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3D 셀룰러 모델

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나는 스스로 생물학을 배우고 있는데 화학과 물리학의 측면에서 세포 내부의 모든 과정을 이해하는 것은 꽤 어렵습니다. 어떤 경우에는 추상화 대신 복잡성을 가져오는 것이 무의미합니다.

세포의 3D 프로그램 모델을 제공하는 오픈 소스 프로젝트가 있는지 알고 싶습니다. 내 말은 세포 소기관과 그 이름을 보여주는 연구 모델뿐만 아니라 일부 유형의 추상화 수준을 가진 살아있는(프로그램 내) 세포의 실제 모델(1x1 또는 그에 가까운)과 같은 실제 세포 과정을 보여주는 것을 원하는 것입니다.


셀에 대한 이해의 격차는 말할 것도 없고 구축할 수 있는 가장 강력한 애니메이션 소프트웨어/하드웨어에도 심각한 과부하가 걸리는 완전한 셀이 아닙니다. 약간 마조히즘적이라면 화학을 통해서만 세포를 이해하는 것이 가능합니다. 조만간 전체 그림을 얻기 위해 다른 방향에서 접근해야 할 것입니다. 현대 세포에는 너무 많은 복잡성이 있으므로 조만간 새로운 특성을 살펴보기 시작해야 합니다. 인간 세포의 일반적인 신진 대사 경로에 대한 이 차트를 확인하지 마십시오. 당신은 35억 년의 클루지, 숨막히는 우아함, 루브 골드버그 괴물, 덕 테이프 솔루션이 모두 서로 겹겹이 얽혀 지저분한 것을 보고 있습니다. 그것을 설명하기 시작하지 않습니다.

그러나 개별 프로세스의 모델을 생성하고 각 개별 원자를 모델링하는 여러 곳이 있습니다. 이것들을 통해 최소한 구성 요소의 화학적 성질을 이해할 수 있습니다.

www.dnalc.org는 핵산과 이들의 상호작용에 초점을 맞추고 있습니다.

그들의 작업은 XVIVO를 사용하는 Harvard의 바이오비전 프로그램과 관련이 있습니다. 이것은 훨씬 거칠지만 더 큰 규모의 접근 방식이며 원하는 것에 가장 가깝습니다.

Cambridge MRC는 실제 화학적 상호작용을 더 잘 시각화하여 더 다양한 선택을 제공합니다.

Swiss Institute of bioinformatics의 Swissmodel은 단백질 모델링에 중점을 두고 있으며 무료로 사용할 수 있는 프로그램과 데이터베이스를 보유하고 있습니다.

Wikipedia 데이터베이스 Protepedia도 있습니다.

www.dnalc.org 애니메이션의 이미지

사이트의 다른 사람들이 십여 개의 다른 프로그램/데이터베이스를 나열할 수 있다고 확신합니다.


세포의 완전한 기능은 우리의 현재 지식과 이해를 훨씬 넘어서는 것입니다. 우리가 그러한 완전한 모델을 구축하고 살아있는 세포의 일부 기본 기능을 재현할 인공 물체를 엔지니어링하는 것을 방해하는 많은 격차가 남아 있습니다.


3D 세포 배양 모델: 약물 약동학, 안전성 평가 및 규제 고려 사항

비임상 시험은 인간을 대상으로 한 연구용 신약의 잠재적 위험과 효과를 평가하기 위한 기초 역할을 했습니다. 그러나 현재의 2차원(2D) 시험관 내 세포 배양 시스템은 생체 내에서 관찰되는 풍부한 환경과 복잡한 과정을 정확하게 묘사하고 시뮬레이션할 수 없는 반면, 동물 연구는 유전된 종별 차이와 증가된 수요에 대한 낮은 처리량으로 상당한 단점을 제시합니다. 약물 안전성과 효능에 대한 비임상 예측을 개선하기 위해 연구자들은 약물 반응에 대한 인간의 감수성을 보다 정확하게 표현하기 위해 개선된 세포 및 기관 기반 분석의 사용을 평가하고 촉진하는 새로운 모델을 계속 개발하고 있습니다. 무엇보다도 3차원(3D) 세포 배양 모델은 생리학적으로 관련된 세포 미세 환경을 제시하고 약물 개발의 초기 단계에서 약물 안전성 및 효능에 영향을 미치는 약물 처분 및 약동학(PK)을 평가하는 데 큰 가능성을 제공합니다. 현재, 단순한 스페로이드에서 보다 복잡한 오르가노이드 및 장기 온칩에 이르기까지, 단일 세포 유형의 정적 3D 모델에서 미세 유체 흐름 제어 및 2D 배양과 생체의학 미세전자기계 시스템을 결합한 하이브리드 3D 시스템. 이 기사에서는 약물 PK, 안전성 및 효능 평가에서 3D 배양 시스템의 현재 적용 및 과제를 검토하고 간, 장, 신장 및 뉴런 기반 3D 세포 모델에 대한 집중 토론 및 규제 관점을 제공합니다.

© 2021 저자. American Society for Clinical Pharmacology and Therapeutics를 대신하여 Wiley Periodicals LLC에서 출판한 Clinical and Translational Science. 이 기사는 미국 정부 직원에 의해 기고되었으며 그들의 작업은 미국에서 퍼블릭 도메인입니다.


3D 기관형 배양 모델

생체 내 환경에서 질병 상태 또는 장기 기능을 요약하는 시험관 내 모델 시스템에서 약물 또는 치료 화합물의 결과를 측정하는 능력은 과학자들이 생체 외 세포 반응을 연구하기 위한 '성배'입니다. 지난 몇 년 동안 이를 달성하기 위한 시도에서 혁신적인 접근 방식, 새로운 기술 및 프로세스는 장기간 배양에서 실행 가능하고 다음에서 발견되는 표현형 및 유전형 특성을 모두 나타내는 생체 외 유기형 배양 모델(OCM)을 생성하는 방법론을 만들었습니다. 생체.

종종 회전 타원체라고 하는 OCM은 다른 세포 유형(예: 섬유아세포) 및 세포외 기질(ECM)과 같은 미세 환경 구성 요소가 있는 경우 자가 조립하는 예리한 능력을 가지고 있습니다(2-4). HCI와 함께 사용되는 많은 OCM 모델의 문제는 마이크로플레이트의 웰 내에서의 배치 및 위치입니다.

일반적으로 OCM은 마이크로플레이트의 표면이나 현탁액에 느슨하게 부착되어 있으므로 이미지 수집 및 분석 전이나 도중에 웰에서 이동하는 경향이 있습니다. ECM 내에 배양될 때 OCM은 일반적으로 대부분의 마이크로플레이트 형식에서 균일하지 않은 크기와 모양으로 형성되어 이미지를 수집하고 분석할 때 추가적인 문제를 야기합니다.

사용된 3D 세포 모델 시스템에 관계없이 분석 개발 및 검증 중에 데이터 분석 및 정보학 도구를 사용하여 반복성과 견고성을 입증하는 통계적 결과를 생성하는 실험의 재현성 성능을 보여주는 것이 중요합니다(5).


모델

고체 합성 스캐폴드 모델로 조직 환경을 탐색합니다.

고체 합성 스캐폴드 모델로 조직 환경을 탐색합니다.

스페로이드 모델 환경에 대해 알아보세요.

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오르가노이드 모델 환경에 대해 자세히 알아보십시오.

오르가노이드 모델 환경에 대해 자세히 알아보십시오.


약물 발견에서 3D 세포 모델 사용의 이점

연구자들이 더 복잡하고 이질적인 질병에 대한 치료 전략을 탐색함에 따라 생리학적으로 더 관련이 있는 모델에 대한 필요성이 그 어느 때보다 커졌습니다. 연구원들은 2D 세포 배양과 생체 내 동물 모델.

최근에 PerkinElmer의 세포 이미징 및 분석 부 제품 관리자인 Karin Boettcher 박사와 만나 3D 모델을 신약 개발에 적용할 수 있는 방법에 대해 논의했습니다. Karin은 이러한 모델이 현장에 미치는 영향을 강조하고 3D 세포 모델의 일관성과 재현성을 보장하는 방법에 대한 팁을 제공합니다.

Laura Mason(LM): 3D 세포 배양이란 무엇이며 3D 모델을 신약 개발 분야에 어떻게 적용할 수 있습니까?

Karin Boettcher(KB): 세포 배양은 광범위한 범위에 대해 많은 수의 세포를 생성하는 데 없어서는 안될 기술입니다. 시험관 내 고처리량 스크리닝과 같은 애플리케이션. 전통적으로 세포는 부착성 단층 또는 2D 세포 배양으로 성장하는 마이크로플레이트에 사용됩니다. 3D 세포 배양에서는 세포가 층으로 자라는 것이 아니라 젤 매트릭스에서 3차원 형태로 배양되거나 회전 타원체 또는 오르가노이드 형태로 배양됩니다. 3D 배양은 표적 식별 및 검증, 리드 최적화, 후보 선택을 포함하는 약물 발견 워크플로우 전반에 걸쳐 또는 분석 개발 중에 높은 처리량 스크리닝 전략에 대한 정보에 입각한 결정을 내리기 위한 다양한 응용 프로그램에서 모델 시스템으로 사용할 수 있습니다. 3D 세포 모델은 연구 맥락에서도 사용될 수 있습니다. 재생 의학, 발달 생물학, 암 연구 및 독성학에서.

LM: 다른 사용 가능한 모델과 비교하여 3D 모델을 사용할 때의 주요 이점은 무엇입니까? 이러한 이점을 보여주는 특별한 예가 있습니까?

KB: 연구원들은 2D 세포 배양과 생체 내 동물 모델. 3D 세포 모델은 발생하는 미세 환경, 세포 간 상호 작용 및 생물학적 과정을 밀접하게 모방하므로 2D 세포 배양보다 생리학적으로 더 적절한 조건을 제공합니다. 생체 내. 또한, 더 높은 수준의 형태학적 및 기능적 분화를 보여줍니다. 다시 말하지만, 생체 내 세포 특성.

LM: 3D 모델 사용과 관련된 몇 가지 문제에 대해 말씀해 주시겠습니까?

KB: 재현 가능한 세포 시드 및 유사한 크기의 3D 미세조직의 안정적인 형성은 특히 3D 모델을 처리량이 많은 워크플로에 통합할 때 강력하고 반복 가능한 결과를 위해 필수적입니다. 일관되고 재현 가능한 3D 세포 모델을 생성하는 것은 문제가 될 수 있습니다.

고 콘텐츠 이미징 접근 방식을 사용하여 3D 세포 모델을 분석하는 경우 고품질 이미지는 성공을 위한 중요한 전제 조건이며 이러한 이미지를 캡처하는 것은 회전 타원체와 같은 크고 두꺼운 3D 구조의 경우 특히 어려울 수 있습니다.

또한, 고함량 분석에서는 미세한 세포 아래 세부 사항을 분석하기 위해 매우 고해상도 이미지를 캡처하는 것을 목표로 하지만 3D 세포 샘플로 작업할 때 이 모든 정보를 수집하면 속도가 느려지고 속도가 느려질 수 있습니다. 의심할 여지 없이 생성하는 이미징 데이터의 양을 늘리십시오. 3D 세포 모델의 이미징 및 분석이 생성하는 엄청난 양의 데이터를 처리하는 것은 어려울 수 있습니다.

LM: 연구자들은 어떻게 이러한 문제를 극복할 수 있습니까?

#1: 일관된 3D 세포 모델 성장

일관된 3D 세포 모델을 생성할 수 있는 몇 가지 방법이 있습니다.

회전 타원체를 성장시키기 위한 고급 표면 코팅이 있는 특수 마이크로플레이트가 상업적으로 이용 가능합니다. 예를 들어, ULA(Ultra-Low Attachment) 마이크로플레이트를 사용하는 것이 널리 사용되는 방법입니다. 균일한 회전 타원체를 성장시키는 간단하고 경제적인 방법이 필요한 경우 이상적입니다. 합성 플레이트 코팅은 일반적으로 균일한 단일 회전 타원체 형성을 촉진하는 감소된 세포-플레이트 접착을 보장합니다.

3D 스페로이드를 생성하거나 3D 세포 모델 시스템의 구조를 지원하는 다른 방법에는 아가로스, 하이드로겔, 스캐폴드 또는 성장 인자가 있는 이러한 기질의 조합이 포함됩니다. 중력 또는 "행잉 드롭(hanging drop)" 시스템, 바이오프린팅 및 자성 나노입자를 포함하는 3D 회전 타원체를 형성하는 물리적 방법도 있습니다.

세포 파종, 미세 조직 전달 및 배지 교환은 자동화된 휴대용 파이펫팅 장치를 사용하여 안정적으로 수행할 수 있지만 높은 처리량 연구에 많은 수의 스페로이드가 필요한 경우에는 실용적이지 않습니다. 이 경우 자동화된 액체 처리는 더 큰 효율성과 재현 가능한 결과를 제공할 수 있습니다.

#2: 고품질 이미지 얻기

고 콘텐츠 분석 접근 방식의 경우 공초점 회전 디스크 이미징 시스템은 높은 처리량 수집을 유지하면서 최고의 신호 대 잡음비와 최고의 X, Y 및 Z 해상도를 제공합니다. 또한, 레이저 기반 여기와 2개 또는 4개의 카메라를 결합한 공초점 하이컨텐츠 이미징 시스템을 사용하면 최소한의 샘플 조명으로 매우 높은 프레임 속도로 이미지를 얻을 수 있습니다. 이는 광손상을 줄여주므로 다중 프레임 및 형광 채널이 필요한 경우 3D 세포 모델을 이미징하는 데 이상적입니다.

3D 구조의 깊숙한 곳까지 이미지를 촬영하려면 수중 대물렌즈를 사용할 수 있습니다. 이 대물렌즈는 개구수가 더 높아서 최대 4배 더 많은 빛을 포착할 수 있고 X, Y, Z에서 유사한 공기 대물 렌즈보다 더 높은 해상도를 제공합니다. 또한, water immersion 대물렌즈는 초점 깊이가 더 작기 때문에 공기 대물렌즈에 비해 오염된 빛과 배경의 양을 줄입니다.

#3: 이미징 시간 및 데이터 볼륨 최소화

종종 3D 모델 또는 미세조직을 사용하는 이미징 분석에서 전체 웰 영역(3D 모델이 있는 위치)의 일부만 관심을 가질 것입니다. 이상적으로는 해당 지역에서 고해상도 데이터만 수집하고 나머지 유정에서 데이터를 캡처하는 데 시간을 소비하지 않는 것이 좋습니다.

PerkinElmer의 PreciScan 지능형 이미지 수집 기술(Harmony 고화질 이미징 및 분석 소프트웨어의 구성요소)을 사용하면 관심 영역을 저해상도로 정확하게 타겟팅한 다음 고해상도에서 3D 세포 모델만 이미지화할 수 있습니다. 따라서 수집 및 분석 시간이 크게 단축되고 분석 및 관리에 필요한 데이터 양이 줄어듭니다.

LM: 연구자들이 3D 세포 배양을 최대한 활용하려면 어떻게 해야 합니까?

KB: 조사자로서 귀하는 연구에 적합한 세포 모델을 개발하는 데 몇 달 또는 몇 년을 보냈을 것입니다. 3D 세포 배양을 최대한 활용하려면 투자 수익을 극대화할 수 있는 고함량 이미징 및 분석 접근 방식을 제안합니다.

2D 또는 2.5D(최대 강도 투영)가 아닌 3D로 이미지를 분석하는 것이 권장됩니다. 이러한 방법은 3D 세포 배양 내 세포 유형 분포, 외부 및 내부 스페로이드 층 간의 공간적 차이 및 세포내 형태 기능의 차이와 같은 것을 놓치기 때문입니다. 조사관은 3D 체적 분석이 어렵고 번거롭고 사용 가능한 완벽한 통합 이미지 분석 솔루션이 없기 때문에 피하는 경향이 있습니다. 그러나 이제 PerkinElmer의 Harmony 4.8 소프트웨어와 같은 솔루션을 사용하여 3D로 부피와 형태를 분할 및 정량화하고 공간 관계를 더 잘 시각화하고 이해하며 3D 이미지 수집 및 분석을 가속화할 수 있습니다.

신약 개발 애플리케이션에서 3D 세포 모델을 가장 잘 이해하려면 표적 검증 및 식별을 위한 전체 3D 체적 분석, 리드 최적화, 후보 선택 또는 선택적 스크리닝 접근 방식이 스크리닝 전략에 대한 정보에 입각한 결정을 내리는 데 중요합니다.

Karin Boettcher는 Technology Networks의 과학 작가인 Laura Elizabeth Mason과 이야기하고 있었습니다.


신경염 연구를 위한 3D 세포 배양 접근법

배경: 신경퇴행성 질환은 매우 복잡하여 세포 배양에서 모델링하기가 어렵습니다. 뇌의 모든 세포 유형은 병인에 영향을 미치는 것으로 관련되어 있으며 질병 진행은 다른 세포 유형 간의 누화에 의해 영향을 받을 가능성이 있습니다. 서로 다른 세포 유형 간의 누화의 세포 수준 결과에 대한 정교한 조사에는 3차원(3D) 공동 배양 시스템이 필요합니다.

새로운 방법: 뮤린 신경 줄기 세포는 3D 배양에서 혼합 신경 계통 집단으로 분화되었습니다. 이러한 차별화된 문화를 성인 뇌의 미세아교세포로 시딩함으로써 우리는 미세아교세포로 채워진 뮤린 뇌 조직의 3D 생체외 모델을 생성했습니다.

결과: GFP-발현 미세아교세포의 3D 신경 계통 배양으로의 침투를 모니터링하는 것은 조직 전체에 걸쳐 인구를 보여주었으며 미세아교세포에 의한 분지된 항상성 형태의 가정을 보여주었습니다. 공동 문화는 좋은 수명을 보였고 외부 자극에 기능적으로 반응했습니다.

기존 방법과의 비교: 우리는 이전에 미세아교세포와 신경 계통 세포 간의 세포-세포 상호 작용을 모델링하기 위해 2차원 부착 배양을 사용했습니다. 미세아교세포는 이러한 문화에 잘 통합되고 세포 간 누화를 보여주지만, 부착된 배양은 활성화 상태를 변경할 수 있으므로 3D 시스템이 뉴런 및 지원 세포 네트워크를 통한 통신을 더 잘 나타내는 것으로 알려져 있습니다.

결론: 우리 시스템은 외부 신경염증 자극에 반응하는 3D 마우스 뇌 조직을 모델링하는 간단하고 시간 효과적인 방법을 제공합니다. 살아있는 조직에서 세포간 상호작용을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 사용 가능한 모든 마우스 유전자형 내의 변화에 ​​대한 연구를 추가로 허용합니다.

키워드: 3D 공동 배양 미세아교세포 신경줄기세포 신경변성 신경염증 신경구 오르가노이드.


3D 세포 배양: 현재 기술 검토

지난 10년 동안 신약 개발 노력의 중심 초점은 시험관 내 대상 환자 내에서 발견되는 생체 내 조건을 더 잘 모방하는 테스트 모델. 초기 단계에서는 CHO 및 HEK-293과 같은 일반적인 숙주 세포주에서 약물 표적의 과발현을 활용하는 세포 기반 접근 방식에 찬성하여 정제된 약물 표적을 사용하는 생화학적 분석에서 벗어나는 것을 보았습니다. 더 큰 생리학적 관련성에 대한 탐구는 1차 세포, 바람직하게는 공급이 적절한 경우 인간의 사용으로 진행되었으며, 검출 기술이 충분히 민감해야 약물 표적의 내인성 발현에 의존합니다. 자연적으로 부착되는 이러한 세포 유형의 많은 부분은 코팅된 마이크로플레이트에 세포를 잘 시딩하는 간단한 배양 워크플로를 허용하고 마이크로플레이트를 배양하여 규정된 분석을 수행하기 전에 세포가 2차원(2D) 단층에 부착되도록 장려합니다. 생화학적 및 불멸화 세포주에 대한 초기 개선을 제공하는 동안, 이제 이 2D 방식으로 세포를 배양하는 것이 종종 문제가 되고 생체 내 조건 및 행동에 대한 상대적으로 열악한 모델이라는 현실을 뒷받침하는 풍부한 증거가 있습니다. 2D 모델을 사용하여 암에 대한 약물 후보의 소모율은 약 95% 1 , 시험관 내 예상하지 못한 독성 문제뿐만 아니라 클리닉으로 번역되지 않은 약물 효능 값. 2011년 한 해에만 임상 시험 중이거나 연방 약물 관리국(Federal Drug Administration)의 검토 2 하에 있는 약 900개의 항암 요법 중 12개만이 승인을 얻었으며 3 그 결과 전임상 및 임상 시험에 지출된 수억 달러의 손실이 발생했습니다. 이러한 부족의 이유는 세포외 기질(ECM) 구성요소, 분화, 증식 및 생체내 세포 기능에 중요한 세포 대 세포 및 세포 대 기질 상호작용이 4 손실되는 기존의 2D 조건을 사용하여 추적할 수 있습니다.

그림 1. 종양 미세 환경 5 .

병행 연구는 또한 2D 환경이 저산소증, 이질적인 세포 집단(기질 세포 포함), 다양한 세포 증식 영역(정지 대 복제), ECM 영향, 가용성 신호 구배, 차등 영양소 및 대사성 폐기물 수송 6(그림 2). 그 결과, 부자연스러운 2D 환경은 화학 요법 7에 대한 암세포의 예측된 반응에 대한 부정확한 데이터를 제공할 수 있습니다.

그림 2. 중심 괴사 종양의 세 가지 미세 환경 영역의 개략도. 자발적인 종양은 그러한 괴사 병소로 구성될 수 있습니다. 다양한 생리적 매개변수의 크기 감소는 +++, ++, +, +/- 및 - 6 으로 표시됩니다.

추가 연구에 따르면 개별 약물 표적이 발현되지 않거나 세포 신호 수준이 생체 내에서 발견되는 수준과 동일하지 않아 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 실제로, 연구 연구에 따르면 흑색종 세포에서 106개의 유전자가 상향 조절되고 73개의 유전자가 동일한 세포의 2D 단층 세포 배양의 기준선 발현과 비교하여 종양 유사 모델을 사용하여 하향 조절된 것으로 나타났습니다 8. 흥미로운 점은 3D 모델에서 상향 조절된 것으로 밝혀진 유전자가 종양에서도 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다는 점이다.

정확한 종양 모델을 생성하기 위해 2D 세포 배양을 사용하는 것과 같은 많은 우려가 간 독성 연구에도 적용됩니다.생체이물 독성 시험의 황금 표준은 생체 내 동물 연구를 포함하지만, 동물 복지에 대한 우려가 증가하고 동물 연구 결과와 이질적인 인간 집단에서 관찰되는 질병 표현형의 불일치로 인해 실행 가능하고 예측 가능한 시험관 내 테스트 방법 우선 순위 9,10 . 불멸화 간 유래 세포주는 절차를 단순화하고 전체 동물 실험의 필요성을 제거하지만, I상 및 II상 대사에 관여하는 유전자의 발현 프로파일은 간 조직 11에서 관찰된 것과 잘 상관되지 않습니다. 1차 간세포 배양은 생체 내에서 볼 수 있는 수준에 훨씬 가까운 기능 수준을 제공하지만 이러한 세포는 시험관 내에서 사용할 때 문제가 됩니다. 전통적인 2D 배양 조건에서 세포는 역분화되고 시토크롬 P450 효소의 발현을 빠르게 감소시키며 결국 생존력 12을 잃습니다.

생체 내 종양 및 간 모델 모두에서 2D 세포 배양의 한계를 강조하는 풍부한 연구는 연구 방법에서 새로운 세포 모델의 필요성을 강조합니다. 3D 배양 세포가 복잡한 생체 조건 13에 가까운 기능을 나타내기 때문에 이러한 요구는 3D 세포 모델의 채택을 통해 충족될 수 있습니다. 2D 배양 모델과 비교하여 약물 후보 평가를 위한 3D 배양 세포 통합의 이점은 다음을 포함할 수 있습니다. - 시험 분자에 대한 3D 구조 내 세포의 균일한 노출, (4) 다양한 세포 증식 영역, (5) 종양 미세 환경 5에서 부위 특이적 기질 세포의 영향. 연구에 따르면 특정 세포주의 종양 세포는 3D 형식으로 평가할 때 동일한 세포를 2D 형식 14에서 배양할 때보다 항암제에 덜 민감합니다. 그러나 다른 연구에서는 다른 3D 기술을 사용하는 다른 세포주가 반대 효과를 보여줍니다 15. 이러한 발견은 암 연구에서 3D 세포 배양의 사용이 2D 세포 배양 모델로만 제한되는 경우 간과될 수 있는 생체 내 약물 활성에 대한 주요 통찰력을 제공할 수 있는 방법을 강조합니다. 또한 2D 방법을 사용하여 배양된 세포와 비교하여 3D 시스템에서 신호 전달 경로 변이 또는 표적에 대한 의존성의 변화와 같은 이러한 차이를 생성하는 데 관련된 메커니즘을 설명할 수 있습니다.

세포가 기저막과 같은 젤에서 성장하면 신호 전달 경로가 상호 통합됩니다. A549 3D 회전 타원체는 단층 대응물과 비교할 때 지속적으로 높은 수준의 IL-6 및 IL-8 분비를 보여줍니다. 더 나은 바이오마커 발현을 위한 향상된 세포외 기질 침착은 3D 배양 시스템 17을 사용하여 보고되었습니다. 히알루론산(HA) 3D 모델을 사용하여 중간엽 기질 세포의 연골 세포로의 분화도 분석되었습니다. 세포 수용체가 HA와 더 잘 상호작용하고 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다는 것이 발견되었습니다. 생물학적으로 기능적인 미세 환경, 물질 화학, 세포 상호 작용 및 기계적 특성을 포함한 다양한 요인이 연골 형성 18을 향상시켰습니다.

3D 종양 모델에서 볼 수 있는 것과 유사한 결과가 간독성 연구에 3D 세포 배양을 통합할 때도 관찰됩니다. Wu et al. 3D 배양된 쥐 간세포가 단층 배양 19에 비해 더 분화된 상태를 유지한다는 것을 관찰했습니다. 3D 모델을 사용하여 일관되게 높은 수준에 비해 마우스 간세포의 전통적인 2D 단층 배양을 사용하여 CYP1A2 및 -1A1 발현의 급격한 감소도 5일의 잠복기 기간 20에 걸쳐 감지되었습니다. 2D 샌드위치 배양 또는 3D 공동 배양 방법을 사용하여 25일 동안 유지된 래트 간세포의 평가와 함께 Kratschmar et al.에 의해 장기간 평가가 수행되었습니다. 3D 배양 방법을 사용하여 Nrf2- 및 글루코코르티코이드 의존성 유전자의 높은 발현이 관찰된 반면, 2D 간세포는 급속한 감소를 나타내었고 두 유전자 세트 21의 일관된 낮은 발현이 뒤따랐습니다.

3D 세포 배양 모델

현재 세포를 3D 구조로 배양하기 위한 다양한 기술이 존재합니다. 이들은 스캐폴드 기반 및 비스캐폴드 기반의 두 가지 주요 범주로 그룹화할 수 있으며 다음과 같은 개별 기술을 포함합니다.

비계 기반

  • 폴리머 하드 스캐폴드
  • 생물학적 비계
  • 마이크로패턴 표면 마이크로플레이트

비 스캐폴드 기반

  • 행잉 드롭 마이크로플레이트
  • ULA(Ultra-Low Attachment) 코팅을 포함하는 회전 타원체 마이크로플레이트
  • 미세 유체 3D 세포 배양

스캐폴드 기반 3D 세포 배양

3D 종양 및 조직 모델은 생체 내 ECM을 모방하도록 설계된 사전 제작된 스캐폴드 또는 매트릭스에서 세포를 배양하여 만들 수 있습니다. 세포는 3D 문화 22를 형성하기 위해 스캐폴드 내의 틈새를 부착, 마이그레이션 및 채웁니다. 비계는 물리적 지원 시스템으로 사용됩니다. 시험관 내 세포 배양 및 생체 내 조직 재생과 함께 사용할 가능성을 보여주었습니다. 생체 조직 23의 자연적인 물리적 및 구조적 환경을 재현할 가능성이 있기 때문입니다. 폴리스티렌(PS) 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하여 일반적으로 통합되는 중합체의 여러 기하학적 구성이 존재합니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 여기에는 다공성 디스크(3A), 전기방사(3B) 및 직교 레이어링(3C)이 포함됩니다.

그림 3. (A) 다공성 디스크(이미지 제공: James Weaver and Mooney lab, HSEAS 및 Wyss Institute) (B) Electrospun(이미지 제공: The Electrospinning Company, Ltd.) 및 (C) 직교 레이어링(3D Biotek, LLC 이미지 제공) 고분자 3D 지지체의 기하학적 구성.

폴리머 하드 스캐폴드는 재생 의학과 전임상이라는 두 가지 별개의 연구 영역으로 통합됩니다. 시험관 내 테스트. 전자에서 세포는 퇴행성 또는 변경된 조직을 대체하기 위한 궁극적인 생체내 이식을 목표로 스캐폴드에서 성장합니다. 현재 스캐폴드는 뼈, 연골, 인대, 피부, 혈관, 신경 및 골격근 조직 24 엔지니어링에 사용됩니다. 특히 Ge 등은 조골세포 25의 증식 및 골형성 분화를 지원하는 락티드 및 글리콜리드 공중합체를 사용하여 3D 인쇄 방법을 개발했습니다. 뼈 재생 효능의 평가는 새로운 뼈 조직 형성 및 성숙이 24주 기간 동안 스캐폴드 내에서 발생함을 입증했습니다.

전임상용 시험관 내 테스트에서 세포는 실험실 환경에서 종양이나 조직을 모델링할 목적으로만 스캐폴드에서 성장합니다. 스캐폴드가 형성되면 적절한 테스트 용기(일반적으로 페트리 접시 또는 마이크로플레이트 웰)에 맞는 직경으로 절단됩니다(그림 4). 최종 스캐폴드의 일반적인 두께는 각각 일정한 기공 크기를 포함하는 150-200 μm입니다.

그림 4. 테스트 용기에 삽입하기 위한 Orthogonal Layering 폴리머 3D 스캐폴드의 준비(NIST 제공 이미지).

스캐폴드가 삽입되면(그림 5), 세포 처리 및 분석 구성 요소 분배 절차가 2D 세포 배양에 사용되는 것과 유사한 방식으로 수행됩니다. 섬유질과 기공의 배열은 세포가 영양소 공급원 가까이에 머물 수 있도록 하여 생체 내에서 보이는 것과 유사한 영양소, 폐기물 및 가스의 교환을 가능하게 합니다. 이 지식을 사용하여 Bergenstock et al. 는 PS 스캐폴드를 사용하여 3D로 배양하고 전통적인 2D 형식으로 배양한 MCF-7 및 HepG2 암세포주가 더 높은 A570 최대 2주까지의 잠복기에 걸친 흡광도 값. 항암제인 타목시펜과 메토트렉세이트를 사용한 치료로 인한 감소된 세포독성 효과도 3D 배양 세포 26에서 동일한 기간 동안 관찰되었습니다.

그림 5. 마이크로플레이트 형식의 고분자 3D 지지체의 최종 접합 구성(이미지 제공: Electrospinning Company, Ltd.)

생물학적 비계

스캐폴드는 또한 생체 내 ECM에서 일반적으로 발견되는 단백질과 같은 보다 자연적 또는 생물학적 기원의 구성 요소에서 만들 수 있습니다. 여기에는 일반적으로 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌 및 젤라틴이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다. 생물학적 스캐폴드는 세포가 3D 구조로 부착 및 재구성할 수 있는 매트릭스를 제공할 뿐만 아니라 더 중요한 것은 용해성 성장 인자, 호르몬 및 세포가 생체 내 환경에서 상호작용하는 기타 분자의 정확한 미세 환경을 제공합니다. 유전자 및 단백질 발현 변경 27 . 현재 방법은 세포가 마이크로플레이트 웰에 도금하기 전에 액체 상태(하이드로겔)의 스캐폴드 단백질과 혼합되거나(그림 6A)이전에 형성된 스캐폴드에 추가되거나 단백질 혼합물이 이미 응집된 세포에 오버레이되도록 요구합니다. 3D 회전 타원체. 그런 다음 세포는 주변 환경을 재구성하여 신호 분자를 방출하고, 이동을 허용하거나, 다른 세포 기능을 수용할 수 있습니다(그림 6B). 최종 결과는 적절한 항상성 상태의 생성입니다.

그림 6. (A) 마이크로플레이트 웰에 분배한 후 배지에 현탁된 콜라겐 섬유의 표현. (Lonza, Inc.의 이미지 제공) (B) 3D 콜라겐 매트릭스 28로의 HT-1080 세포 침입.

이러한 하이드로겔은 천연 공급원에서 파생되기 때문에 많은 세포 기능을 촉진하여 생존력을 높이고 수많은 세포 유형을 증식시킵니다. 후자는 적절한 세포 행동을 촉진하고 주로 세포 기능 29를 허용하는 작용을 하는 내인성 인자가 부족하기 때문에 고분자 지지체를 통해 사용하는 것이 유리할 수 있습니다.

하이드로겔은 또한 다층 형식을 사용하여 조직과 같은 구조를 형성해야 한다는 주의 사항을 제공합니다. 개별 세포 유형은 별도의 하이드로겔 현탁액에 포함되고 서로의 위에 겹칩니다. 그런 다음 세포는 하이드로겔 내에서 조직화되어 생체 내 조직 내에서 발견되는 층을 형성합니다. 투과성 지지대를 통합하여 다양한 공기-액체 인터페이스를 시뮬레이션할 수도 있습니다. 시험관 내 방법. 예는 인간 피부(30) 및 인간 각막 윤부 선와(31)의 진피 및 표피와 유사한 이중층을 포함한다.

마이크로패턴 표면 마이크로플레이트

미세 패턴 표면 플레이트는 미세 가공 기술의 최근 발전을 활용합니다. 각 플레이트에는 각 웰의 바닥에 규칙적으로 배열된 마이크로미터 크기의 구획이 있습니다. 우물은 인접한 우물의 장벽 사이에 슬릿이 있는 정사각형, 원형 ​​또는 정사각형을 비롯한 다양한 모양이 될 수 있습니다(그림 7A-C). 다른 구성은 사용 중인 셀 유형에 따라 스페로이드 또는 셀 네트워킹 형성에 최적화되어 있습니다.

그림 7. 플레이트 웰 내에 (A) 원형, (B) 정사각형 또는 (C) 슬릿 패터닝을 포함하는 미세 패턴 마이크로플레이트(이미지 제공: Kuraray Co., Ltd.)

웰은 코팅되어 각 마이크로 공간 내에서 낮은 접착 표면을 만듭니다. 이러한 방식으로 웰에 추가된 세포는 초기에 미세 공간의 바닥에 부착된 다음 함께 모여서 이후 배양 기간 동안 구획에서 회전 타원체와 같은 구조를 형성합니다. 또는 슬릿 패턴의 경우 우물 바닥을 따라 연속적인 셀 네트워크를 형성합니다(그림 8).

그림 8. 세포 네트워크를 포함하는 슬릿형 미세패턴 마이크로플레이트(이미지 제공: Kuraray Co., Ltd.)

판의 바닥은 세포 구조의 현미경 이미징에 적합한 얇고 투명한 필름으로 만들어집니다. 최근 연구에 따르면 마이크로패턴 플레이트를 사용하여 배양된 세포는 기존의 2D 형식으로 배양하는 것과 비교하여 다른 효소 발현 수준과 약물 반응성을 나타냅니다. Kobayashi et al.은 간세포 암종 세포주인 FLC-4가 전통적인 2D 형식에서 배양된 동일한 세포와 ​​비교하여 미세 패턴 플레이트에서 배양될 때 CYP3A4, CYP2C9 및 UGT1A1을 포함한 약물 대사 효소의 발현 수준이 증가했음을 입증했습니다. 결과는 스페로이드로 배양된 쥐의 1차 간세포와 일치하여 형태학적 변화와 세포-세포 상호작용이 효소 발현 증가의 원인임을 확인했습니다33.

비 스캐폴드 기반 3D 세포 배양

행잉 드롭 플레이트(HDP)는 부착할 표면이 없는 경우 세포가 3D 회전 타원체 구조로 자체 조립된다는 사실을 이용합니다. 각 플레이트는 SBS 표준을 준수하지만 기존의 바닥이 있는 일반 웰을 포함하는 대신 HDP 웰 바닥에는 개구부가 있습니다. HDP 웰의 상단은 미디어의 세포가 분배될 수 있는 기존의 마이크로플레이트와 유사하며(그림 9A), 하단 개구부의 구멍은 세포 응집에 충분하지만 표면 장력이 충분히 작을 정도로 작은 미디어 방울을 형성하도록 신중하게 설계되었습니다. 조작하는 동안 액적이 제거되는 것을 방지합니다(그림 9B). 부유 매체 액적의 세포는 최종 회전 타원체 구조를 생성하는 몇 시간에서 며칠에 걸쳐 집계됩니다.

그림 9. HDP 상단 및 하단 개구부의 시각화(3D Biomatrix의 이미지 제공).

회전 타원체 크기는 각 방울에 분배된 세포 수에 의해 제어됩니다. 공동 배양 스페로이드는 초기 분배 시 여러 세포 유형을 추가하거나 순차적으로 추가하여 각 세포 세트가 별도의 레이어로 집계되도록 할 수도 있습니다.

스페로이드의 장기 배양 및 분석을 수행하기 위해 스페로이드는 일반적으로 매달린 드롭 플레이트에서 더 큰 미디어 또는 버퍼 볼륨을 포함할 수 있는 두 번째 플레이트로 옮겨집니다(그림 10). 더 큰 부피는 응집된 세포가 며칠 또는 몇 주에 이르는 증식 기간 동안 영양 수준 및 pH와 같은 적절한 조건의 존재를 보장합니다.

그림 10. 교수형 드롭 회전 타원체 응집 플레이트 및 이차 분석/전파 플레이트. (이미지 제공: 3D Biomatrix).

3D 세포 구조의 원형 구성으로 인해 스페로이드는 불멸화된 암세포주를 포함하는 1차 세포 기반 조직 모델 및 종양 모델로 사용하기에 적합합니다. 이것은 Kermanizadeh 등이 수행한 작업으로 확인됩니다. 나노 물질의 잠재적인 만성 간독성 효과를 조사하기 위해 3D 인간 간 미세 조직 모델을 사용합니다. 384웰 매달린 드롭 플랫폼을 사용하여 생성된 난소암 회전 타원체도 Raghavan, et al. 전임상 약물 민감도 분석과 함께 사용 35 . 매달린 드롭 방법을 사용하여 형성된 회전 타원체는 암성 종양을 둘러싼 ECM을 모방하기 위해 생물학적 스캐폴드에 포함될 수도 있습니다. 이 조합은 다음을 사용하여 종양 전이의 생체 내 유사 검사를 허용합니다. 시험관 내 3D 모델 36 .

ULA(Ultra-Low Attachment) 코팅을 포함하는 회전 타원체 마이크로플레이트

회전 타원체 마이크로플레이트를 통합하여 매달린 드롭 플레이트를 사용하여 생성된 동일한 원형 다중 세포 조직 또는 종양 모델을 생성할 수도 있습니다. 플레이트는 SBS 96 또는 384웰 마이크로플레이트의 일반적인 웰 모양과 깊이를 가지고 있습니다. 웰 내의 더 큰 매체 및 시약 부피 용량으로 인해 두 번째 마이크로플레이트로 옮길 필요 없이 스페로이드 응집, 전파 및 실험 절차를 동일한 플레이트에서 수행할 수 있습니다.

그림 11. (A) 투명(PerkinElmer, Inc.의 이미지 제공) 및 (B) 96 및 384웰 구성의 검은색 벽, 투명 바닥 ULA 스페로이드 마이크로플레이트(이미지 제공: Corning, Inc.)

웰 바닥에 추가된 ULA 표면 코팅은 세포 부착을 최소화하여 스페로이드 형성을 허용합니다. 우물 바닥은 또한 일관된 단일 회전 타원체 생성을 보장하고 우물 중앙에 회전 타원체를 배치하는 데 도움이 되는 원형, 테이퍼형(그림 12) 또는 V자 형상을 가지고 있습니다.

그림 12. (A) 라운드(이미지 제공: Corning, Inc.) 및 (B) 테이퍼 웰 바닥 구성(이미지 제공: InSphero)을 보유한 ULA 스페로이드 마이크로플레이트.

ULA 스페로이드 마이크로플레이트 기반 세포 응집 및 분석 성능도 현재 연구 방법에 통합되어 있습니다. Ivanov, et al. 신경 줄기 세포가 ULA 스페로이드 마이크로플레이트에 추가될 수 있는 방법을 시연했습니다. 그런 다음 시간이 지남에 따라 성장 역학 및 약물 독성을 모니터링하는 데 사용되는 3D 신경구를 생성하는 집계가 발생했습니다. Vinci 등도 유사한 작업을 수행했습니다. 누가 스페로이드 마이크로플레이트 38에서 종양 스페로이드 또는 종양을 만들기 위해 다양한 불멸화 세포주를 테스트했습니다. 세포독성제에 노출된 후의 증식 및 세포 생존력을 여러 날의 배양 기간에 걸쳐 다시 한 번 조사했습니다. 그런 다음 테스트는 이전에 형성된 회전 타원체에 ECM을 추가하여 회전 타원체가 매트릭스에 완전히 포함되도록 확장되었습니다. 그런 다음 실험은 이 구성을 사용하여 스페로이드 마이크로플레이트를 사용하여 3D 종양 침습 분석을 수행할 수 있음을 확인했습니다.

미세 유체 3D 세포 배양

앞서 언급했듯이 3D 세포 배양 기술은 생체 내 조직과 종양의 3차원 구조와 세포와 ECM 간의 상호 작용을 재현하기 위해 노력합니다. 미세유체 플랫폼은 또한 유사한 이기종 모델을 생성하는 데 사용될 수 있으며, 세포 환경에 관류 흐름 측면을 도입하여 지속적인 영양 및 산소 도입은 물론 배양 배지를 통한 폐기물 제거를 허용함으로써 복잡성을 추가 수준으로 높일 수 있습니다. 세포는 서로 다른 물리적 또는 비물리적 장벽에 의해 구획 내에서 유지됩니다. 그런 다음 영양소, 화학 물질, 처리 분자 또는 염색 시약을 포함하는 배지가 세포를 지나 관류됩니다(그림 13). 장벽의 사전 정의된 간격은 구획 간의 상호 작용을 허용합니다.

그림 13. 미세 유체 3D 배양 시스템에서 관류의 표현. 세포는 미세 기둥에 의해 미리 정의된 구획에 유지되어 관류 배지와 상호 작용할 수 있습니다(EMD Millipore Corporation의 이미지 제공).

미세 유체 장치에 통합된 물리적 장벽은 전통적으로 크로마토그래피 또는 여과지 39 외에 유리 또는 실리콘, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC) 및 폴리스티렌(PS)을 포함한 폴리머로 구성됩니다. 세포는 또한 콜라겐 또는 Matrigel®와 같은 지지 매트릭스와 결합하여 세포-ECM 상호작용을 촉진하고 3D 구조로의 조립을 촉진할 수 있습니다. ECM의 도입은 또한 물리적 장벽을 통합하지 않는 미세유체 장치의 생성을 허용합니다. 매트릭스 중합은 미리 정의된 배양 영역에서 세포를 유지하고 관류 흐름(40) 동안 필터 역할도 합니다.

미세유체 시스템은 줄기 세포, 1차 세포 및 암세포를 포함한 다양한 3D 세포 배양 응용 분야에도 사용됩니다. Yu, et al. 3차원 미세유체 세포 배양 시스템을 개발하여 쥐 골수 간엽줄기세포(BMSCs) 분화 연구에 적용 시험관 내 41 . PDMS 장치도 Wan, et al.에 의해 개발되었습니다. 쥐 배아 줄기 세포의 심근 세포로의 분화를 조사하기 위해 42 . 마지막으로 Liu, et al. 3D 매트릭스 43에서 암 세포 침범에 대한 암종 관련 섬유아세포의 효과를 조사하기 위해 미세 유체 장치를 통합했습니다.


3D 세포 배양 2021: 모델, 응용 프로그램 및 번역

2021년 5월 5일 - 7일 온라인 이벤트

신종 코로나바이러스 감염증(코로나19) 확산에 따라 온라인으로 회의를 진행한다. 원래 계획대로 Konzerthaus Freiburg에서 만나지 못해서 매우 유감이지만 양방향 가상 이벤트에 여러분을 환영하기를 고대합니다.

등록하자마자 여기에서 가상 플랫폼으로 이동할 수 있습니다.

가상 행사장 바로가기 (등록된 참가자에 한함)

온라인 컨퍼런스 프로그램은 아래에 게시되었습니다. 저자는 지시에 따라 강의/포스터 발표를 준비할 수 있습니다.

기조 연설자

유명한 기조 연설자를 발표하게 된 것을 기쁘게 생각합니다(2021년 2월 기준):

약물 안전성 평가에 미세 생리학적 시스템 적용: 진행 상황 및 과제
리아논 데이비드, AstraZeneca, Cambridge/UK

시험관내 미세생리학 시스템 혁신을 통한 규제 과학 발전
수잔 C. 피츠패트릭, CFSAN/FDA, 칼리지 파크 메릴랜드, 메릴랜드/미국

ElectroGenetics의 세계를 향하여
남자 이름 퓌세네거, ETH 취리히/CH

면역 세포 침투 및 활성화의 분자 요구 사항을 특성화하기 위한 Organotypic 3D 모델
볼프강 좀머그루버, 응용 과학 대학, 비엔나/A

강의 프로그램

(변경될 수 있음, 2021년 4월 30일 기준)

2021년 5월 5일 수요일

개회 및 기술설명
합성 생물학, 스크리닝 플랫폼 및 대사체학

의장: H. Hauser, Helmholtz 감염 연구 센터, Braunschweig/D

기조강연 1

자동화된 3D 미세물리 측정을 통한 3D 세포 배양 모델 내 대사 활동의 라벨 없는 측정
S. Eggert¹ M. Gutbrod² G. Liebsch² R. Meier² D. Hutmacher³ P. Mela¹
¹ 뮌헨 공과 대학 Garching/D ² PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg/D ³ Queensland University of Technology, Brisbane/AUS

저산소증 또는 정상산소증: 다양한 3D 세포 배양 시스템에서 유전적으로 통합된 저산소증 센서가 있는 중간엽 줄기 세포 및 연골 세포
C. Schmitz¹ T. Fleischhammer¹ I. Pepelanova¹ E. Potekhina² V. Belousov³
T. 셰퍼¹ A. 라브렌티에바¹
¹ 라이프니츠 대학교 하노버/D ² 셰미아킨-오브치니코프 생물유기화학 연구소, 모스크바/RUS ³ 연방 뇌 연구 및 신경 기술 센터, 연방 의료 생물학 기관, 모스크바/RUS

EU-OPENSCREEN: 초기 단계 약물 발견을 가속화하기 위한 새로운 협업 모델
A. 실베스트리 ¹ O. Genilloud² P. Gribbon³ J. Kolanowski⁴ Z. Leśnikowski⁵
C. 스타인하우어⁶ M. Vicent⁷ W. Fecke¹
¹ EU-OPENSCREEN ERIC, Berlin/D ² Fundación Medina, Granada/E
³ Fraunhofer 분자 생물학 및 응용 생태 연구소, 함부르크/D
⁴ 폴란드 과학 아카데미, Poznan/PL ⁵ 폴란드 과학 아카데미, Lodz/PL
⁶ 코펜하겐 대학교/DK ⁷ 프린시페 펠리페 연구 센터, 발렌시아/E

종양 연구를 위한 고급 3D 모델

의장: J.M. Kelm, PreComb Therapeutics AG, Wädenswil/CH

기조강연 2

마이크로캐비티 어레이 생물반응기를 기반으로 하는 3세대 키메라 항원 수용체-T-세포(CAR-T-세포)의 특이성과 효능을 위한 4D 시험관내 시험 시스템 개발
E. Gottwald¹ L. Werner¹ C. Nies¹ S. Wang² M. Schmitt²
¹ 칼스루에 공과대학(KIT), Eggenstein-Leopoldshafen/D

² 대학 병원 하이델베르그/D

만성 림프구성 백혈병 미세 환경의 3D 모델링
F. Sbrana¹ R. Pinos¹ D. Ribezzi¹ F. Scagnoli¹ F. Barbaglio¹ D. Belloni¹
L. Scarfò¹ C. 시엘조¹
¹ IRCCS, Ospedale San Raffaele, Milan/I

기능 연구를 위한 INFORM 레지스트리 연구를 통해 얻은 소아 생명 종양 샘플의 다세포 회전 타원체 배양 모델 생성
H. Peterziel¹ A. Mangang¹ P. Fiesel² S. Oppermann³ L. Turunen⁴ J. Saarela⁴
O. Witt⁵ I. Oehme ¹
¹ Hopp Children&rsquos 암 센터 하이델베르그(KiTZ), 독일 암 연구 센터(DKFZ) 및 독일 암 컨소시엄(DKTK) Heidelberg/D ² 독일 암 연구 센터(DKFZ) 및 독일 중개 암 연구 컨소시엄(DKTK) Heidelberg/D ³ Hopp 어린이 암 센터 하이델베르그(KiTZ), 독일 암 연구 센터(DKFZ) 및 독일 암 컨소시엄(DKTK), Heidelberg/D ⁴ 핀란드 헬싱키 대학교(FIMM-UH), 헬싱키/FIN ⁵ Hopp 어린이 암 센터 하이델베르그(KiTZ) , 독일 암 연구 센터(DKFZ), 독일 암 컨소시엄(DKTK) 및 하이델베르그 대학 병원/D

포스터 세션 1 / 전시

1일차 종료

DECHEMA 섹션 "세포 배양 기술" 및 "의료 생명 공학"

2021년 5월 6일 목요일

복합 및 다중 세포 유형 모델

의장: C. Kasper, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna/A

골수 세포 재분극의 이미지 기반 정량화 및 종양 미세 환경 내에서의 3D 상호 작용
G. Goverse¹ N. Beztsinna¹ B. Visser¹ M. van de Merbel¹ E. Spanjaard¹ K. Yan¹
L. 프라이스¹ L. Daszkiewicz¹
¹ OcellO B.V., Leiden/NL

이식용 또는 약물검사용 기능성 베타세포-간엽줄기세포-스페로이드 제조
F. Petry ¹ P. Czermak¹ , ² D. Salzig¹
¹ 응용 과학 대학 Mittelhessen, Giessen/D

면역 세포와 복잡한 전혈 공동 배양에서 새로운 인간 기관형 3D 방광 상피 모델 개발
M. Willig¹ R. Kehlbach¹ G. Stein¹ M. Schmolz¹
¹ HOT Screen GmbH, Reutlingen/D

이 세션의 모든 연사들과 토론

휴식 시간

혁신적인 미세생리학 시스템 I

의장: U. Marx, TissUse GmbH, Berlin/D

기조강연 3

미세 생리학적 3D 인간 간 – 섬 미세 조직 플랫폼을 적용하여 약물 – 약물 상호 작용 연구
L. Hoelting¹ I. Karakoc¹ B. Yesildag¹ W. Moritz¹ O. Frey¹
¹ InSphero AG, Schlieren/CH

P1.1.07
삼중 세포 미세 생리학적 간 정현파 모델에서 아세트아미노펜, 트로바플록사신 및 레보플록사신의 약물 유발 간 독성 평가

T. Kaden ¹ R. Li² A. Mosig³ K. Graf¹ M. Raasch¹ K. Rennert¹
¹ Dynamic42 GmbH, Jena/D ² Biopredic sarl, St Gregoire/F ³ University Hospital Jena/D

이 세션의 모든 연사들과의 토론

점심 시간

포스터 세션 2 / 전시
혁신적인 미세생리학 시스템 II

의장: J. Hansmann, Universitätsklinikum Würzburg/D

기조강연 4

P3.1.01

전이 및 항흑색종 치료제 연구를 위한 혈관성 흑색종 피부 동등물 개발
A. Leikeim¹ J. Kliche¹ M. Komma¹ F. Schmidt² F. Groeber-Becker²
¹ Uniklinikum Würzburg/D ² Fraunhofer ISC - Translational Center Regenerative Therapies TLC-RT, Würzburg/D

이 세션의 모든 연사들과의 토론

시상식
" wonder "에서 가상 겟 투게더

2일차 종료

2021년 5월 7일 금요일

숙주-미생물 상호작용 조사

의장: I. Prade, Forschungsinstitut für Leder und Kunststoffbahnen (FILK) gGmbH, Freiberg/D


3D 세포 배양의 동향: 오르가노이드 및 스페로이드

아만다 링커스, PhD, 연구 부교수, 밴더빌트 대학 소세포폐암의 NCI 시스템 생물학 센터, 과학 센터 관리자가 기고 편집자인 Tanuja Koppal, PhD와 3D 세포 배양의 새로운 과학 및 기술 발전에 대해 이야기합니다. 그녀는 이러한 혁신으로 인해 가능해진 3D 오르가노이드 및 회전 타원체 사용에 대한 몇 가지 새로운 응용 프로그램에 대해 논의합니다.

Q: 귀하의 업무와 전문 지식에 대한 세부 정보를 제공할 수 있습니까?

NS: 저는 국립 암 연구소(NCI)의 신경 종양학 분과에서 박사 후 과정을 마쳤습니다. 이 기간 동안 저는 암 줄기 세포 생물학과 교모세포종(GBM) 종양 진행을 촉진하는 분자 신호에 대한 연구에 대한 열정을 키웠습니다. 수년 동안 나는 이 치명적인 질병을 주요 연구 초점으로 계속 추구했습니다. Weill Cornell Medicine의 Starr Foundation Cerebral Organoid Translational Core의 전 이사로서 나는 소설, 생체 외 뇌종양 세포와 인간 뇌의 미니어처 모델 간의 상호 작용 및 분자 누화를 연구하기 위한 3D 시스템. 우리는 이 대뇌 오르가노이드 신경교종 모델을 &ldquoGLICO&rdquo 모델이라고 명명했으며 에 우리의 연구 결과를 발표했습니다. 셀 보고서.

Q: 3D 회전 타원체와 오르가노이드의 차이점은 무엇입니까?

NS: 회전 타원체와 오르가노이드는 모두 다세포 3D 구조입니다. 그러나 회전 타원체는 일반적으로 스캐폴드가 없고 부착되지 않은 조건에서 배양된 암세포로 구성된 세포 집합체입니다. 회전 타원체 배양의 복잡성은 제한적입니다. 이러한 배양은 또한 저산소증, 괴사 및 주요 유전적 특징의 손실과 같은 요인으로 인해 장기간 유지하기 어렵습니다. 많은 사람들에 의해 &ldquomini-organs&rdquo라고 불리는 오르가노이드는 계통 특이적 분화 및 자가 조립을 나타내는 장기 특이적 세포 유형(줄기 세포 또는 전구 세포에서 유래)으로 구성됩니다. Matrigel과 같은 스캐폴딩 매트릭스는 개발 중인 미세 구조의 아키텍처를 지원하는 데 자주 사용됩니다. 오르가노이드에서 일어나는 자기 조직화의 수준은 상당히 현저하며 정상적인 장기 발달과 매우 유사합니다. 생체 내.

Q: 3D 세포 모델을 배양하고 사용하는 데 있어 몇 가지 주요 기술 및 실험 과제에 대해 논의할 수 있습니까?

NS: 3D 세포 모델 작업에는 약간의 예술 형식이 있습니다. 대뇌 오르가노이드의 경우 분화 과정의 각 단계는 타이밍에 따라 다릅니다. 적절한 성장 인자나 생물학적 신호를 투여하지만 부적절한 시기에 생성되는 결과 세포 유형에 광범위한 변화가 있을 수 있습니다. 따라서 매일 문화를 모니터링하고 문화가 제공하는 형태학적 단서를 따르는 법을 배우는 것이 중요합니다. 또한, 오르가노이드의 크기에 따라 샘플을 옮기거나 물리적으로 조작하려고 할 때 오르가노이드가 잘리거나 손상되기 쉽습니다. 따라서 모든 모델 시스템과 마찬가지로 실험을 설계할 때 3D 셀룰러 모델의 한계를 신중하게 고려해야 합니다.

Q: 샘플 크기와 타이밍의 중요성에 대해 언급했지만 3D 셀룰러 모델로 실험을 설계할 때 다른 문제가 발생했습니까?

NS: 전적으로! 내가 언급했듯이 오르가노이드는 종종 &ldquomini-organs&rdquo라고 하며 종종 작은 조직 조각과 유사합니다. 이 조직은 엄청나게 조밀할 수 있으므로 표준 형광 또는 공초점 현미경을 사용한 이미징 분석은 불가능하지는 않더라도 상당히 어려울 수 있습니다. 우리는 우리의 미니 뇌 내의 종양 부피를 이미징하는 데 매우 관심이 있었기 때문에 일부 실험을 위해 다중 광자 현미경과 광 시트 현미경을 활용했습니다. 이미징 해상도는 환상적이었지만 이러한 이미징 방식은 고유한 문제를 제시했습니다. 다광자 현미경은 살아있는 샘플을 오랜 시간 동안 고정해야 했습니다. 우리의 3D 모델이 생존을 유지하기 위해 인큐베이터 내에서 부드러운 교반이 필요했기 때문에, 종양의 생존 가능성에 영향을 미치지 않으면서 효과적으로 종양을 영상화하고 오르가노이드를 흔들리는 배양 환경으로 되돌릴 수 있는 가장 좋은 방법을 결정하기 위해 많은 시행착오가 있었습니다. 샘플 자체. 또는 광학 시트 현미경을 사용하여 고정된 3D 샘플에 대한 이미징이 가능했지만 샘플 준비 및 라벨링에는 몇 주가 소요될 수 있습니다.

우리가 직면한 또 다른 실험 과제는 정상적인 3D 미니 뇌에서 종양 세포를 분리하는 것이었습니다. 우리는 여러 시약과 조직 해리 방법을 시도했지만 마침내 특정 요구에 맞는 최적의 프로토콜을 설계했습니다. 모든 3D 모델에서 연구자는 묻고 싶은 생물학적 질문이 무엇인지, 어떤 판독 또는 분석 메트릭이 가장 의미가 있는지 고려해야 합니다.

Q: 3D 세포 모델에 대한 새로운 응용 프로그램은 무엇이며 얼마나 잘 표현합니까? 생체 내 과정과 결과?

NS: 3D 세포 모델은 최근 몇 년 동안 점점 더 정교해졌으며 신경 퇴행성 질환, 암, 심장 질환, 낭포성 섬유증 및 약물 중독을 포함한 다양한 질병 상태를 연구하는 데 사용됩니다. 또한 재생 의학에서 3D 모델의 활용이 빠르게 진행되고 있습니다. 3D 모델이 많이 찾는 이유 중 하나는 많은 모델의 생물학 및 병태생리학을 요약하기 때문입니다. 생체 내 프로세스. 높은 처리량의 약물 스크리닝을 위한 확장성과 함께 오르가노이드와 같은 3D 모델은 개인화된 의학에 접근할 수 있는 전례 없는 방법을 제공합니다. 예를 들어, 당사의 GLICO 모델을 사용하면 현재로서는 불가능한 방식으로 수백 개의 환자별 소형 뇌종양을 생성할 수 있습니다. 생체 내 교모세포종 모델.

Q: 3D 세포 배양 작업을 시작하려는 실험실 관리자에게 조언을 해주신다면?

NS: 3D 세포 배양은 비용이 많이 들지만 고품질 시약으로 작업하는 것이 매우 중요하며 아무리 유혹적일지라도 지름길을 사용하지 마십시오. 3D 문화 프로그램의 초기 구축 단계도 엄청나게 시간이 많이 걸립니다. 신입사원의 3D 문화 역량을 갖추는 데 필요한 교육 기간은 6개월에서 1년까지 다양합니다. 인내심에 어려움을 겪고 있다면 3D 모델 시스템의 세계로 진입하기로 한 결정을 재평가하고 싶을 수도 있습니다. 그러나 기꺼이 헌신한다면 발달 및/또는 질병 생물학 연구를 위한 가장 멋지고 가장 보람 있는 플랫폼 중 하나라는 것을 알게 될 것입니다.

Amanda Linkous는 이전에 Weill Cornell Medicine(뉴욕, NY)에서 Starr Foundation Cerebral Organoid Translational Core의 이사로 재직했습니다. 그녀는 국립 암 연구소(메릴랜드 베데스다)의 신경 종양학 분과에서 박사후 과정을 마쳤습니다. 그녀는 암 줄기 세포 생물학 및 종양 진행을 촉진하는 분자 신호 전달에 대한 광범위한 전문 지식을 보유하고 있습니다. 그녀는 소설을 설립했고, 생체 외 CNN Pioneers 및 특별판에 실린 인간 두뇌 및 mdasha 발견의 미니어처 모델과 종양 세포 간의 상호 작용 및 분자 누화를 연구하는 3D 시스템 과학


2D, 2차원 3D, 3차원 bFGF, 기본 섬유아세포 성장인자 CNS, 중추신경계 ECM, 세포외기질 EGF, 표피성장인자 HA, 히알루로난/히알루론산 HCS, 고함량 스크리닝 HDP, 행잉드롭 플레이트 HGF, 간세포 성장인자 HTS, 고처리량 스크리닝 IGF-1, 인슐린 유사 성장인자 1 iPSC, 유도만능줄기세포 MMP, Matrix metalloproteinase NGF, 신경성장인자 PDGF, 혈소판유래성장인자 PEG, 폴리에틸렌글리콜 TGF-β, 변형 성장 인자-β TIMP, 금속단백분해효소 VEGF의 조직 억제제, 혈관 내피 성장 인자.

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키워드: 3차원 세포 배양, 하이드로겔, 스페로이드, 고처리량 스크리닝, 세포외 기질

인용: Langhans SA (2018) 3차원 시험관 내 약물 발견 및 약물 재배치의 세포 배양 모델. 앞. 파마콜. 9:6. 도이: 10.3389/fphar.2018.00006

접수: 2017년 11월 27일 접수: 2018년 1월 3일
게시: 2018년 1월 23일.

일본 미에대학교 의과대학원 니시무라 유헤이

Franz Rl, Universitätsklinikum 프랑크푸르트, 독일
Johannes F. W. Greiner, 독일 빌레펠트 대학교

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