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질량 분석법으로 단백질의 서열을 결정하려면 B 이온과 Y 이온이 모두 필요합니까?

질량 분석법으로 단백질의 서열을 결정하려면 B 이온과 Y 이온이 모두 필요합니까?



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펩타이드에서 아미노산의 순서를 결정하기 위해 모든 b 및 y 이온이 모두 필요한지 궁금합니다.

내 의견으로는 ALL B 이온 또는 ALL y-이온만 아는 것만으로도 펩타이드의 아미노산 서열을 결정할 수 있습니다. 또한 이러한 b 및 y 이온이 스펙트럼에서 어떻게 구별되는지 궁금합니다.


MS/MS 스펙트럼에서 b 또는 y 이온 시리즈의 연속 피크 간의 차이를 통해 시리즈/펩티드를 만드는 아미노산을 결정할 수 있습니다. 그들 중 하나는 순서를 제공하기에 충분해야 합니다. 그러나 질량 분석기에서 얻은 MS/MS 스펙트럼은 조각 유형을 알려주지 않습니다. 따라서 y 또는 b 이온 시리즈를 식별하려면 약간의 전문 지식과 트릭이 필요합니다. 예를 들어: 트립신에 의해 소화된 샘플을 분석하는 경우 C-말단 잔기는 K 또는 R이 됩니다. 따라서 147이 K를 나타내는 경우 또는 175가 R을 나타내는 경우 Y1 이온을 찾을 수 있습니다. 또한 Y 이온은 다음과 같은 경향이 있습니다. 스펙트럼에서 가장 높은 강도의 피크가 됩니다. 이에 대한 더 유용한 정보는 훌륭한 튜토리얼이 있습니다: http://www.ionsource.com/tutorial/DeNovo/DeNovoTOC.htm.

또한 실제로 모든 b 또는 y 이온 피크를 얻는 경우는 거의 없으며 종종 누락된 피크가 있습니다. 이러한 이유로 하나의 간격이 다른 것으로 채워질 수 있도록 b 및 y 이온 시리즈를 모두 갖는 것이 유용합니다. 이것은 데노보 시퀀싱을 다룰 때뿐만 아니라 보다 일반적인 산탄총 단백질체학 실험에서도 유용합니다. 일반적인 산탄총 단백질체학 실험에서 펩타이드 검색 엔진으로 질량 분석 데이터를 검색합니다. 이들은 실험에 사용된 프로테아제의 특이성을 기반으로 인 silico 분해된 단백질 서열 데이터베이스를 사용하고 생성된 펩티드 서열 검색 엔진에서 예측된 MS/MS 스펙트럼의 라이브러리를 만드는 소프트웨어입니다(이것은 단편화에 의해 수행됩니다. 펩타이드 백본을 따라 모든 가능한 b 및 y 이온을 나열). 그런 다음 이러한 예측된 스펙트럼을 관찰된 스펙트럼과 일치시켜 관찰된 스펙트럼을 생성할 수 있는 펩티드 서열을 예측합니다. 다시 말하지만, 예측된 스펙트럼에 존재하는 모든 피크가 관찰된 스펙트럼에서 발견되는 것은 아닙니다. 따라서 b 및 y 이온 시리즈의 이온을 모두 갖는 것이 가장 좋습니다. 관찰된 스펙트럼과 예측된 스펙트럼 간에 일치하는 이온이 많을수록 식별 점수와 신뢰도가 높아집니다.


단백질 이온의 탠덤 질량 분석에 의한 막 단백질 식별

단백질체 분석에서 단백질을 식별하는 가장 일반적인 방법은 단백질 분해 단편의 질량 분광 분석에 의해 결정된 짧은 서열 세그먼트("태그")를 사용하는 것입니다. 이 접근 방식은 구형 단백질과 막에 걸쳐 있는 α-나선 사이에 상당한 극성 세그먼트가 있는 막 단백질에 효과적이지만 프로테아제 절단 부위가 드물거나 없는 다른 소수성 단백질에는 효과가 없습니다. 유기 용매에서 소수성 단백질을 정제하는 방법을 개발하고 아르곤과의 충돌 유도 해리에 의해 이러한 단백질의 이온을 단편화함으로써 많은 막 단백질의 부분 서열이 수동 검사로 쉽게 추론될 수 있음을 보여주었습니다. 작은 단백지질(1-4개 막횡단 α-나선)의 스펙트럼은 일반적으로 내부 아미드 절단에서 발생하는 단편 이온에 의해 지배되며, 이로부터 내부 서열을 얻을 수 있는 반면, 더 큰 막 단백질(5-18개 막횡단 α-나선)의 스펙트럼은 종종 N- 및/또는 C-말단 부분에서 조각 이온을 포함하여 해당 영역에서 서열을 생성합니다. 예를 들어 이러한 기술을 사용하여 우리는 미토콘드리아 내막에서 미토콘드리아 내막에서 단백질체 연구에서 탐지되지 않은 풍부한 기능의 단백질을 확인했으며 미토콘드리아 DNA에 암호화된 13개 단백질 중 10개에서 서열을 생성했습니다. 여기에는 분석할 45개의 하위 단위 중 마지막인 복합 I의 ND6 하위 단위가 포함됩니다. 절차는 예를 들어 기체 상태에서 부분적으로 접힌 상태로 남아 있을 수 있는 큰 막 단백질의 내부 영역의 단편화를 유도하기 위해 새로 도입된 단백질 이온 해리 방법을 사용하여 추가로 개발될 가능성이 있습니다.

게놈에 암호화된 단백질의 3분의 1은 소수성 막 단백질이며 질량분석법에 의한 분석은 친수성 단백질의 분석보다 어렵다. 많은 어려움은 소수성 및 질량 분광 분석에 적합한 형태로 막 단백질을 정제하는 절차의 부족으로 인해 발생합니다. 일반적으로 세제는 막 단백질을 추출하고 정제하는 데 사용되지만 MS에서 사용되는 단백질 이온화 방법과 호환되지 않으므로 분석을 수행하기 전에 정제된 단백질에서 제거해야 합니다(종종 유기 용매에서 크로마토그래피). 1-3). 대안적인 접근법은 유기 용매에서 막 단백질을 직접 추출하고 분별하는 것입니다(3-5).

단백질 질량의 측정은 번역 후 변형의 존재 여부는 탐지할 수 있게 해주지만, 단백질 분석에서 요구되는 바와 같이 서열 데이터베이스에서 단백질을 식별하는 신뢰할 수 있는 수단을 제공하지 않습니다. 일반적으로 단백질 분해 펩티드의 질량 분광 분석에 의해 얻은 단백질 서열의 짧은 부분(서열 태그)이 이러한 목적으로 사용됩니다(6). 이 방법은 나선과 말단 사이에 상당한 극성 세그먼트가 있는 구형 단백질 및 막에 걸쳐 있는 단백질로부터 부분 서열을 생성하는 매우 효과적인 수단을 제공하지만, 프로테아제 절단 부위가 드물거나 완전히 없습니다. 구형 단백질에 적용된 "하향식" 시퀀싱으로 알려진 또 다른 접근법은 아르곤과 충돌 유도 해리(CID)에 의해 손상되지 않은 단백질 이온을 단편화하고 단편 이온 스펙트럼에서 부분 서열을 추론하는 것입니다(7-9). 이러한 스펙트럼은 복잡하며 종종 해석을 위해 이온 사이클로트론 공명 및 푸리에 변환 기능이 있는 선형 이온 트랩 질량 분석기와 같은 고해상도 기기를 사용하여 조각 이온 동위원소를 분리하고 동위원소에서 관련 전하 수를 결정해야 합니다. 간격(9, 10). 이 계측 비용으로 인해 이러한 기술에 대한 액세스가 제한됩니다.

하향식 시퀀싱 접근 방식은 분자 질량 범위 3-8 kDa의 몇 가지 작은 막 단백질, 즉 소 미토콘드리아 시토크롬 산화효소(4)의 소단위 VIIc 및 VIII, ATP 합성효소(11-13)의 소단위 c에도 적용되었습니다. , 및 시토크롬의 소단위 NS 6f 엽록체와 남세균(3). 탠덤 질량 스펙트럼은 사중극자 또는 비행 시간 분석기가 있는 기기에서 CID에 의한 단백질 이온의 단편화에 의해 생성되었습니다. 그것들은 다소 간단했고 수동으로 해석할 수 있었습니다. 그러나 온전한 이온 스펙트럼의 생성에 적합한 형태로 정제된 다양한 막 단백질에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 지금까지 막 단백질의 직렬 질량 분석에 대한 체계적인 연구가 수행되지 않았습니다. 여기에 설명된 대로, 우리는 크로마토그래피에 의해 소수성 막 단백질을 가용화하고 분별하는 절차를 개선했습니다. 우리는 CID에 의해 손상되지 않은 단백질 이온을 단편화하여 막 단백질의 분자 질량 측정을 확장했습니다. 우리는 구형 단백질의 CID에서 발생하는 복잡한 조각 이온 스펙트럼(7)과 달리 1~18개의 막횡단 α-나선(TMH)을 포함하는 많은 막 단백질의 조각 이온 스펙트럼이 비교적 단순하고 수동 검사로 쉽게 해석할 수 있습니다. 따라서 미지의 막 단백질을 식별하는 데 적합한 태그를 제공합니다.


관련 데이터

하향식 및 상향식 질량 분석법은 기체상 단편을 생성하고 이를 사용하여 단백질을 식별할 수 있습니다. 또한 하향식 방법은 단백질 자체의 질량과 그에 따른 추가 구조 정보를 제공할 수 있습니다. 하향식 방법의 개념적 이점에도 불구하고 시장 점유율 이점은 보다 강력한 샘플 준비, 단편화 및 데이터 처리 방법의 결과로 상향식 방법에 속합니다. 여기에서 하향식 질량 분석을 위한 개선된 단편화 및 데이터 처리 방법을 보고합니다. 특히 노즐-스키머 해리의 변형인 깔때기-스키머 해리의 사용을 보고하고 전자 포획 해리와 성능을 비교합니다. 또한 통합된 하향식 MS 2 검색 기능과 상향식 및 하향식 검색을 모두 수행할 수 있는 최초의 검색 엔진이 포함된 Mascot의 확장 버전인 BIG Mascot도 선보입니다. BIG Mascot을 사용하여 1) 온전한 단백질 MS 1만을 사용하여, 2) MS 2만을 사용하고, 3) MS 1과 MS 2의 조합을 사용하여 단백질을 식별하는 능력을 시연했습니다. 우리는 단백질 Cu/Zn-superoxide dismutase의 13개 근위축성 측삭 경화증 관련 변이체를 포함하여 광범위한 질량을 가진 단백질을 정확하게 식별하고, 티로글로불린을 식별하여 하향식 단백질 식별의 질량 상한을 669kDa로 확장했습니다.

온전한 단백질의 이온화 및 검출은 20년 동안 가능했습니다(1, 2). 온전한 단백질 단편화(3𠄹) 및 데이터베이스 검색(10�) 방법의 개발과 결합된 이 돌파구는 단백질 분석의 하향식 질량 분석 접근법(13�)을 발생시켰습니다. 하향식 단백질체학은 단백질 변이체 및 번역 후 변형(PTM) 1 특성화(14, 20, 21) 영역에서 탁월하지만 포괄적인 단백질 식별은 개선해야 할 영역입니다(22�). 하향식 proteomics는 일반적으로 겔 내 분해(25)와 같은 시료 준비 기술의 부족, 펩타이드의 충돌 활성화 해리(CAD)와 같은 강력한 단편화 기술의 부족(26), Mascot(28), Sequest(29), Protein Prospector(30) 및 Peptide Search(31)를 포함한 모든 인기 있는 상향식 소프트웨어(27)와 하향식 MS 데이터의 호환성. 이 분야의 최근 개선 사항은 다음과 같습니다. 1) 하향식 분석과 호환되는 분리 기술(18, 32) 2) 노즐-스키머 해리(3, 33�), 전자 전달 해리(7, 8)를 포함한 단편화 기술 , 사전 접힘 해리(9) 및 활성화된 이온 전자 포획 해리(ECD)(5)는 하향식 방법에 대해 단백질 질량 상한을 229kDa로 확장(9) 및 3) 모든 바텀과 같은 고급 검색 엔진 최대 소프트웨어 ProSight PTM(11, 12, 36)은 Xcalibur 소프트웨어 제품군(Thermo Finnigan, San José, CA) 내에서 포괄적인 MS 데이터베이스와 함께 개발 및 통합되었습니다.

여기에서 우리의 목표는 (i) 하향식 MS 2 검색 기능을 통합하는 Mascot의 확장 버전을 개발하는 것을 돕고 (ii) 검색 감도와 선택성을 추론하는 것입니다. 여기에서 상향식 및 하향식 MS 2 검색을 모두 수행할 수 있는 최초의 범용 검색 엔진인 BIG Mascot을 소개합니다. Mascot은 확률 기반 채점 방식(28), 우수한 성능(37, 38) 및 빠른 작동 알고리즘으로 인해 가장 널리 사용되는 데이터베이스 검색 엔진 중 하나입니다. 그러나 Mascot을 하향식 작업 흐름에 적용하는 것은 상업적으로 이용 가능한 버전이 16kDa의 전구체 이온 질량 제한을 갖기 때문에 심각하게 제한됩니다. 최대 110kDa의 전구체 이온을 허용하도록 수정된 BIG Mascot이라고 하는 Mascot 버전을 사용하여 손상되지 않은 단백질 MS 1 또는 MS 2 자체가 많은 단백질을 식별하는 데 충분한 정보를 제공함을 보여줍니다. 그러나 돌연변이 또는 PTM을 포함한 단일 단백질의 변이체를 식별하려면 온전한 단백질과 단편 모두의 질량이 필요합니다. 마지막으로 단일 단계 분석을 사용하여 단백질 티로글로불린을 식별함으로써 손상되지 않은 단백질 식별 질량을 이전 한계인 229kDa(9)를 넘어 669kDa로 확장합니다.


질량 분석법으로 단백질의 서열을 결정하려면 B 이온과 Y 이온이 모두 필요합니까? - 생물학

University of Texas at Austin, Austin, TX 78712, USA 화학과
이메일: [email protected]

b 미국 텍사스주 오스틴에 있는 텍사스대학교 약학대학 화학생물학 및 의약화학부서 78712, USA
이메일: [email protected]

c Miami University, Oxford, OH 45056, USA 화학 및 생화학과

d Wesleyan University, Middletown, CT 06459, USA 화학과

추상적 인

우리는 리간드 또는 돌연변이에 의한 교란 시 뉴델리 메탈로-β-락타마제(NDM)의 구조적 변화를 특성화하기 위해 자외선 광해리(UVPD)와 함께 변성 및 비변성 용액 조건에서 질량 분석법(MS)을 사용합니다. 조각 이온의 풍부함과 분포의 변화를 매핑하면 단백질 전체의 구조적 변경을 민감하게 감지할 수 있습니다. 3가지 공유 억제제의 결합이 특성화되었습니다: 펜타플루오르페닐 에스테르, 영형-아릴옥시카르보닐 히드록사메이트, 및 엡셀렌. 처음 두 개의 억제제는 Lys211을 수정하고 dizinc 결합을 유지하지만 pentafluorophenyl ester는 선택적이지 않습니다(Lys214 및 Lys216도 수정됨). Ebselen은 유일한 Cys(Cys208)와 반응하여 활성 부위에서 Zn2를 방출합니다. 각 억제제에 대해 기본 UVPD-MS는 기질 결합 베타-헤어핀 루프의 폐쇄, 공유적으로 변형된 잔기의 식별, 효소의 금속화 상태 보고 및 ebselen의 경우 동시 검출을 가능하게 했습니다. 단백질의 C-말단에서 부분적 장애의 유도 관찰. 기본 UVPD-MS가 구조적 변화와 금속화 상태를 고감도로 추적할 수 있기 때문에 이 방법을 사용하여 NDM 임상 변이체에서 발견된 돌연변이의 영향을 평가했습니다. NDM-4(M154L) 및 NDM-6(A233V)에 의해 도입된 변화는 별도의 상호작용 네트워크를 통해 직접적인 아연 리간드로 전파되는 것으로 밝혀졌으며, NDM-15(M154L, A233V)에서 이러한 두 돌연변이의 조합은 다음과 같은 부가적인 결과를 초래합니다. 그리고 추가적인 구조적 변화. UVPD-MS의 통찰력은 먼 돌연변이가 이 항생제 내성 결정인자의 진화에서 아연 친화력에 어떻게 영향을 미치는지 설명하는 데 도움이 됩니다. UVPD-MS는 리간드 결합, 구조적 변화 및 NDM의 금속화 상태를 동시에 보고할 수 있는 강력한 도구로, 프로브하기 어려운 것으로 입증된 리간드 인식 및 임상 변이체의 구조적 측면을 드러냅니다.


결과 및 논의

이동 양성자 가설은 기체상 이온화 동안 펩타이드의 양성자가 주로 분석물의 기본 부위에 의해 좌우된다는 것입니다. 따라서 단일 염기성 아미노산을 포함하는 전형적인 트립신 펩티드는 이중으로 하전됩니다(두 번째 양성자는 N-말단의 1차 아민에 고정됨). ESI-MS를 사용하여 화학적으로 합성된 펩타이드 EPGLCTWQSLR을 하이브리드 이온 트랩-Orbitrap 질량 분석기에 직접 주입하고 그림 1(A)와 같이 이중으로 하전된 전구체를 관찰했습니다. 이동 양성자 가설에 따르면, 트립신 펩티드의 N-말단에 Arg를 추가하면 이중 및 삼중으로 하전된 전구체가 생성될 수 있습니다. [M+2H + ] 2+ 이온의 형성은 두 염기성 아미노산 모두에서 양성자를 격리함으로써 합리화되는 반면, [M+3H + ] 3+ 이온은 N-말단의 1차 아민을 통해 양성자를 추가로 확보함으로써 합리화됩니다. . 실제로 REPGLCTWQSLR을 하이브리드 이온 트랩-Orbitrap 질량 분석기에 직접 주입하면 그림 1(B)와 같이 [M+2H + ] 2+ 및 [M+3H + ] 3+ 이온이 생성됩니다. 또한, 3중으로 하전된 전구체 이온은 후속 ETD를 위해 선택될 수 있습니다. 펩타이드 서열에 Pro 잔기가 있음에도 불구하고 완전한 c-단편 이온 사다리가 완전한 y-단편 이온 사다리 및 여러 다른 생성 이온과 함께 생성된 MS/MS 스펙트럼에서 관찰되었습니다(그림 1(C) 참조). . 따라서, 아르기닐화는 비교적 짧은 펩티드의 ETD 단편화를 허용하고 생성된 MS/MS 스펙트럼은 펩티드의 명확한 할당을 위해 적어도 2x 서열 적용 범위를 포함합니다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 proteomics에 대한 arginylation의 적용을 더 추구하고 yATE1 효소의 견고성을 결정하기로 결정했습니다.

YATE1의 효소 동역학

아르기닐화는 아미노아실화된 tRNA Arg 및 N-말단 산성 아미노산이 있는 (폴리)펩티드의 두 가지 기질을 포함하는 효소 반응입니다(그림 2(A) 참조). 10 Michaelis-Menten 속도 상수를 결정하려면 사카로마이세스 세레비지애 arginyl-tRNA 단백질 트랜스퍼라제 1(yATE1), 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석기(MALDI-TOFMS) 및 에틸(-D5) 표지된 펩타이드 표준(짧은 펜타듀테로 방식 나머지 원고). 11, 13, 14 MALDI-MS는 본질적으로 비정량적입니다. 즉, 분석 물질에서 관찰된 신호는 시료 내 분석 물질의 양과 잘 관련이 없습니다. 펜타듀테로 방식 내부 Cys를 포함하는 기질 및 제품 펩타이드의 차등 라벨링을 기반으로 합니다. 13, 14 기질 펩타이드 EPGLCTWQSLR은 브로모에탄-D5를 사용하여 표지되었고, 그 결과 중수소화 NS-에틸시스테인(무거운 기질, m/z 1323). 서열이 있는 생성물 펩타이드 NSEPGLCTWQSLR은 동위원소로 가벼운 브로모에탄을 사용하여 표시되었으며 참조 표준으로 사용되었습니다(가벼운 제품, m/z 1474). 둘 다 무거운 기질 그리고 가벼운 제품 아르기닐화 반응에 첨가하고, 분취량을 시간의 함수로 취하고, TFA로 켄칭하고, 질량 스펙트럼 분석을 위해 t-플레이트에 직접 스폿팅하였다. 알려진 기질 및 생성물 펩타이드와의 낮은 복잡성 펩타이드 혼합물로 인해 m/z 값, MALDI 스포팅 전에 크로마토그래피 분리가 필요하지 않았습니다. 그림 2(B)는 기본 MALDI 데이터의 예를 보여줍니다. 가벼운 제품 (m/z 1474)는 1로 일정하게 유지되는 반면, 무거운 제품 (m/z 1479) 시간의 함수로 증가합니다.

yATE1에 대한 Michaelis-Menten 속도 상수를 결정하기 위해 아르기닐화 반응을 현장에서 아미노아실화된 Arg-tRNA Arg를 재생하기 위한 아미노아실화 반응(자세한 내용은 실험 섹션 참조). 펩티드 생성물 외관 측정은 4.48μM에서 51.5μM 범위의 펩티드 기질 농도 범위에 걸쳐 수행되었으며, yATE1 및 tRNA Arg 농도는 일정하게 유지되었습니다. 초기의 함수로 플롯된 제품 외관 무거운 기질 농도 및 초기 속도 상수가 결정되었습니다. 초기 선속도의 종점은 6분으로 결정되었다. Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 모든 운동 곡선을 그리고 운동 매개변수를 계산했습니다. 브이최대 2.2 μM · min -1 , K로 계산되었습니다.미디엄 = 39.3μM 및 k고양이 = 초기 yATE1 정제에서 16.1분 –1입니다(표 1 및 그림 2(C) 참조). 이 실험에서 220pmol의 EPGLCTWQSLR(MW 1289.49)이 분당 또는 7분당 2㎍으로 전환됩니다. LC/MS 실험당 분석되는 펩타이드 혼합물의 일반적인 양은 2-5 µg이므로 이러한 효소 매개변수는 일반적인 단백질체 워크플로우와 호환되는 규모에서 아르기닐화의 적용을 추가로 추구하는 데 적합하다고 결론지었습니다.

기질 펩타이드 농도(μM) 초기 속도(μM min –1 ) 비율 상수
yATE1
4.48 0.243 ± 0.037 V최대 2.238
11.2 0.496 ± 0.170 케이미디엄 39.34
22.4 0.805 ± 0.210 케이고양이 16.08
51.5 1.271 ± 0.455 케이고양이/케이미디엄 0.408

13개의 화학적으로 합성되고 보정된 펩타이드로 아르기닐화 확장

NS 펜타듀테로 방식 MS1 기반 m/z MALDI-MS를 사용하여 값을 측정하고 라벨링을 위해 내부 Cys가 필요합니다. 더 복잡한 펩타이드 혼합물의 경우 MS1 m/z 값은 펩타이드 기질 및 제품을 명확하게 식별하기에 충분하지 않습니다. 또한 모든 펩티드가 내부 Cys를 포함하는 것은 아닙니다. 따라서 단일 펩타이드 기질 이상으로 아르기닐화를 적용하기 위해 N-말단 아스파르테이트 또는 글루타메이트를 사용하여 화학적으로 합성되고 아미노산 분석 보정된 펩타이드 13개를 선택했습니다. 이 13개의 기질 펩타이드는 효소 반응당 5~405pmol 범위의 다양한 농도로 아르기닐화되었으며 단일 90분 종말점은 ESI-LC/MS로 분석되었습니다(실험 섹션 및 지원 정보, 13-기질-펩타이드 28 참조). 기질 펩타이드의 N-말단에 대한 아르기닐 모이어티의 접합으로 인해, 역상 C18의 선형 구배에서 평균 10% 더 빠른 기질 펩타이드와 아르기닐화된 생성물 펩타이드 사이에 명확한 머무름 시간 이동이 있었습니다. 열. 전반적으로, 13개의 기질 펩타이드의 아르기닐화 반응은 5 및 45 pmol 기질 펩타이드에서 거의 정량적이었습니다. 아르기닐화 반응이 반응당 405 pmol의 펩티드로 챌린지되면 90분 후 아르기닐화 효율은 더 이상 정량적이지 않습니다(그림 3(A) 및 3(B) 참조). 예를 들어, 펩타이드 DAGVVCTDETR은 13.3분에 용리되고 아르기닐화된 버전은 11.7분에 용리됩니다. 전반적으로, 펩타이드는 매우 높은 수준의 아르기닐화를 갖는다(도 3(A)). 이는 동일한 조건에서 반응한 기질 펩티드 EAQISSAIVSSVQSK와 대조되는 것으로, 기질 펩티드의 많은 부분(23.3분에서 용리)이 여전히 반응하지 않은 경우입니다(그림 3(B)). 더 복잡한 샘플을 사용하여 이 기질 편향을 추가로 조사하기 위해 우리는 등몰 비율(바이알당 각각 5pmol)의 50개 단백질로 구성된 범용 단백질 표준 1(UPS1)의 단백질 분해 다이제스트를 사용하여 아르기닐화 반응을 수행했습니다.

프로테아제 소화 최적화 및 라벨링 편향 조사

아르기닐화에 적합한 기질 펩티드를 얻기 위해 Asp-N을 사용하여 UPS1 단백질을 분해하여 N-말단 아스파르테이트 또는 글루타메이트를 생성했지만 C-말단은 비특이적이었다. 단백질 분해 펩티드를 90분 동안 아르기닐화한 후 표준 C18 세척 절차를 사용하여 탈염했습니다. LC/MS를 사용하여 N-말단 아스파르테이트 또는 글루타메이트가 있는 149개의 펩티드가 아르기닐화되는 것으로 검출되었습니다. 산성 아미노산을 사용한 펩티드의 아르기닐화가 검출되지 않은 경우 Skyline 16을 사용한 MS1 이온 크로마토그램의 수동 검사는 이론값에 해당하는 기질 및 생성물 펩티드 전구체 이온 질량의 많은 쌍을 나타냈습니다(지원 정보, UPS1_AspN_digest 28 참조). . 어떤 경우에는 기질 펩타이드만 LC 구배에서 매우 일찍 용출되었습니다. 아르기닐화는 크로마토그래피 이동을 초래하므로(그림 3 참조), 일부 아르기닐화 펩티드가 사용된 C18 컬럼 물질에 결합하기에는 너무 극성일 수 있다고 가정합니다. 따라서 우리는 모든 기질 펩타이드가 아르기닐화되었으며 샷건 MS/MS 또는 크로마토그래피 성능의 확률적 샘플링 접근 방식이 아마도 일부 기질 펩타이드의 아르기닐화 버전에 대한 MS/MS 스펙트럼이 부족한 이유라고 결론지었습니다. 50개의 UPS1 펩타이드의 Asp-N 다이제스트를 조사한 결과 35개의 단백질만 검출되었음을 알 수 있습니다.

검출 가능한 단백질의 수를 증가시키기 위해 단일 Asp-N 프로테아제 분해는 이중 분해를 사용하여 추가로 최적화되었습니다. Lys-C. Lys-C 및 Asp-N의 이중 분해는 아르기닐화를 위한 기질 펩티드 및 C-말단 Lys가 있는 펩티드를 생성합니다. 또한, 이러한 펩티드는 아르기닐화되지 않은 펩티드와 아르기닐화된 펩티드의 MS/MS 단편화를 직접 비교할 수 있습니다. 따라서, UPS1 단백질 표준은 먼저 Lys-C를 사용하여 소화된 다음 Asp-N 소화를 사용하여 소화되었습니다. 생성된 펩티드 혼합물을 아르기닐화하고 펩티드를 LC/MS로 분석하였다. 후속 인 실리코 MS/MS 스펙트럼의 주석은 45개의 단백질에 대한 실험적 증거를 가져왔으며, 이는 모노 Asp-N 다이제스트보다 20% 증가한 것입니다. 펩타이드 수준에서 N-말단 산성 아미노산을 갖는 156개의 펩타이드가 검출되었다. 이들 펩티드의 대부분은 정량적으로 아르기닐화되었거나 아르기닐화 및 비-아르기닐화 형태가 모두 검출되었습니다(지원 정보, UPS1_LysC_AspN_digest 28 참조).

펩타이드 단편화에 대한 아르기닐화의 영향을 추가로 설명하기 위해 UPS1 Lys-C/Asp-N 이중 다이제스트에서 펩타이드를 선택했습니다. 그림 4(A)에서 볼 수 있듯이 펩타이드 DDHFLF 전구체 [M+2H + ] 2+ 이온은 주석이 달린 6개의 생성 이온으로 단편화됩니다. 그러나 펩타이드의 arginylation 시에는 N-말단에 하나의 아미노산만 추가되었음에도 불구하고 [M+2H + ] 2+ 전구체 이온 단편과 주석 이온의 수가 두 배로 증가하였다(Fig. 4(B)). 펩타이드. 그림 4(C)는 [DDTVCLAK+2H + ] 2+ 의 MS/MS 스펙트럼에서 2개의 Asp 잔기에 대한 향상된 절단 C-말단을 보여줍니다. 이 강화된 절단은 아르기닐화 시 극복되어 [RDDTVCLAK+2H + ] 2+ 이온의 보다 균형 잡힌 단편화를 초래합니다. 결과 MS/MS 스펙트럼은 b 및 y 조각 이온 사다리로 구성됩니다(그림 4(D)). 전구체 이온 단편화에 대한 아르기닐화의 기여를 설명하는 세 번째 예는 펩티드 EGVVGAVEK입니다. [EGVVGAVEK+2H + ] 2+ 전구체 이온 단편화는 주석이 달린 생성 이온이 거의 생성되지 않는 반면(그림 4(E)), 아르기닐화 시 완전한 b- 및 y-단편 이온 사다리에 주석이 달려 있습니다(그림 4(F)). ). 모든 MS/MS 스펙트럼은 전하 상태가 일치하므로 펩타이드 단편화에 대한 아르기닐화의 영향을 연구하는 것이 가능합니다. 아르기닐화되지 않은 펩타이드(그림 4(A), 4(C) 및 4(E))는 두 개의 양성자를 고정합니다. 하나는 N-말단의 1차 아민에, 다른 하나는 펩타이드 서열. 이것은 두 개의 양성자를 확보하는 아르기닐화 펩타이드(그림 4(B), 4(D) 및 4(F))와 대조되며, 둘 다 염기성 아미노산의 측쇄와 함께 존재합니다. 측쇄 격리 양성자는 펩타이드 백본의 더 확률적인 단편화를 허용하여 단편 이온 사다리를 생성합니다. 추가 양성자의 도입 시, 아마도 펩타이드의 N-말단의 1차 아민 상에, 생성 이온은 다시 불균일하게 분포된다. 펩타이드 EPISVSSEQVLK는 UPS1 이중 다이제스트 데이터세트에서 3회 검출되었습니다: 아르기닐화되지 않은 [M+2H + ] 2+(그림 5(A)), 아르기닐화된 [M+2H + ] 2+(그림 5(B)) 및 아르기닐화된 [M+3H + ] 3+ (도 5(C)). [EPISVSSEQVLK+2H + ] 2+ (그림 5(A))에서 가장 지배적인 생성 이온은 Val 사이의 펩티드 백본 절단에 의해 생성된 y7 +입니다.5 및 Ser6. 아르기닐화 시 [REPISVSSEQVLK+2H + ] 2+ 이온(그림 5(B))의 형성에서 Arg 및 Lys의 각 아미노산 측쇄는 양성자를 격리하여 b-단편 및 y의 고르게 분포된 단편화 패턴을 생성합니다. - 이온 트랩 CID 동안 이온 조각. 그러나 펩티드 N-말단의 1차 아민에 추가적인 양성자를 추가하면 [REPISVSSEQVLK+3H + ] 3+ 이온(그림 5(C))이 선호되는 위치에서 다시 단편화됩니다. Glu와 Gln 사이. 이러한 결과(및 지원 정보, UPS1_LysC_AspN_digest 28)에서 발견된 다른 결과로부터, 우리는 아르기닐화가 펩타이드 단편화를 강화하고 상대적으로 짧은 펩타이드의 검출을 허용한다는 결론을 내렸습니다.

펩타이드 수준에서 중간 사슬 아르기닐화가 감지되지 않음

N-말단 산성 아미노산이 ATE1의 기질일 뿐만 아니라 중간 사슬 Asp 또는 Glu가 측쇄 카르복실기를 통해 아르기닐화될 수 있다는 보고가 있습니다. 17, 18 펩타이드의 중간 사슬 아르기닐화를 테스트하기 위해 Mascot 오류 허용 검색 옵션(Matrix Science, London, UK)을 사용하여 UPS1 실험의 90분 종점 반응을 재분석했습니다. 예상치 못한 화학적 또는 번역 후 변형. 예상대로 추가 질량 +156.10(Arg 모이어티에 해당)은 N-말단 잔기에서만 검출되었지만 중간 사슬 잔기에서는 검출되지 않았습니다(지원 정보, error-tolerant-search.csv 28 참조). 우리는 단백질 수준에서 ATE1이 중간 사슬 산성 아미노산을 아르기닐화할 수 있다는 것을 배제할 수 없지만, 우리의 펩티드 수준 실험에서 yATE1은 N-말단 잔기만 아르기닐화했습니다.


MALDI-TOF 질량분석기

질량 분석법은 샘플이 전하를 띤 분자로 이온화되고 질량 대 전하 비율(m/z)을 측정할 수 있는 분석 기술입니다. MALDI-TOF 질량 분석기에서 이온 소스는 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization)이고 질량 분석기는 TOF(time-of-flight) 분석기입니다.

MALDI는 레이저가 작은 분자 매트릭스를 타격하여 분석물 분자를 단편화 또는 분해하지 않고 기체 상태로 만드는 소프트 이온화입니다. 일부 생체 분자는 너무 커서 가열하면 분해될 수 있으며 기존 기술은 거대 분자를 조각화하거나 파괴합니다. MALDI는 펩타이드, 지질, 당류 또는 기타 유기 거대 분자와 같은 생체 분자를 분석하는 데 적합합니다.

그림 1. MALDI에 의한 분석물의 이온화

그림 1에서 분석물은 일반적으로 전도성 금속으로 만들어지고 적용할 여러 다른 샘플에 대한 스폿이 있는 타겟이라고 하는 고체 표면에 침착된 매우 과량의 매트릭스 화합물에 포함되어 있습니다. 매우 짧은 레이저 펄스 후에 조사된 지점이 빠르게 가열되고 진동으로 여기됩니다. 매트릭스 분자는 시료 표면에서 에너지적으로 제거되어 레이저 에너지를 흡수하고 분석 물질 분자를 기체 상태로 운반합니다. 절제 과정에서 분석물 분자는 일반적으로 근처의 매트릭스 분자와 양성자화 또는 탈양성자화되어 이온화됩니다. 가장 일반적인 MALDI 이온화 형식은 분석 물질 분자가 단일 양전하를 운반하는 것입니다.

자외선(UV) 및 적외선(IR) 파장의 레이저가 모두 사용되지만 UV 레이저는 분석 MALDI에서 단연 가장 중요한 광원입니다. 이 중에서 질소 레이저와 주파수 3배 또는 4배 Nd: Yag 레이저가 대부분의 응용 분야에 사용됩니다. IR-MALDI는 Er:Yag 레이저가 지배하는 반면 TEA-CO2 레이저는 거의 사용되지 않습니다.

매트릭스의 첫 번째 기능은 본질적으로 분석물 분자를 서로 희석하고 분리하는 것입니다. 이것은 용매 증발과 동시에 고용체 형성 중에 발생합니다. 그런 다음 레이저 조사 시 에너지 흡수의 매개체 역할을 합니다. 올바른 매트릭스의 선택은 MALDI 성공의 열쇠입니다. 일반적으로 극성이 높은 분석 물질은 극성이 높은 매트릭스와 더 잘 작동하며 비극성 분석 물질은 비극성 매트릭스와 결합하는 것이 바람직합니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 다양한 매트릭스가 모색되어 널리 사용되어 왔다. 현재 가장 일반적으로 사용되는 매트릭스는 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid 및 2,6-dihydroxyacetophenone입니다.

표 1. UV-MALDI 매트릭스(Gross J. H., 2006)

화합물 두문자어 신청
니코틴산없음펩티드, 단백질
피콜린산아빠올리고뉴클레오티드, DNA
3-하이드록시피콜린산HPA, 3-HPA올리고뉴클레오티드, DNA
3-아미노피콜린산3-APA올리고뉴클레오티드, DNA
6-아자-2-티오티민ATT올리고뉴클레오티드, DNA
2,5-디히드록시벤조산DHB단백질, 올리고당
DHB 기반 혼합물DHB/XY 및 슈퍼 DHB단백질, 올리고당
3-아미노퀴놀린3-AQ올리고당
α-시아노-4-하이드록시신남산α-CHC, α-CHCA, 4-HCCA, CHCA펩티드, 더 작은 단백질, 트리아실글리세롤, 기타 수많은 화합물
4-클로로-α-시아노-신남산CLCCA펩티드
3,5-디메톡시-4-히드록시신남산단백질
2-(4-히드록시페닐아조)벤조산하바펩티드, 단백질, 당단백질, 폴리스티렌
2-메르캅토벤조티아졸MBT펩티드, 단백질, 합성 고분자
5-클로로-2-메르캅토벤조티아졸CMBT글리코펩티드, 포스포펩티드 및 단백질
2,6-디히드록시아세토페논DHAP글리코펩티드, 포스포펩티드, 단백질
2,4,6-트리하이드록시아세토페논고체 지지된 올리고뉴클레오티드
디트라놀(1,8,9-안트라세네트리올)없음합성 고분자
9-니트로안트라센9-NA풀러렌 및 유도체
벤조피렌없음풀러렌 및 유도체
2-[(2E)-3-(4-tert-부틸페닐)-2-메틸프로프-2-에닐리덴] 말로니트릴DCTB올리고머, 폴리머, 덴드리머, 소분자

비행 시간(TOF) 분석기

그림 2. TOF 분석기의 일반 회로도. (A) 라이너 TOF 분석기 (B) 반사기 TOF 분석기 (C) 이온이 라이너 TOF 분석기에서 필드 프리 영역을 통과하는 시간의 유도 프로세스.

그림 2에서 볼 수 있듯이 TOF의 기본 원리는 서로 다른 m/z의 이온이 알려진 길이의 무장 드리프트 경로를 따라 비행하는 동안 시간에 따라 분산된다는 것입니다. 모든 이온이 동시에 또는 최소한 충분히 짧은 시간 간격 내에서 여행을 시작한다면 가벼운 이온이 무거운 이온보다 검출기에 더 일찍 도착합니다.

이론적으로 모든 이온에는 동일한 초기 운동 에너지가 주어집니다. 따라서 자기장 없는 영역을 따라 표류한 후 그 당시 검출기에서 동일한 m/z의 이온이 나타납니다. 그러나 실제로 펄스는 모든 이온에서 동일한 강도로 느껴지지 않으므로 동일한 m/z 값의 모든 이온이 이상적인 속도에 도달하는 것은 아닙니다. 이 문제를 해결하기 위해 드리프트 영역 끝에 반사가 적용되는 경우가 많습니다. 리플렉트론은 일반적으로 약간 변위된 각도로 비행 튜브를 따라 이온을 다시 밀어낼 수 있는 고전압의 일련의 링 전극으로 구성됩니다.

다른 운동 에너지의 이온은 반사체에서 반대 방향으로 방출되기 전에 다른 깊이로 반사체를 관통합니다. 더 많은 운동 에너지를 운반하는 더 빠른 이온은 더 느린 것보다 더 긴 경로를 이동하므로 덜 에너지를 운반하는 느린 이온보다 반사체 내에서 더 많은 시간을 보냅니다. 이러한 방식으로 검출기는 (약) 동일한 시간에 동일한 질량의 이온을 수신합니다. 따라서 TOF 질량 분석기를 위한 이 설계는 분해능을 크게 향상시켰습니다. 그러나 리플렉트론 TOF 분석기는 전기장에서 살아남을 만큼 충분히 안정적이지 않은 분석물에는 적합하지 않습니다.

MALDI-TOF 질량분석법의 과정

그림 3. MALDI-TOF 질량분석법(Clark A. E., . 2013)

분석물은 일부 용매에 약 0.1mg/ml 이상 용해되어야 합니다. 그리고 매트릭스를 용해하여 포화 용액 또는 약 10mg/ml의 농도를 생성합니다. 그런 다음 분석물의 용액을 매트릭스의 용액과 혼합합니다. 최적화된 MALDI 스펙트럼을 위해, 매트릭스 대 분석물의 몰비는 일반적으로 1000:1에서 100,000:1 범위에 있도록 조정됩니다. 그런 다음 혼합물을 분석을 위해 금속 타겟 플레이트에 스폿팅합니다. 건조 후, 샘플과 매트릭스의 혼합물은 공결정화되고 매트릭스에 매립된 샘플의 고체 침전물을 형성합니다. 플레이트는 이후 MALDI-TOF 기기에 로드되고 각 시스템과 관련된 소프트웨어로 분석됩니다. MALDI는 샘플과 매트릭스 모두의 승화 및 이온화로 이어집니다. 생성된 이온은 TOF 분석기를 통해 m/z에 따라 분리되며, 이러한 이온의 스펙트럼 표현은 MS 소프트웨어에 의해 생성 및 분석되어 MS 프로파일을 생성합니다.

MALDI-TOF 질량분석기의 적용

온전한 질량 측정은 단백질의 정확한 분자량이 온전한 구조를 나타낼 수 있기 때문에 단백질 특성화에 기본적이고 중요합니다. 연성 이온화 기술인 MALDI는 다른 이온화 방법으로 이온화될 때 깨지기 쉽고 단편화되는 경향이 있는 단백질에 적합합니다. MALDI-TOF MS의 성능은 버퍼 성분, 세제 및 오염 물질의 영향을 덜 받습니다. 또한 시퀀스 검증을 위해 충분한 정확도(≤ 500ppm)로 온전한 단백질 질량 측정이 가능합니다. 단백질 분해 후, MALDI-TOF MS는 또한 펩티드 질량 지문에 의한 추가 1차 서열 확인을 위해 얻은 펩티드를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

MALDI-TOF 질량 분석기는 작동이 간단하고 질량 정확도가 높으며 분해능과 감도가 높습니다. 따라서 2차원 겔 전기영동(2-DE)과 함께 자주 사용되는 펩티드 질량 지문이라는 방법으로 간단한 혼합물에서 단백질을 식별하기 위해 단백질체학에서 널리 사용됩니다. 이 접근법에서 펩타이드는 트립신과 같은 서열 특이적 효소로 관심 단백질을 소화하여 생성됩니다. 그런 다음 MALDI-TOF 질량 분석기로 펩티드를 분석하여 펩티드 질량을 얻습니다. 실험 질량은 동일한 서열 특이적 프로테아제를 가진 주어진 유기체의 이론적인 펩티드 질량을 포함하는 데이터베이스와 비교됩니다.

반사체가 장착된 MALDI-TOF 질량 분석기는 비행 중에 자발적으로 분해되는 전구체 이온에서 생성된 조각 이온을 분석할 수 있습니다. 이러한 이온을 일반적으로 준안정 이온(metastable ion)이라고 하며, 이온 소스와 리플렉트론 사이의 무전계 영역에서 분해되는 과정을 일반적으로 PSD라고 합니다. PSD 조각 이온은 리플렉트론에 들어가기 전에 필드 프리 영역 내에서 형성됩니다. PSD 조각 이온은 펩타이드와 단백질의 기본 구조에 대한 매우 풍부하고 효과적인 구조 정보를 제공하는 PSD 질량 스펙트럼을 형성하기 위해 반사기 전압을 지속적으로 변경하여 검출기에서 분리, 수집 및 기록할 수 있습니다. proteomics 연구에서 일부 2DE 분리 단백질 샘플은 PMF로 식별할 수 없거나 식별 결과가 명확하지 않습니다. PSD 시퀀싱 기능은 이러한 단백질의 식별에 적용될 수 있습니다. 데이터베이스 검색과 결합된 PSD 분광법을 사용하여 단백질을 신속하고 높은 특이도로 식별할 수 있습니다.

분자생물학 기술 및 안티센스 핵산 약물 기술의 발달로 점점 더 많은 올리고뉴클레오티드 단편이 합성되어 프라이머, 프로브 및 안티센스 약물로 사용됩니다. 합성이 완료되었는지 여부와 합성된 시퀀스가 ​​올바른지 여부를 결정하려면 이러한 단편을 신속하게 감지하는 것이 전적으로 필요합니다. MALDI-TOF-MS를 포함한 질량 분석은 이를 수행하는 가장 좋은 방법입니다. MALDI-TOF-MS를 사용한 올리고뉴클레오티드 분석은 전체 올리고뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 사용할 수 있는 간단하고 신속하며 정확하고 민감합니다.

MALDI-TOF는 MALDI 이미징 질량 분석기(MALDI-IMS)로 알려진 얇은 조직 섹션에서 직접 단백질을 프로파일링하고 이미징하는 데 사용할 수 있습니다. 분석 섹션에서 로컬 분자 구성, 상대적 풍부도 및 펩타이드 및 단백질의 공간적 분포에 대한 특정 정보를 제공합니다. MALDI-IMS는 조직의 세포와 분자의 무결성을 유지하면서 조직의 분자 이미징을 얻을 수 있는 단일 측정을 통해 생물학적 조직 섹션에서 여러 미지의 화합물을 동시에 분석할 수 있습니다.

MALDI-TOF 질량분석기는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 올리고뉴클레오티드 등과 같은 다양한 생체분자를 분석할 수 있습니다. 형성된 이온의 내부 에너지가 낮기 때문에 MALDI-TOF의 큰 장점은 소프트 이온화 과정을 통해 분석 물질의 단편화가 거의 없이 이온화된 분자를 관찰할 수 있어 분석 물질의 분자 이온을 식별할 수 있다는 것입니다. 혼합물 내에서. 또한 빠른 데이터 수집으로 사용 및 유지 관리가 간편합니다. MALDI-TOF 질량 분석을 성공적으로 수행하려면 적절한 매트릭스 물질을 선택하는 것이 중요합니다.

Creative Proteomics에서는 고급 MALDI-TOF 질량 분석 플랫폼을 기반으로 다음과 같은 다양한 서비스를 제공할 수 있습니다.

1. 총 J H. 질량 분석: 교과서. Springer 과학 및 비즈니스 미디어, 2006.
2. Boesl U. Time - of - Flight 질량 분석: 기본 소개. 질량 분석 리뷰, 2017, 36(1): 86-109.
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6. Kenny D J, Brown J M, Palmer M E, . 소스 붕괴 후 MALDI-TOF 분석에 대한 병렬 접근 방식. 미국 질량 분석 학회지, 2006, 17(1): 60-66.

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결과

정자 총 단백질 소화에서 펩티드 수준의 비교

본 연구의 목적은 정자 수용능력의 결과로 발생하는 인산화의 변화를 분석하는 것이었습니다. 이를 위해 꼬리 부고환 마우스 정자는 (+BSA, +HCO3 − ) 또는 지원하지 않음(𢄫SA, −HCO3 − ) 용량. 단백질 인산화의 차등 분석 시도에 필요한 요구 사항은 서로 다른 샘플 유형 간에 동일한 양의 단백질을 비교하는 것입니다. 용량화된(Cap) 및 용량화되지 않은(NCap) 부분 표본에 동일한 양의 단백질이 존재하는지 확인하고 두 샘플 모두 동일한 소화 조건을 거쳤는지 확인하기 위해 각 분해물에 대한 별도의 분석(Fisher 에스테르화 처리되지 않음) (Cap5 및 NCap5))는 LTQ-FT 질량 분석기에서 수행되었습니다. 마우스 고환에서 구성적으로 발현되는 핵 단백질의 트립신 펩티드에 해당하는 피크 면적(RDGFVTSKRKK m/z = 441.28) 및 트립신의 자가소화로 인한 펩티드(VATVSLPR m/z = 421.76)을 비교하여 각각 0.92 및 1.26의 비율을 갖는 것으로 밝혀졌습니다(그림 1). 이는 유사한 단백질 수준 및 소화 정도를 나타냅니다.

용량화되지 않은(A) 및 용량화된(B) 정자 총 단백질 분해물에서 확인된 펩타이드의 비교. 피크 m/z = 421.76은 MS/MS 분석을 통해 트립신의 자가소화로 인한 트립신 펩티드 VATVSLPR인 것으로 확인되었으며, m/z = 441.28은 MS/MS 분석을 통해 정자 핵 단백질의 트립신 펩타이드 RDGFVTSKRKK인 것으로 확인되었습니다. 정전용량 다이제스트와 정전용량 다이제스트 간의 피크 면적 비율은 각각 1.26과 0.92입니다.

단백질 소화에서 포스포펩티드 수준의 샘플 내 비교

고도로 복잡한 용량화 및 비용량화 용액 분해물로부터 인산화된 펩티드의 선택적 IMAC 농축은 산성 잔기(즉, 글루탐산 및 아스파르트산)가 고정된 철 원자에 결합하는 것으로 나타났기 때문에 문제가 될 것으로 예상되었습니다. 15 인산화되지 않은 산성 잔기 함유 펩타이드가 분석을 방해하는 것을 방지하기 위해 두 개의 개별 반응 세트에서 시약으로 표지되지 않은 또는 중수소로 표지된 메탄올을 사용하여 각 샘플의 펩티드 카르복실산을 해당 메틸 에스테르로 전환했습니다. 이것이 각 샘플에서 차등 포스포펩티드 발현의 후속 정량화에 중요했지만, 이러한 개별 반응은 차등 분석을 수행하기 전에 고려해야 하는 또 다른 변수를 추가했습니다. 각 반응이 동일한 정도로 진행되었는지 확인하기 위해 동일한 양의 각 샘플에 대해 Fisher 에스테르화를 두 가지 방법을 모두 사용하여 수행했습니다. NS0- 그리고 NS4-시약. 용량화 또는 비용량화(NCap(NS0 에스테르) 및 NCap(NS3 에스테르) 또는 캡(NS0 에스테르) 및 캡(NS3 에스테르))를 결합하고 위에서 설명한 IMAC-nRPLC-MS/MS 분석을 사용하여 분석했습니다. 칼슘 결합 티로신 인산화 조절 단백질(CABYR)(TKIpSIepSLK)의 트립신성 포스포펩티드에 해당하는 피크 면적 m/z = 603.79 (NS0 레이블) 및 606.81(NS3 레이블))은 두 샘플 유형에서 비교되었으며 비정전 샘플에서는 0.99, 정전식 샘플에서는 0.95의 비율로 발견되었습니다( 그림 2 ). 이러한 결과는 각각의 변형 반응에서 차등 표지가 동일한 정도로 진행되었음을 확인시켜 주었다. 중요하게도, 이러한 실험은 차등적으로 레이블이 지정되고 유사하지 않은 샘플 유형(NCap(NS0 에스테르) 대 캡(NS3 에스테르) 또는 NCap(NS3 에스테르) 대 캡(NS0 esters))를 비교하였다.

비용량화 다이제스트와 용량화 다이제스트의 샘플 내 비교. 동일한 양의 CH3 및 CD3 Fisher 에스테르화 용량화되지 않은(A) 및 용량화된(B) 정자 총 단백질 분해물의 조합에 대한 IMAC 분석에서 확인된 차등적으로 표지된 포스포펩티드 피크 면적의 비교. NS NS0/NS3 피크 비는 용량화되지 않은 샘플에서 0.99이고 용량화된 샘플에서 0.95였으며, 이는 유사한 용량화 상태로부터 CH3 및 CD3 Fisher 에스테르화된 샘플에서 이 펩티드의 동일한 양을 확인시켜줍니다.

포스포펩티드 식별을 위한 차등 동위원소 표지의 가치

phosphopeptide 스펙트럼에 대한 펩타이드 서열의 할당은 phosphoserine과 phosphothreonine 잔기가 온전한 펩타이드뿐만 아니라 CAD 동안 생성된 인산염 함유 단편에서 인산의 중성 손실을 나타낸다는 사실에 의해 종종 방해를 받습니다. 이온 트랩 내부의 불활성 욕조 가스와의 충돌의 결과로 백본을 따라 조각화됩니다. 16 이로 인해 서열 정보 이온에 해당하지 않는 피크에 의해 지배되는 혼잡한 MS/MS 스펙트럼이 생성되고 이는 가짜 펩타이드 서열 할당을 초래합니다. 이 연구에서 따랐던 Fisher 에스테르화 프로토콜의 편리한 결과는 동일하지만 차등적으로 표지된 포스포펩티드에 대해 획득한 MS 및 MS/MS 데이터의 비교가 적절한 서열을 할당하는 데 현저한 유용성이 있다는 것입니다. 첫째, 각 포스포펩티드의 동위원소 패턴을 육안으로 검사하면 전하 상태가 나타나며, 두 개의 다른 동위원소 외피 사이의 질량 이동을 비교하여 펩티드의 산성 잔기 수를 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 3에서 볼 수 있듯이 12C와 13C 동위원소 간의 0.5amu 차이 m/z = 603.79 및 m/z = 606.81은 이들 펩타이드가 모두 +2의 전하를 가짐을 나타냅니다. 또한 3.02 amu의 질량 이동은 m/z = 603.79 및 m/z = 606.81은 이 펩타이드가 C-말단(항상 존재)에 하나와 글루탐산 또는 아스파라긴산 잔기에 하나, 이렇게 2개의 변형을 포함하고 있음을 보여줍니다. 두 관찰 모두 TKIpSIepSLK의 할당된 서열과 일치하며, 이는 각 펩티드의 MS/MS 스펙트럼을 비교하여 추가로 확인할 수 있습니다. 그림 4에서 알 수 있듯이 b- 및 y-형 이온은 각각의 질량 이동을 기반으로 각 스펙트럼에서 쉽게 선택됩니다. y-이온은 카르복시 -말단, b-이온은 변형된 산성 잔기를 포함할 때만 이동을 나타냅니다. 이러한 방식으로 FT-ICR 분석을 통해 얻은 정보(정확한 질량 및 카르복실기 수)는 MS/MS 분석에서 제공하는 보완 정보(단편 이온, 서열 태그 및 중성 손실로 인한 인산화 잔기의 최소 수)와 결합될 수 있습니다. 인산)을 사용하여 정확한 펩타이드 서열을 신속하게 식별할 수 있습니다.

단일 스캔에서 이중 하전된 중수소화 및 비중수소화 TKIpSIepSLK 펩타이드의 동위원소 분포(두 펩타이드 모두 HPLC 컬럼에서 용리됨). LTQ-FT 기기의 검출기로 FT-ICR 셀을 사용하여 제공된 정확한 질량 측정(이 경우 5ppm)은 이러한 펩타이드가 이중으로 하전됨(개별 동위원소 봉투 내에서 0.5 amu의 질량 차이) 및 관련(질량 동위원소 봉투 사이의 3.020mu의 차이). 펩타이드에 포함된 카르복실기의 수는 그림 3에 표시된 식을 사용하여 결정되었습니다. 질량 차이는 관련 중수소화 및 비중수소화 펩타이드의 단일 동위원소 질량의 차이를 나타내고, 전하 상태는 12 C 사이의 질량 차이의 역수를 나타냅니다. 동일한 전하 엔벨로프에서 13C 피크.

트립신 중수소화(A) 및 비중수소화(B) 포스포펩티드 TKIpSIepSLK의 MS/MS 스펙트럼. b 및 y 유형의 이온에 대한 예측된 단일 동위원소 질량은 각각 시퀀스 위와 아래에 표시됩니다. 스펙트럼에서 관찰된 이온은 밑줄을 긋고 인산을 잃는 이온은 굵은 글씨로 표시합니다. 레이블 Δ는 b 또는 y 유형의 해당 이온에서 인산이 손실되었음을 나타냅니다. K-OMe는 Fisher 에스테르화 C-말단 라이신을 나타내고 𠇎”는 Fisher 에스테르화 글루탐산을 나타냅니다. 중수소화 스펙트럼에서 +3 amu만큼 이동된 b 및 y 이온의 질량은 파란색으로 표시되는 반면 +6 amu만큼 이동된 이온은 빨간색으로 표시됩니다.

정자 총 단백질 소화에서 포스포펩티드의 식별

각 샘플 유형이 동일한 양의 단백질을 함유하는 것으로 결정되고 대체 라벨링 실험이 이 비율을 방해하지 않았음을 확인한 후, 유사하지만 동일하지는 않은 두 가지 실험을 사용하여 포스포펩티드 발현의 차등 분석을 수행했습니다. 첫 번째 실험에서 무거운 동위원소로 표지된 용량화 단백질 분해물을 가벼운 동위원소로 표지된 용량화되지 않은 분해물(Cap (NS3 에스테르) 대 NCap(NS0 에스테르)), 두 번째 실험에서는 NS3 수정된 용량이 없는 샘플은 다음과 결합되었습니다. NS0 수정 용량 샘플(Cap(NS0 에스테르) 대 NCap(NS3 에스테르)). 그런 다음 이러한 결합된 샘플을 포스포펩티드 농축을 위해 IMAC에 적용하고 LTQ-FT 하이브리드 선형 이온 트랩-푸리에 변환 질량 분석기에서 독립적으로 분석했습니다. 각 분석에 대한 총 이온 크로마토그램(TIC)은 놀라울 정도로 유사했지만 예상대로 피크 쌍의 상대적 강도는 분석 간에 역전되었습니다( 그림 5 ). 각 크로마토그래피 기울기 동안 획득한 MS 스펙트럼을 시각적으로 비교하여 수백 개의 포스포펩티드 쌍을 식별했지만 이러한 쌍을 분석하고 차이를 자동으로 식별하도록 설계된 소프트웨어는 아직 완성되지 않았습니다. 대신, 모든 MS/MS 스펙트럼은 해당 MS/MS 시퀀스의 수동 해석에 의해 확인되었습니다. 중요하게도, 확인된 모든 포스포펩티드의 모든 카르복실산 함유 잔기가 수정되었으며, 이는 우리의 유도체화 방법이 완료되어 IMAC 컬럼에 대한 카르복실산 함유 펩티드의 결합을 효과적으로 방지했음을 시사합니다.

차등적으로 표지된 트립신 인산펩티드 TKIpSIepSLK 및 YLpYAMR에 대한 총 이온 크로마토그램 및 단일 이온 크로마토그램 NS0 무능력/NS3 용량 분석(A) 및 NS0 용량/NS3 무능력 분석(B). 용량화된 샘플의 펩타이드에 대한 피크 면적은 각 분석에서 더 크며, 이는 이 현상이 샘플마다 다르며 차등 라벨링의 인공물이 아님을 보여줍니다.

단백질 소화에서 포스포펩티드 수준의 샘플 간 비교

상응하는 중수소화 및 비중수소화 포스포펩티드의 피크 비율을 사용하여 각각의 샘플에서 각 펩티드의 상대적 수준을 유도하였다. 우리는 비정전 샘플에서 확인된 포스포펩티드와 비교하여 정전용량 샘플에서 확인된 포스포펩티드의 수준에 주로 관심이 있었기 때문에 정전용량 피크 면적을 각 분석에서 각 펩티드에 대한 비정전 피크 면적으로 나누었습니다(그림 6). 전체 실험 계획의 설계(Cap(NS0 에스테르) 대 NCap(NS3 에스테르) 및 캡(NS3 에스테르) 대 NCap(NS0 에스테르))는 또한 각 펩타이드 쌍에 대한 승산비의 제곱 또는 비율의 비의 계산을 허용하여 NS0 관련하여 표지된 펩타이드 NS3 표지된 펩타이드. 이 기술을 사용하여 위에서 확인된 44개의 포스포펩티드 중 42개의 상대적 존재비를 측정하고 값 범위를 나타냈습니다(표 1). 이들 펩티드 중 몇몇은 크게 변화하지 않는 것으로 보이지만, 다른 펩티드는 용량화된 샘플에서 증가된 표현을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 용량화 과정의 결과로 이들 서열의 인산화가 강력하게 제안됨을 시사한다. 예를 들어, PERF15, 17로도 알려진 지방산 결합 단백질 9의 포스포펩티드 LIpSSeNFeNYVR은 용량화된 샘플에서만 검출되었습니다. 일부 경우에서 관찰된 증가된 표현과 달리, 다른 포스포펩티드는 비정량화 샘플에서 더 풍부한 것으로 밝혀졌으며, 이는 이러한 서열이 정자 수용화 동안 탈인산화를 겪는다는 것을 암시합니다. 이것의 한 예는 인산화 펩타이드 AIVpSPPVeMVeeIpSK이며, 이는 용량이 없는 샘플에서 고도로 상향조절되는 것으로 결정되었습니다. 우리의 데이터는 또한 여러 펩타이드가 프롤린 지향적 인산화를 겪는다는 것을 나타냅니다. 이 발견은 프롤린 지향적 인산화가 용량화 과정의 결과로 마우스 정자에서 상향 조절된다는 것을 보여주는 우리 실험실의 이전 결과와 일치합니다. 11 또한, 대체 생화학적 기술을 사용하여 용량이 없는 마우스 정자와 용량이 없는 마우스 정자 모두에서 동일한 정도로 티로신-인산화되는 것으로 밝혀진 매우 풍부한 정자 단백질인 헥소키나아제(hexokinase)는 이 연구에서 Tyr31에서 인산화되는 것으로 나타났습니다. 용량화 정자와 용량화되지 않은 정자 사이의 이 부위에서 상대적인 인산화 정도는 1.15로 결정되었습니다. 이 관찰은 특정 자극에 노출된 세포에서 인산화의 상대적 정량화를 위한 차등 동위원소 표지의 유용성을 추가로 확인합니다.

차등적으로 표지된 트립신 인산펩티드 TKIpSIepSLK 및 YLpYAMR에 대한 단일 이온 크로마토그램 NS0 무능력/NS3 용량 분석(각각 A 및 C) 및 NS0 용량/NS3 용량이 없는 분석(각각 B 및 D). 비율의 제곱근 NS3/NS0 중수소화 및 비중수소화 펩타이드 종의 비교와 관련된 잠재적 오류를 제거하기 위해 각 펩타이드에 대한 비율(승산비)을 표시된 대로 계산했습니다.

1 번 테이블

Capacitated(Cap) 및 Noncapacitated(NCap) 마우스 정자 총 단백질 소화에서 식별된 포스포펩티드 및 승산비(OR)의 제곱을 기반으로 한 상대적 정량

포스포펩티드 서열요금특급 m/z계산 m/z인산염NCBI 등록 번호단백질 이름또는 캡/엔캡
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발견 대 표적 단백질체학

단백질체 분석의 감도와 범위를 개선하기 위한 전략은 일반적으로 처리량을 희생시키는 대량의 샘플과 다차원적 분획을 필요로 합니다. 또는 단백질 정량화의 감도와 처리량을 개선하기 위한 노력은 모니터링할 수 있는 기능의 수를 제한합니다.

이러한 이유로 프로테오믹스 연구는 일반적으로 발견 프로테오믹스와 표적 프로테오믹스의 두 가지 범주로 나뉩니다. Discovery proteomics는 샘플당 더 많은 시간과 노력을 소비하고 분석되는 샘플 수를 줄여 단백질 식별을 최적화합니다. 대조적으로, 표적 단백질체학 전략은 모니터링할 기능의 수를 제한한 다음 크로마토그래피, 기기 조정 및 수집 방법을 최적화하여 수백 또는 수천 개의 샘플에 대해 최고의 감도와 처리량을 달성합니다.

발견과 표적 단백질체학의 범위, 감도 및 확장성 간의 균형. 발견 단백질체학의 광범위한 특성과 감도로 인해 수백 또는 수천 개의 샘플에 대한 포괄적인 분석을 수행하는 능력은 제한적입니다. 반대로, 표적화된 단백질체 분석은 펩티드의 개별 하위 집합의 정량을 수반하므로 연구자는 최고 수준의 감도로 수천 개의 샘플에서 이러한 펩티드를 분석할 수 있습니다.

Discovery proteomics 실험은 광범위한 동적 범위에 걸쳐 가능한 한 많은 단백질을 식별하기 위한 것이며 종종 매우 풍부한 단백질의 고갈, 관련 구성요소(예: 세포하 구획 또는 단백질 복합체)의 농축, 샘플 복잡성(예: SDS)을 줄이기 위한 분획화가 필요합니다. -PAGE 또는 크로마토그래피). 이러한 전략은 일부 구성 요소 간의 동적 범위를 줄이고 이온화 및 MS 듀티 사이클 시간에 대한 단백질 또는 펩티드 간의 경쟁을 줄일 수 있습니다. 정량적 발견 단백질체학 실험은 여러 분획화된 샘플에서 단백질 수준을 식별하고 정량화하려고 하기 때문에 추가 과제를 추가합니다.

표적 단백질체학 실험은 일반적으로 매우 높은 정밀도, 감도, 특이성 및 처리량으로 100개 미만의 단백질을 정량화하도록 설계되었습니다. 실제로, 이 접근 방식은 일반적으로 정밀도와 처리량을 개선하기 위해 샘플 준비의 양을 최소화합니다. 표적 MS 정량 전략은 포함 목록 및 선택된(또는 다중) 반응 모니터링(각각 SRM 또는 MRM)에 의한 지시 시퀀싱을 포함하여 수백 또는 수천 개의 샘플에서 제한된 수의 기능의 특이성과 정량화를 개선하기 위해 특수 워크플로 및 기기를 사용합니다.

디스커버리 프로테오믹스 분석은 샘플의 단백질 목록을 작성하거나 여러 샘플 간의 단백질 풍부함의 차이를 감지하는 데 가장 자주 사용되는 반면, 표적 정량적 프로테오믹스 실험은 제약 및 진단 애플리케이션에서 복잡한 샘플의 단백질 및 대사 산물을 정량화하는 데 점점 더 많이 사용됩니다. 또한, 표적 단백질체학은 종종 발견 스크리닝 중에 발견된 특정 단백질을 정량하기 위해 발견 단백질체학을 따릅니다.

특정 질량 분석기의 특성으로 인해 발견 또는 표적 단백질 분석에 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 디스커버리 프로테오믹스는 제한된 수의 샘플에서 모든 펩타이드의 식별을 강조하기 때문에 Thermo Scientific Orbitrap 질량 분석기를 포함한 고해상도 기기는 미세한 질량 대 전하 비율로 펩타이드의 검출을 극대화하는 데 사용됩니다(m/z) 차이. 반대로, 표적 단백질체학은 감도와 전반에 걸쳐 강조하기 때문에 삼중 사중극자 및 이온 트랩을 포함한 기기가 사용됩니다.

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추상적 인

그림 1. 뇌하수체 포스트 SIMS 측정의 광학 이미지. (a) H&E로 염색된 뇌하수체에는 전엽, 중엽, 후엽이 표시되어 있습니다. (b–d) 100×(b), 8000×(c) 및 10,000×(d) 배율의 SEM 이미지. 매트릭스 결정의 크기는 조직 내(c) ~2μm 및 조직 외부(d) 0.5-1μm였습니다.


단백질체학

  1. 소개
    Koch Institute Proteomics Core Facility는 단백질 식별, 단백질 특성화(변형 포함), 온전한 단백질 MW 측정, 단백질 정량 중 하나 이상이 필요한 단백질 샘플의 질량 분석 기반 분석을 제공합니다. 구조적 또는 MW 정보가 필요한 단백질이나 펩타이드가 아닌 샘플도 현재 사용 가능한 기기와 방법으로 분석할 수 있는 한 제출할 수 있습니다.
  2. 단백질 식별
    겔 전기영동으로 분리된 단백질
    겔 밴드에서 단백질 식별은 일반적으로 일상적이며 충분한 단백질이 있고 케라틴 오염이 통제되는 한 결과를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 쿠마시 염색 밴드에는 케라틴 오염이 매우 높지 않은 한 식별하기에 충분한 단백질이 포함되어 있습니다. 약하게 염색된 Coomassie 밴드는 200-300 fmol 단백질(ng의 10s)을 포함할 수 있는 반면 강하게 염색된 Coomassie 밴드는 pmol 양의 단백질(ng의 100s)을 포함할 수 있습니다. 더 많은 단백질이 있을수록 단백질 식별이 더 확실해질 것이지만, 특히 이들이 주요 단백질의 밴드에 가까울 경우 젤에 과부하가 걸리면 더 약한 밴드의 일부가 가려질 수 있다는 점을 고려하십시오.
    Silver-stained gel bands는 일반적으로 100fmol 이하(낮은 ng 범위)의 단백질을 덜 포함하고 형광성 염색의 민감도는 Coomassie와 Silver의 중간입니다.
    질량 분광 분석과 호환되는 주요 생화학 제품 공급업체로부터 상업적으로 입수할 수 있는 여러 염색 키트가 있습니다(모든 겔 염색 방법이 그렇지는 않음). 귀하(또는 귀하의 연구실의 다른 사람)가 이전에 샘플을 제출하고 유용한 결과를 얻은 경우 분명히 귀하(또는 귀하의 동료)가 이전에 하던 일을 계속하십시오. 그렇지 않으면 샘플을 제출하기 전에 당사에 문의하여 성공 가능성을 높이고 시간, 노력 및 비용 낭비를 방지할 수 있도록 하십시오.
    고려해야 할 문제는 각질 오염과 이를 최소화하는 방법 및 질량 분석 분석과 호환되는 염색 프로토콜의 사용입니다. 케라틴은 주로 피부, 양모 의류 및 먼지에서 발생합니다. 샘플과 젤을 다룰 때는 실험실 가운과 장갑(니트릴이 라텍스보다 낫다고 함)을 착용하고 맨손으로 샘플, 젤 등을 만지지 마십시오. 모든 용기, 튜브를 HPLC 등급 메탄올 및 HPLC 등급 물로 헹굽니다. 가능한 경우 조직 배양 후드와 같은 층류 후드에서 젤을 실행하고, 사용할 수 없는 경우 먼지가 없는 영역(예: 통풍구에서 멀리)의 깨끗한 표면을 사용합니다. 겔을 실행하고 염색한 후 1-2% 아세트산으로 헹구어낸 페트리 접시(지플락 백은 피함)에 넣고 덮고 실험실로 가져와서 층에서 관심 있는 겔 밴드를 자를 수 있습니다. 흐름 후드(타이밍이 작동하지 않는 경우 젤은 덮인 페트리의 냉장고에 밤새 보관할 수 있으며 이는 후속 분석에 문제를 일으키지 않아야 함). 젤을 스캔해야 하는 경우 스캐너 표면을 깨끗한 메탄올과 물로 헹구고 깨끗하게 닦았는지 확인하십시오. 그런데, &ldquoold style&rdquo 겔 고정(예: ​​글루타르알데히드 또는 포름알데히드 또는 유사한 단백질 가교제 사용)은 겔에서 단백질을 소화하고 단백질 분해 펩티드를 회수하는 것을 불가능하게 만들기 때문에 피해야 합니다.
    염색을 위해 여러 공급업체에서 판매하는 "질량 분석 호환" 염색을 사용할 수 있습니다. Commassie의 경우 염색 키트와 함께 제공되는 지침을 따르면 Gel Code Blue(Pierce/ThermoFisher) 또는 Commassie Brilliant Blue R-250 및 G-250(Pierce 또는 Bio-Rad)이 모두 문제가 없습니다. 은의 경우 Invitrogen의 SilverQuest 또는 Pierce의 Silver Snap이 좋습니다. 형광 젤 얼룩(예: SYPRO Ruby, SYPRO Tangerine)도 질량 분석법과 호환됩니다. 얼룩을 사용할 계획이고 질량 분석과 호환되는지 여부를 확인할 수 없는 경우(예: 제품 설명에서) 알려주시면 문의해 드리겠습니다.
    젤 밴드를 절단하는 것은 간단하지만 층류 후드와 같은 깨끗한 영역에서 하는 것이 중요합니다. 이전에 이 작업을 수행하지 않은 경우 분석을 위해 젤 밴드를 절단하기 전에 당사에 문의하십시오. 귀하의 젤을 실험실로 가져오도록 준비하고 식별하려는 젤 밴드를 절단할 수 있습니다.
    우리는 수천 개의 샘플에 성공적으로 적용된 프로토콜을 사용하여 샘플 오염을 줄이고 펩티드의 소화 및 회수를 최적화하는 조건에서 젤 내 소화를 수행하는 것을 선호합니다. 그러나 이미 소화된 샘플을 수락하지만 전에 소화된 샘플을 제출하지 않은 경우 몇 가지 유용한 제안을 제공할 수 있으므로 처음 이 작업을 수행하기 전에 당사에 문의하십시오. 다른 효소로 소화된 단백질이 필요한 경우 소화를 위해 트립신을 사용합니다. 이에 대해 당사와 논의하십시오.

용액의 단백질
우리는 일상적으로 용액에서 단백질을 몇 개에서 수백 개까지 식별합니다. 오염과 관련하여 젤 내 소화와 동일한 주의 사항이 적용됩니다(케라틴의 단백질 분해 펩티드가 종종 덜 풍부한 단백질의 펩티드 신호를 모호하게 하거나 억제하기 때문에 케라틴은 용액 샘플의 문제이기도 합니다). 과도한 양의 염도 문제가 될 수 있으므로 아세톤 침전과 같은 방법을 사용하여 단백질 샘플을 준비해야 할 수 있습니다. 이전에 이런 종류의 작업을 수행하지 않은 경우 이에 대해 문의하십시오. 또한 젤 밴드에 비해 용액 샘플에서 훨씬 더 문제가 되는 세제 및 폴리머와 같은 특정 다른 재료 및 화학 물질이 있습니다. 이는 절단된 겔 밴드를 분해하기 전에 광범위하게 세척하여 많은 완충액과 세제를 단백질 손실 없이 제거할 수 있지만 용액 샘플은 쉽게 세척할 수 없기 때문입니다. MW 여과 또는 투석과 같은 방법을 사용할 수 있지만 일부 단백질 손실을 초래하고 일부 세제 및 중합체는 어쨌든 단백질과 함께 남아 있습니다. 샘플을 준비하는 다른 방법과 일부 &ldquomass spectrometry 친숙한&rdquo 세제를 추천할 수 있으므로 세제 사용에 대해 문의하십시오.
온-겔 단백질 샘플의 경우

샘플의 10-15%에 밴드가 있는 경우(심지어 약한 밴드라도) 이는 샘플에 일부 단백질을 식별하기에 충분한 물질이 남아 있음을 의미합니다.