 플라스미드 상의 I 제한 부위, 따라서 생성된 재조합 단백질은 융합된 C-말단 His6-꼬리표.

(NS) 토끼 MCP1 코딩 서열을 포함하는 구성의 개략도. (NS) 재조합 토끼 MCP1의 뉴클레오티드(하부) 및 번역된 아미노산(상부) 서열. 아미노산 서열의 1번 위치는 성숙한 토끼 MCP1 단백질의 첫 번째 아미노산(메티오닌)에 해당합니다.

(NS) 토끼 MCP1 코딩 서열을 포함하는 구성의 개략도. (NS) 재조합 토끼 MCP1의 뉴클레오티드(하부) 및 번역된 아미노산(상부) 서열. 아미노산 서열의 1번 위치는 성숙한 토끼 MCP1 단백질의 첫 번째 아미노산(메티오닌)에 해당합니다.

생성된 양성 클론을 콜로니 PCR 및 소화에 의해 평가하였다. PCR 반응 혼합물은 Taq DNA 중합효소(Thermo Scientific, Waltham, MA)(0.3μL, 1.25U), 10X 완충액(2.5μL Thermo Scientific), 10mM dNTP(1μL), 1.25mM MgCl을 포함했습니다.2 (0.5μL Thermo Scientific), 이중 증류수(17.75μL), 및 1μL의 10mM T7 정방향(F, 5΄-TAATACGACTCACTATAGGG-3΄) 및 역방향(R, 5΄-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3΄) 프라이머. PCR 프로그램은 96°C에서 4분 인큐베이션으로 시작한 후 95°C에서 30초, 58°C에서 30초, 72°C에서 50초의 30주기를 거쳐 72°C에서 단계로 끝납니다. 10 분. Bio-Rad 열 순환기(Hercules, CA)를 PCR에 사용했습니다. PCR 생성물 크기는 아가로스 겔(1%) 전기영동 및 DNA 믹스 래더(Fermentase)와의 비교에 의해 확인되었습니다.

재조합 단백질 발현

구축된 플라스미드(RMCP1/pET28a)를 양성 클론에서 추출하여 형질전환하는데 사용하였다. 대장균 BL21(DE3)(BL21)(파스퇴르 연구소). 25㎍/mL의 카나마이신을 함유한 LB 한천(Sigma-Aldrich)에서 단일 형질전환체를 선택하고 콜로니 PCR 및 NS/엔코나 제한효소 소화. 생성된 클론(2개 클론)에 삽입된 단편의 정확한 서열은 바이오니아(한국)에서 수행한 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

2개의 양성 클론(클론 2 및 3)은 rRMCP1 단백질 생산을 위해 선택되었습니다. 단백질 발현을 유도하기 위해, 클론을 25㎍/mL의 카나마이신이 보충된 LB 브로쓰에서 이소프로필-β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 유도와 함께 배양하였다. 중간 수준의 단백질 발현을 허용하는 최적의 조건을 결정하기 위해 다음 유도 매개변수를 조사했습니다. OD600 유도 시 세균 배양의 양(0.4–0.5, 1.0–1.2 및 2.0–2.5), 온도(26°C, 30°C 및 37°C), 유도 지속 시간(5–24시간), 진탕 속도(180–250rpm) ) 및 IPTG의 최종 농도(0.5, 1 및 2mM). 유도 동안 4-6시간마다 배지 교체의 효과도 조사되었습니다. 즉, 4-6시간마다 박테리아를 원심분리에 의해 수집하고 동일한 항생제 및 IPTG 농도의 신선한 배양 배지를 추가했습니다.

Coomassie Brilliant Blue R-250 염색에 의한 단백질 시각화 및 컨쥬게이션된 양고추냉이 퍼옥시다제/항-His 항체(Thermo Scientific)를 사용한 웨스턴 블롯팅을 통한 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 rRMCP1의 발현을 확인했습니다.

재조합 단백질 정제

rRMCP1 단백질을 생산하는 BL21 세포를 4mL의 용해 완충액[100mM NaH24, 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 8M 요소] 박테리아 펠릿 1g당 이 공정은 QIAGEN(Hilden, Germany) 단백질 정제 프로토콜에 따라 초음파 처리(50초의 5회 펄스)에 의해 완료되었습니다. 용해물을 8500 x에서 원심분리했습니다. NS 4°C에서 3분 동안 상층액을 실온(22°C–25°C)에서 45분 동안 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 수지(QIAGEN)와 함께 인큐베이션했습니다. 단백질/수지 복합체를 미니어처 QIAGEN 컬럼에 적용하고 세척하고 완충액 B~E를 사용하여 용출하고 분획을 별도로 수집했습니다. 수집된 분획의 SDS-PAGE 분석 후, 정제된 단백질 분획을 풀링하고 Amicon Ultra-4 원심분리 필터(Merck Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 농축했습니다. 단백질 농도는 표준으로 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich)을 사용하여 Bradford 분석(Bradford 1976)을 사용하여 결정되었습니다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅

SDS-페이지

BL21, BL21/pET28a 및 BL21/pET28a/RMCP1 세포를 LB 브로쓰 배지에서 배양하였다. OD에서600 = 0.4–0.5, BL21/pET28a/RMCP1 배양물을 두 개의 튜브로 분할하고 절반을 24시간 동안 IPTG에 의해 유도했습니다. 유도 후 5, 16 및 24시간 후에 샘플을 회수하고 OD를 측정하여 세 가지 조건 사이에서 박테리아의 양을 정규화했습니다.600s 및 희석하여 균등화하고 전기 영동을 위해 준비합니다. 샘플과 사전 염색된 단백질 마커(10-270kDa, Thermo Scientific)를 15% SDS-PAGE 젤에 로딩한 다음 Coomassie R-250 용액에서 3시간 동안 염색하고 탈색했습니다.

웨스턴 블로팅

SDS-PAGE 후, 단백질을 90V에서 90분 동안 전달 완충액(25mM Tris 염기, 190mM 글리신, 20% 메탄올, pH 8.3)을 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮겼다. (페이졸라자데 et al. 2016). rRMCP1 단백질은 마우스 모노클로날 항-폴리-히스티딘 퍼옥시다제 접합 항체(1:2000 Sigma-Aldrich의 작업 희석)를 사용하여 검출되었습니다.

RRMCP1의 생물학적 활성

단핵구 배양

뉴질랜드 흰토끼 2마리(2.3 ± 0.2kg)(파스퇴르 연구소에서 구입)의 귀에서 거의 3mL 혈액을 채취했습니다. 실험은 이란 이스파한에 있는 이스파한 의과대학 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다.

단핵구는 제조자의 권고에 따라 Ficoll-Paque(Sigma-Aldrich)에 의해 분리되었다. 분리된 단핵구는 10% 소태아혈청(Sigma-Aldrich), 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신(Invitrogen , Carlsbad, CA), 5% CO 대기의 습한 인큐베이터에서2 37°C에서

RRMCP1 매개 단핵구 이동 분석

0.4-μm 기공 폴리카보네이트(PCTE) 멤브레인(Sterlitech Corporation, Kent, OH)이 있는 2개의 6웰 셀을 사용했습니다. 다양한 농도의 정제된 rRMCP1(0.5%의 태아 소 혈청, 100U/mL의 페니실린 및 100μg/mL의 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지 2mL당 5, 10, 15 또는 20μg)을 준비하고 각 웰의 하단 챔버, 중복. 단백질이 첨가되지 않은 2개의 웰이 대조군이었다. 단핵구(2.5 × 10 6 세포)를 RPMI 10mL에 현탁시키고, 현탁액 1mL를 상부 챔버에 넣었다. 그런 다음 플레이트를 37°C의 습한 인큐베이터, 5% CO에서 인큐베이션했습니다.2, 하룻밤. 상단 챔버의 미디어를 별도의 튜브로 옮겼습니다. 하단 챔버의 배지를 별도의 튜브로 옮기고 1500 x에서 원심분리했습니다. NS 실온에서 5분 동안 펠릿을 RPMI 1mL에 현탁시키고 트리판 블루 염색 후 세포를 계수하였다. 단핵구의 이동은 대조군과 비교하여 0.18, 0.36 또는 0.72 ng/mL를 함유하는 각 웰의 상부 챔버에서 막을 통해 하부 챔버로 이동한 세포의 수를 기준으로 평가되었습니다. 필터를 통해 이동한 단핵구의 수는 주화성에 비례했습니다.

통계 분석

단핵구 이동 분석의 데이터는 독립적인 도구를 사용하여 IBM SPSS 소프트웨어(버전 20.0)에서 분석되었습니다. NS 테스트 및 일원 분산 분석. NS-0.05보다 낮은 값은 유의미한 것으로 간주되었습니다.


재조합 인간 인터페론-β-1b의 클로닝, 고발현 및 정제 대장균

순차 평가 및 공정 제어 전략은 대장균. 높은 수준의 발현은 코돈 치환(N-말단 영역에서 52.6%의 AT 함량) 및 배양 조건의 최적화를 사용하여 달성되었습니다. 200 ㎍/ml 농도의 리팜피신을 첨가하면 66 mg 광학 밀도 -1 l -1(총 세포 단백질의 43.5%)의 특정 생성물 수율이 증가했습니다. 83%의 지질다당류, 32%의 숙주 디옥시리보핵산(DNA) 및 78%의 숙주 세포 단백질이 0.75% Triton X-100 및 2M 요소 세척에 의해 제거되었습니다. 11%의 지질다당류, 39%의 숙주 DNA 및 12%의 숙주 세포 단백질이 용해 단계에서 제거되었습니다. 단백질 재접힘의 92%는 고압 정용여과법에 의해 달성되었습니다. 고압 정용여과에 의한 재접힘, 베드 높이 및 크로마토그래피 컬럼의 이론 단판 값과 동일한 높이가 순도 높은 회수율을 위한 핵심 매개변수로 확인되었습니다. 마지막으로, 확립된 공정은 99% 이상의 순도로 정제된 단백질 34%를 산출했으며 전임상 독성 연구에 적합합니다. 이 연구에서 얻은 정제된 rhIFN-β-1b는 지금까지 보고된 것 중 가장 높다.

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단백질 발현 대장균

박테리아에서 단백질 발현 대장균 재조합 단백질을 생산하는 가장 보편적인 방법입니다. 대장균 짧은 배양 시간, 손쉬운 유전자 조작 및 저렴한 배지를 제공하는 잘 확립된 숙주입니다. 추가적으로, 대장균 다양한 종류의 단백질을 생산할 수 있는 오랜 역사를 가지고 있습니다. 이황화 결합을 포함하는 단백질도 NEB SHuffle ® 균주의 세포질 내에서 발현될 수 있습니다.

의 영역 내에서 대장균 발현, T7 시스템은 단백질 생산을 위한 가장 대중적인 접근입니다. 이 시스템에서, T7 프로모터의 다운스트림에 클로닝된 관심 유전자를 함유하는 발현 벡터가 T7 발현 숙주에 도입된다. DE3 균주 또는 T7 Express 균주와 같은 T7 발현 숙주는 파지 T7 RNA 중합효소 유전자의 염색체 사본을 보유합니다. 인듀서가 첨가되면 T7 RNA 중합효소가 발현되어 관심 유전자의 전사 전용이 됩니다.

유형 선택:

  • 특정 애플리케이션
  • 자주 묻는 질문
  • 프로토콜
  • 도구 및 리소스
  • 간행물
  • NiCo21(DE3)은 His 태그가 붙은 단백질 순도에서 BL21(DE3)을 능가합니다.
  • T7에서 단백질의 조절된 발현 대장균 호스트
  • 막 단백질 발현을 위한 Lemo System™
  • 이황화 결합 형성
  • NiCo21(DE3) 2단계 정제
  • 법률 정보

특집 기사

이 기사는 지난 40년 동안 단백질 발현 및 정제 방법의 발전에 대한 개요를 제공합니다.

야생형 E. coli의 세포질에서 이황화 결합 형성은 바람직하지 않은 반면 SHuffle은 세포질에서 다중 이황화 결합으로 단백질을 올바르게 접을 수 있습니다.

이 제품은 New England Biolabs, Inc(NEB)가 소유하거나 관리하는 하나 이상의 특허, 상표 및/또는 저작권의 보호를 받습니다.

NEB가 다양한 응용 프로그램에 대한 제품을 개발하고 검증하는 동안 이 제품을 사용하는 동안 구매자는 특정 응용 프로그램에 대한 추가 제3자 지적 재산권을 획득해야 할 수 있습니다.

상업적 권리에 대한 자세한 내용은 NEB의 글로벌 비즈니스 개발 팀([email protected])에 문의하십시오.

이 제품은 연구 목적으로만 사용됩니다. 이 제품은 인간이나 동물에 대한 치료 또는 진단 목적으로 사용하기 위한 것이 아닙니다.

비디오

어려운 단백질 발현을 위한 솔루션

NEB는 재조합 단백질 발현 분야에서 오랜 역사를 가지고 있으며 발현하기 어려운 단백질에 대한 광범위한 솔루션을 개발했습니다.


재조합 단백질의 용해 및 정제

전통적으로 단백질 정제는 대장균 수확, 박테리아 세포 용해, 용해물 정화 및 단백질 정제의 4단계를 포함합니다. 박테리아 용해는 일반적으로 단백질 품질에 부정적인 영향을 미치고 샘플 가변성에 기여할 수 있는 동결/해동 주기 및 초음파 처리를 포함하여 시간이 많이 걸리는 여러 단계를 필요로 합니다. 단백질 활성과 무결성을 유지하기 위해 세제 기반 용해 완충액을 사용하여 기계적 단백질 추출 방법을 방지합니다. 원심분리는 일반적으로 원치 않는 세포 파편을 펠렛화하고 명확한 용해물 회수를 허용하는 데 필요합니다.

정제는 발현된 에피토프 태그에 특이적인 친화성 배지를 사용하여 자주 수행됩니다. 아가로스 기반 배지는 일반적으로 미세원심분리 튜브의 슬러리로 사용되거나 컬럼에 포장되어 사용됩니다. 컬럼은 조작하기 쉽지만 용해물의 일관성과 세포 파편의 이월에 영향을 받아 막힘을 유발할 수 있습니다.

이 문서에서는 효소 용해 및 정제 단계를 결합하여 기존의 재조합 단백질 정제 워크플로를 간소화하기 위한 새로운 프로토콜을 보여줍니다. 이 접근 방식은 기존 워크플로(그림 1).

프로토콜에 자기 비드를 통합하면 원심분리에 의해 용해물을 명확히 할 필요가 없습니다. 아가로스 비드가 사용된 곳에 마그네틱 비드가 채택되어 처리 시간이 단축되고 시료 처리량이 증가합니다. 마그네틱 비드는 일반적으로 배치 모드에서 사용되며 버퍼 교환을 허용하기 위해 자석에 격리됩니다.

마그네틱 비드는 입자 프로세서를 사용하여 프로토콜의 자동화를 용이하게 하여 샘플 처리량을 증가시키면서 실습 처리 시간을 10분 미만으로 줄입니다. 작업 흐름을 더욱 개선하기 위해 박테리아 세포에서 가용성 단백질을 비기계적으로 추출할 수 있는 BugBuster® Master Mix 시약(EMD Millipore)을 사용했습니다. 이 추출 시약은 세제 기반 용해와 효소제 Benzonase® 뉴클레아제 및 효소 rLysozyme™을 즉시 사용할 수 있는 제형으로 결합합니다.


그림 1. 정제와 결합된 1단계 용해(오른쪽)는 별도의 용해, 용해물 정화 및 정제 단계(왼쪽)가 필요한 기존의 재조합 단백질 정제에 비해 상당한 시간을 절약합니다.

재료 및 방법

Histidine-tagged recombinant glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) was purified with PureProteome™ Nickel Magnetic Beads (EMD Millipore), using a traditional purification workflow (mechanical lysis) and the new condensed protocol (combined detergent-based lysis and purification). These magnetic beads capture histidine-tagged proteins they isolate recombinant proteins at high purity and can be used manually or on automated systems. We compared the manual processing results with those obtained using the KingFisher® automated particle processor (Thermo Scientific).

Traditional Protein Purification
대장균 culture was pelleted into microcentrifuge tubes and the supernatant was discarded. Lysis/wash buffer containing lysozyme was added to each pellet. The pellet was resuspended and incubated with end-over-end mixing, followed by sonication using a microtip. The lysate was frozen, followed by quickly thawing the sonication/freeze-thaw cycle was repeated once more. To reduce viscosity, Benzonase endonuclease was added to the lysate and clarified by centrifugation.

The clarified lysate was added to PureProteome Nickel Magnetic Beads. The beads were incubated with 대장균 lysate with end-over-end mixing. After removal of the lysate, the beads were washed with lysis/wash buffer by vortexing, capturing the beads on the magnet and removing the buffer by pipette. The wash step was repeated two more times prior to eluting the captured histidine-tagged GAPDH. The beads were mixed, and an additional elution was performed to achieve maximum yield. Both elution fractions were combined into one microcentrifuge tube for future analysis.

One-Step Protein Purification
Manual Processing
대장균 culture was pelleted into microcentrifuge tubes and the supernatant discarded. Suspended PureProteome Nickel Magnetic Bead slurry was added. Using the PureProteome Magnetic Stand, the preservative was removed, and the beads were washed with lysis/wash buffer. The beads were collected on the magnet, and the buffer was removed by pipette. The beads were resuspended in BugBuster Master Mix and the suspension was added to each 대장균 pellet. Each tube was briefly vortexed, then incubated with end-over-end mixing. The unbound fractions were discarded and beads were washed using the PureProteome Magnetic Stand to capture beads. Elution was performed as previously described.

Automated Processing
대장균 culture was pelleted into a KingFisher Microtiter Deepwell 96 plate and the supernatant discarded. Reagents and samples were pipetted into the KingFisher Duo plates and the suspended PureProteome Nickel Magnetic Bead slurry was brought up to sufficient volume with wash buffer. Wash buffer was used for both equilibration and wash steps, and the elution buffer was pipetted into the elution strips. The protocol was executed and the plates were loaded into the KingFisher Duo System.

The PureProteome Nickel beads were equilibrated in wash buffer to remove preservatives. The beads were collected, and cell lysis and His-tagged protein capture was performed. The beads were then washed and recombinant protein was eluted. After the run ended, the eluted sample fractions were collected for further analysis.

Protein Analysis
Additional lysates were prepared using the traditional mechanical lysis approach as well as using the BugBuster Master Mix protocol no magnetic beads were added during the lysis step. The lysate was clarified by centrifugation, and total protein concentration was determined with the Direct Detect®
IR spectrometer (EMD Millipore).

A quantitative Bradford assay was also performed to assess the efficiency of lysis and protein purification.

Finally, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed. Purified samples were reduced, denatured and loaded onto NuPAGE® Bis-Tris gels (Life Technologies). Following electrophoresis, the gels were stained with Coomassie® blue to visualize protein bands.

The results demonstrated that the new protocol delivered more total protein in less time and with greater consistency than the traditional method. Traditional mechanical lysis of six samples took about two hours the average total protein collected was 3.54 mg/mL and the CV% was 15.55. In contrast, enzymatic lysis using the new protocol took about 30 minutes the average total protein collected was 4.09 mg/mL and the CV% was 2.05.

The eluted fractions were then tested for protein yield using a Bradford assay. All workflows demonstrated roughly equivalent yields of purified protein. However, the traditional method exhibited greater inter-sample variability than did either condensed protocol. Workflow automation offered the highest degree of reproducibility (테이블).

Finally, the SDS-PAGE gel showed all workflows provided similar sample purity (그림 2). As previously noted, greater sample-to-sample variability was observed for the traditional workflow.


Yield of His-tagged GAPDH using the traditional and condensed 대장균 lysis and purification protocol as determined by Bradford assay.

For extraction of recombinant protein from 대장균, traditional mechanical lysis is a time-consuming manual process. Mechanical lysis and manual processing can also result in variable yield due to sample-to-sample variations in the sonication step. By combining gentle nonmechanical lysis with magnetic affinity capture beads for His-tagged protein purification, the traditional recombinant protein purification workflow has been condensed.

Even when samples were manually processed, a one-step lysis and purification protocol reduced processing time by 75% without sacrificing yield or purity. Due to reduced sample manipulation, the simplified protocol also provides greater sample-to-sample consistency. Moreover, by eliminating centrifugation requirements, the condensed workflow can be automated using particle processors to further reduce sample variability and increase throughput while reducing hands-on time to less than 10 minutes.


Figure 2. SDS-PAGE analysis of His-tagged GAPDH purified using the traditional and condensed recombinant protein purification workflows. The condensed protocol was performed manually as well as on the KingFisher Duo System. (Molecular weight standards are included in the rightmost lane.)


대장균

NEB offers two protein expression systems in 대장균. The pMAL&trade Protein Fusion & Purification System (NEB #E8200) is used to express an MBP-fusion protein which is then purified by affinity purification. This system enhances solubility and results in reliable 대장균 expression in either the cytoplasm or periplasm.

The IMPACT&trade Kit (NEB #E6901) allows fusion of a tag consisting of the intein and the chitin binding domain (CBD), to either the C-terminus (pTXB1) or the N-terminus (pTYB21) of the target protein. In the presence of thiols, such as DTT, the intein undergoes specific self-cleavage which releases the target protein from the chitin-bound intein tag resulting in purification in a single chromatographic step with no need for proteases.

pMAL&trade and IMPACT&trade are trademarks of New England Biolabs, Inc.

Choose Type:

  • Subcategories
  • FAQs
  • 프로토콜
  • 애플리케이션 노트
  • 도구 및 리소스
  • 간행물
  • Schematic Illustration of the IMPACT™ System
  • Expression and Purification of 대장균 Maltose-Binding Protein (MBP) Using the pTXB1 Vector (pMXB10)
  • T7-Controlled Expression of a Non-Toxic Protein in 대장균 Hosts
  • Western Analysis of 6-His-tagged 브루지아 말레이 단백질
  • Overnight Expression of a Membrane Protein - PhoA fusion
  • Disulfide Bond Formation
  • PfCHT1 Chitinase Activity Assayed from Crude Lysates
  • Improved Purity of His-tagged Proteins with NiCo21(DE3)
  • NiCo21 (DE3) Two-Step Purification
  • Optimization of YidC-GFP Expression with Lemo21(DE3)
  • Lemo21(BE3) vs. BL2(DE3)
  • 법률 정보

특집 기사

Read how to avoid common obstacles in protein expression that prevent interactions with cellular machinery.

Cell-free protein synthesis has the potential to become one of the most important high throughput technologies for functional genomics and proteomics.

브로셔

선택 도구

Lane 1: uninduced cell extract.
Lane 2: induced cell extract showing expressed fusion protein.
Lane 3: MBP fractions eluted after inducing cleavage overnight at 4°C.
Lane 4: MBP ligated to a peptide containing an N-terminal cysteine. Marker M is the Protein Ladder (NEB #P7703).

Protein expression with Lemo21(DE3) is very similar to BL21(DE3), with only a few minor changes.

이 제품은 New England Biolabs, Inc(NEB)가 소유하거나 관리하는 하나 이상의 특허, 상표 및/또는 저작권의 보호를 받습니다.

NEB가 다양한 응용 프로그램에 대한 제품을 개발하고 검증하는 동안 이 제품을 사용하는 동안 구매자는 특정 응용 프로그램에 대한 추가 제3자 지적 재산권을 획득해야 할 수 있습니다.

상업적 권리에 대한 자세한 내용은 NEB의 글로벌 비즈니스 개발 팀([email protected])에 문의하십시오.

이 제품은 연구 목적으로만 사용됩니다. 이 제품은 인간이나 동물에 대한 치료 또는 진단 목적으로 사용하기 위한 것이 아닙니다.


실시예 4

Improvement in the Expression Level and Cellular In Vivo Folding of the Recombinant HSA with the Assistance of Molecular Chaperone System

Recombinant 대장균 origami DE3 cells co-transformed with both the plasmids (pETHSA and pTF16) were inoculated in the primary culture of 5 mL LB medium containing both the antibiotics-ampicillin (100-300 μg/mL) and chloramphenicol (20-40 μg/mL). They were then inoculated from primary culture into a secondary culture in ZY autoinduction growth medium containing both ampicillin (100-300 μg/mL) and chloramphenicol (20-40 μg/mL) antibiotics. The secondary culture was grown at a temperature between 30-40° C. and the samples were collected and checked for optical density at regular time intervals. The growth of the cells was monitored and the cells were induced with L-Arabinose (Final conc. 0.3-0.6 mg/mL) when the OD600 reached 0.2 to 0.5 (which took between 6-12 hours) and left to grow again until the OD600 reached 0.6-1.0.

Δt this point, the incubation temperature of the recombinant host cell culture was lowered to a temperature in the range of 10-20° C. and cells were harvested after 8-12 hours of induction.

In order to obtain the expressed protein, the cells were resuspended in the lysis buffer containing the osmolyte trehalose in the concentration range of 0.5-1.0M. Cell lysate was obtained after the lysis step using conventional means. To summarize the steps above briefly, induced 대장균 Origami2 (DE3) cells expressing both the Trigger factor (chaperone) and rHSA were harvested and pelleted down by centrifugation. The cell pellet obtained was resuspended in cell lysis buffer and incubated for 15-30 minutes. The resuspended cells in lysis buffer were then exposed to an ultrasonic cell disruptor to release the intracellular components in the lysis buffer. The sonicated cell lysate was fractionated by high speed centrifugation. The supernatant containing soluble fraction of rHSA was carefully aspirated without disturbing the pellet which contained the insoluble aggregated fraction of rHSA. Cells were then fractionated and analyzed for solubility and activity assay and was compared with the rHSA production in 대장균 without Trigger factor expression (chaperone assistance).

Overall, the present disclosure provides a process for obtaining soluble and functional rHSA protein, in the presence of the molecular chaperone Trigger Factor. The process results in 1.5-2.0 fold increase in expression level of rHSA protein as compared to protein levels obtained without the presence of the molecular chaperone. Further, it is observed that though the soluble fraction of the rHSA expressed in the 대장균 remains same in both the conditions (with or without chaperone assistance) i.e. 60%, there exists marked difference in the activity of the soluble fraction's functional content (FIG. 5). As has been demonstrated, the present process leads to 20-30% increase in functionally active soluble rHSA protein in the soluble fraction of rHSA when co-expressed along with the molecular chaperones as compared to when expressed alone in the 대장균 host system (Recently filed patent application, IP no. 201611027096).

The enhancement in the activity is credited to the employment of trigger factor system for rHSA production as Trigger factor (molecular chaperone) acts to prevent misfolding and aggregation reaction by transiently shielding the hydrophobic regions exposed in non-native polypeptides during and after translation. (Agashe et al., Cell (2009) 117:199-209).

Although the subject matter has been described with reference to specific embodiments, this description is not meant to be construed in a limiting sense. Various modifications of the disclosed embodiments, as well as alternate embodiments of the subject matter, will become apparent to persons skilled in the art upon reference to the description of the subject matter. It is therefore contemplated that such modifications can be made without departing from the spirit or scope of the present subject matter as defined.


비디오 보기: 5주차 재조합 단백질 발현 및 분리 정제 (팔월 2022).