정보

Psudomonas putida의 적색 전사 리포터

Psudomonas putida의 적색 전사 리포터



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

전사 리포터를 구축해야 합니다. P. 푸티다 광독성을 줄이기 위해 높은 여기 파장으로 (지금까지 mNeonGreen을 사용해 왔으며 빨간색을 사용하고 싶습니다).

동료들은 다음과 같은 이유로 mCherry 및 mKate2를 사용한 이전 시도가 실패했다고 나에게 보고했습니다.

  • mCherry는 숙성 시간이 매우 길어 내 실험에 적합하지 않은 것 같습니다.
  • mKate2는 전혀 표정을 보이지 않았습니다

전사 기자에 대한 경험이 있는 사람이 있습니까? P. 푸티다? 어떤 아이디어? (DsRed? mKate로 재시도?)

저는 PsrI(siderophore 생성을 위한 시그마 인자) 조절 유전자의 발현을 측정하고 있습니다.


PQQ 의존성 알코올 탈수소효소의 효소 활성 및 전사 조절에서 란탄족의 기능적 역할 슈도모나스 푸티다 KT2440

알코올과 알데히드의 산화는 다양한 휘발성 유기 화합물(VOC)의 해독과 효율적인 이화작용에 중요합니다. 따라서 많은 그람 음성 박테리아는 종종 기능적으로 중복되는 pyrroloquinoline quinone-dependent alcohol dehydrogenases(PQQ-ADHs)를 기반으로 하는 주변 세포질 산화 시스템을 진화시켰습니다. 토양 거주 모델 유기체에서 정제된 효소 사용 슈도모나스 푸티다 현재 연구인 KT2440은 비메틸영양성 박테리아에서 란탄족 의존성 PQQ-ADH(PedH)의 첫 번째 설명과 특성을 보고합니다. PedH는 선형 및 방향족 1차 및 2차 알코올뿐만 아니라 알데히드를 포함하는 Ca 2+ 의존적 대응물인 PedE와 유사한 기질 범위에서 효소 활성을 나타내지만, La 3+ , Ce 3+ , Pr 3+ , Sm 3+ 또는 Nd 3+ . 리포터 분석은 PedH가 촉매 기능을 가질 뿐만 아니라 pedE 그리고 pedH, 아마도 감각 모듈로 작용할 것입니다. 특히, 기본 규제 네트워크는 생태학적 관련성이 있는 것으로 가정되는 농도인 1 – 10nM의 란탄에 반응합니다. 본 연구는 PQQ 의존적 산화 시스템이 다양한 휘발성 알코올과 함께 효율적인 성장에 중요하다는 것을 추가로 보여줍니다. 이러한 결과로부터 우리는 PedE 및 PedH의 기능적 중복성과 역 조절이 적응 전략을 나타낸다는 결론을 내립니다. P. 푸티다 KT2440은 다양한 란타나이드 가용성에 대응하여 휘발성 알코올로 성장을 최적화합니다.

중요성 낮은 생체 이용률로 인해 란탄족은 오랫동안 생물학적으로 불활성인 것으로 간주되어 왔습니다. 그러나 최근 몇 년 동안 메틸영양 세균의 보조인자로서 란탄족의 동정은 다양한 생물학적 분야에서 엄청난 관심을 불러일으켰습니다. 본 연구는 모델 유기체에 의해 생성된 두 개의 PQQ-ADH 중 하나가 P. 푸티다 KT2440은 또한 란타나이드를 보조인자로 활용하여 메틸영양체를 넘어 박테리아를 사용하는 란타나이드의 범위를 확장합니다. methyloptrophic 박테리아와 유사하게 복잡한 조절 네트워크는 P. 푸티다 KT2440. 우리는 또한 효소 중 적어도 하나의 기능적 생산이 여러 휘발성 알코올과의 효율적인 성장에 중요하다는 것을 보여줍니다. 전반적으로, 우리의 연구는 많은 유기체에서 관찰되는 PQQ-ADH의 중복성에 대한 새로운 이해를 제공하고 특히 토양 환경에서 박테리아 대사에 대한 란탄족의 중요성을 더욱 강조합니다.


Psudomonas putida의 적색 전사 리포터 - 생물학

<div><p>식물 성장 촉진 박테리아의 뿌리 집락화는 여러 요인에 의해 영향을 받는 복잡한 다단계 과정입니다. 예를 들어, 식물 뿌리에 부착하는 동안 박테리아는 식물에서 생성되는 활성 산소종(ROS)을 견뎌야 합니다. 이 연구에서 우리는 글로벌 전사 조절자 Fis가 <i>Pseudomonas putida</i>의 ROS 내성 조절에 관여하여 보리 뿌리 집락화에 영향을 미친다는 것을 보고합니다. <i>Fis</i>의 과발현은 ROS 내성과 보리 뿌리에 대한 부착을 모두 감소시켰고 막 결합 전자 수송 사슬의 첫 번째 효소인 NADH 탈수소효소 I을 코딩하는 <i>nuoA-N>/i 오페론의 전사를 활성화했습니다. <i>fis</i>-과발현 배경에서 <i>nuoA-N</i> 녹아웃 돌연변이는 보리 뿌리에 대한 ROS 내성 및 부착성을 증가시켰다. 우리는 <i>nuoA</i>가 코딩 서열의 상류에 있는 104개 및 377개 뉴클레오티드에 위치한 2개의 전사 시작 부위를 갖고 있음을 보여주며, 이는 2개의 프로모터의 존재를 나타냅니다. DNase I 발자국 분석은 이 두 프로모터 사이에 위치한 Fis-nuo1에서 Fis-nuo4까지 4개의 Fis 결합 부위를 밝혀냈습니다. 프로모터-lacZ 리포터 및 β-갈락토시다제 분석에서 부위 지정 돌연변이 유발은 Fis-nuo2 및 아마도 Fis-nuo4에 대한 Fis의 직접 결합을 추가로 확인했지만 Fis-nuo1 및 Fis-nuo3에는 그렇지 않았습니다. 또한, 결과는 Fis-nuo4에 대한 Fis 결합이 업스트림 DNA 토폴로지의 변형에 의해 <i>nuoA-N</i> 오페론의 전사에 영향을 미칠 수 있음을 암시했다. 또한, 우리의 트랜스포존 돌연변이 유발 결과는 Fis가 NADH를 사용하는 여러 대체 ROS 해독 과정의 조절에 관여할 수 있음을 나타냅니다.</p></div


소개

슈도모나스 푸티다 KT2440은 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(GRAS) 인증 균주로 분류되는 그람 음성 토양 세균이다(Loeschcke and Thies, 2015 Nikel and de Lorenzo, 2018). 이 균주는 빠른 성장, 고유한 대사 다양성 및 가혹한 환경 조건에서의 높은 견고성으로 인해 산업 응용 분야에서 상당한 주목을 받았으며, 이는 환경 오염 및 대사 공학의 생물학적 복원에 특히 적합한 특성입니다(Nikel). ., 2016년 Nikel 및 de Lorenzo, 2018년). 또한 게놈 규모의 대사 모델은 P. 푸티다 KT2440은 시스템 수준에서 균주의 다양한 대사를 더 잘 이해하기 위해 개발되었으며, 이는 생명공학 구현을 위한 표현형을 재프로그래밍하는 데 적용되었습니다(Nogales ., 2008 손 ., 2010 Hintermayer 및 Weuster-Botz, 2017). 실제로, 유전자 발현 및 게놈 공학을 위한 시스템을 포함하여 잘 확립된 분자 생물학적 도구가 P. 푸티다 KT2440, 대사 공학으로 바이오 연료 및 의약품 생산 (Martínez-García and de Lorenzo, 2011 Cook ., 2018 ).

하지만 P. 푸티다 KT2440은 대사 공학, 합성 생물학 및 생물학적 치료를 위한 섀시로 널리 사용되어 왔으며 관심 유전자의 서열 특이적 조절을 위한 신뢰할 수 있고 표준화된 방법이 없습니다. 최근 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) 및 CRISPR 관련(Cas) 단백질이 박테리아를 포함한 다양한 유기체에 대한 다용도 게놈 편집 도구로 등장했습니다(Cho ., 2018), 포유동물 세포(Komor ., 2017) 및 식물(Ma ., 2016). 게놈 편집 외에도 CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR 간섭(CRISPRi)(Qi ., 2013). CRISPR-Cas 시스템과 마찬가지로 CRISPRi는 또한 뉴클레아제-결핍 Cas9(dCas9) 단백질과 표적 DNA 서열에 상보적인 20-뉴클레오티드(nt) 스페이서 서열을 포함하는 특별히 설계된 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 필요합니다. 그런 다음 dCas9-sgRNA 복합체는 표적 DNA 가닥에 결합하여 RNA 중합효소 결합(Qi)을 차단하여 전사 개시 또는 연장을 방해합니다. ., 2013). CRISPRi 시스템은 다음을 포함한 많은 유기체에서 표적 유전자의 서열 특이적 조절을 위한 매우 간단하고 효율적인 도구로 널리 사용되었습니다 대장균 (기 ., 2013 ), 고초균 (피터스 ., 2016) 및 포유동물 세포(Gilbert ., 2013 ).

CRISPRi 기반 유전자 조절은 일부에서 보고되었습니다. 슈도모나스 종 탠 껍질 . (2018)은 동적 유전자 억제를 실현하기 위한 조정 가능한 CRISPRi 시스템을 개발했습니다. 녹농균 유형 II dCas9 동족체를 사용하여 연쇄상 구균 파스퇴리아누스. 구체적으로, 그들은 발현하기 위해 두 개의 플라스미드를 구성했습니다. dCas9 P의 유전자와 sgRNA라크 그리고 피테트 각각 프로모터. 그러나 개발된 2개의 플라스미드 CRISPRi 시스템은 dCas9 유전자 녹농균, 이는 인듀서가 없을 때 표적 유전자의 억제를 초래했습니다. 또한 type I CRISPR-dCas 시스템이 전사 억제자로 채택되었습니다. 녹농균 PA14, 삭제가 필요한 캐스3 유전자 녹농균 또는 프로파지(Bondy-Denomy ., 2015). 보다 최근에는 dCas9를 사용하여 CRISPRi 기술이 개발되었습니다. 화농성 연쇄상구균 (SpdCas9)에서 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 사용하여 기능을 입증했습니다. P. 푸티다 KT2440(일 ., 2018). 그러나 이 연구는 대사 공학 또는 합성 생물학에 CRISPRi 적용이 부족했습니다. P. 푸티다 KT2440.

여기에서 우리는 표적 유전자의 간단하고 효율적인 조절을 달성하기 위한 l-rhamnose-inducible single-plasmid CRISPRi 시스템을 제시합니다. P. 푸티다 KT2440. 이 조절 가능한 CRISPRi 시스템은 내인성 및 외인성 유전자의 발현을 제어할 수 있었습니다. P. 푸티다 KT2440. 우리는 또한 무수한 테르페노이드의 생합성을 위한 주요 중간 대사산물인 메발로네이트(MVA)의 생산을 향상시키기 위한 대사 플럭스 변경에 대한 적용 사례를 제공합니다. 슈도모나스 푸티다 KT2440은 유일한 탄소원인 글리세롤에서 연장된 지연 단계를 나타내므로 이 지연 단계를 줄이기 위한 전략은 테르페노이드의 미생물 생산을 위해 비용 효율적인 재생 가능 자원을 사용하는 균주의 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 글리세롤 대사에 관여하는 핵심 조절제를 사용하여 P. 푸티다 단일 플라스미드 CRISPRi 시스템의 표적 유전자인 KT2440은 내인성 유전자 발현 조절을 위한 강력한 플랫폼임이 입증되었습니다. 따라서 이 시스템은 대사 공학을 가속화할 수 있습니다. P. 푸티다 미래에 산업적으로 가치 있는 제품을 생산할 수 있는 미생물 세포 공장의 발전을 위한 KT2440.


논의

미생물에서 부가가치 이소프레노이드의 생명공학적 생산을 위한 IPP 및 DMAPP의 공급을 개선하는 것이 많은 연구의 목표였습니다. 그러나 세포의 적합성에 영향을 미치지 않으면서 이소프레노이드를 효율적으로 생산하려면 다른 많은 요인을 고려해야 합니다. 여기에는 (A) 대사 기질의 고갈, (B) 축적된 중간체 또는 최종 생성물의 독성, (C) 세포 저장 용량의 포화가 포함됩니다. 마지막 두 가지 문제를 처리하기 위한 전략은 풍부하지만, 피루브산 및 GAP와 같은 중추 대사 산물의 풀을 IPP 및 DMAPP 합성으로 전환하는 부정적인 성장 영향에도 불구하고 첫 번째 문제에 대해서는 덜 관심을 기울였습니다. IPP 및 DMAPP 공급을 개선하기 위한 대부분의 연구는 다음과 같이 잘 특성화된 유기체에 대해 수행되었습니다. 대장균 (MEP 경로를 사용하는 박테리아에 대한 모델) 및 S. 세레비지애 (MVA 경로만 사용하는 효모 모델), 높은 이소프레노이드 역가의 생산 및 축적에 대한 추가 이점을 나타내는 다른 미생물은 거의 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이것은 다음과 같은 경우입니다. P. 푸티다, 모노테르펜과 같은 독성 화합물에 대해 매우 높은 내성을 나타내는 박테리아[4, 5]. 의 추가 이점 P. 푸티다 포도당이 대사되어 균형 잡힌 양의 MEP 경로 기질인 피루브산과 GAP를 생성한다는 것입니다[6, 10, 23]. 이러한 중심 대사 기질은 다음과 같은 다른 박테리아에서 동등하지 않은 양으로 생성됩니다. 대장균, 여기서 pyruvate와 GAP의 불균형한 가용성은 MEP 경로의 활동을 제한할 수 있습니다[24]. 피루브산과 GAP 모두의 수준을 증가시킵니다. P. 푸티다 실제로 카로티노이드(β-카로틴) 생산의 증가(1.3배)로 이어졌으며[10], 이는 대사 기질의 공급이 MEP 경로 플럭스를 제한함을 시사합니다. 여기에 보고된 우리의 데이터는 피루브산과 GAP의 적절한 공급을 보장하는 것이 이소프레노이드 생산을 상향 조절하는 동시에 불완전한 성장으로 이어지는 전반적인 미생물 대사에 대한 주요 간섭을 방지하는 데 중요하다는 결론을 추가로 뒷받침합니다.

내인성 MEP 경로를 통해 이소프레노이드 전구체로 대사 플럭스를 자극하는 다양한 방법을 조사하기 위해 우리는 P. 푸티다 외인성 3-유전자 오페론으로 균주(KTLYC)를 판독하여 리코펜을 생성합니다. 이 균주를 플라스미드로 형질전환하여 내인성 MEP 경로 유전자를 과발현하거나 대체 션트 경로를 통합함으로써 리코펜 생산(즉, IPP 및 DMAPP 공급)을 3(nDXS 사용 그림 8), 7(MVA 경로 그림 3 사용)으로 늘릴 수 있습니다. ), 25(DXS 그림 4 포함) 및 50(DXS 및 DXR 그림 10 포함). 그러나 이러한 전략 중 적어도 일부를 추가로 최적화하거나 몇 가지를 조합하면 더 높은 증가율을 얻을 수 있습니다. MEP 경로 기질의 공급을 개선함으로써 추가 및 상승 효과를 얻을 수도 있습니다. 최근의 예는 전선의 재배선이다. P. 푸티다 천연 Entner-Doudoroff에서 선형 Embden-Meyerhof-Parnas 해당과정으로의 포도당 동화를 위한 핵심 대사는 피루브산과 GAP의 생산을 향상시켰습니다[10]. 에 의해 표시되는 대사 가소성 P. 푸티다지방산, 글리세롤 및 방향족 화합물을 포함한 다양한 탄소원을 대사할 수 있는 , [25]는 IPP 및 DMAPP 합성에 필요한 기질 풀을 재설계할 수 있는 추가적인 기회를 제공합니다. 박테리아에 다른 탄소 공급원을 공급하면 피루브산, GAP(즉, 포도당) 또는 아세틸-CoA(즉, 지방산)의 더 높은 풀을 축적하는 데 도움이 될 수 있으며 다른 탄소 공급원의 조합은 하우스키핑(내인성) 대사. 다른 탄소원의 계층적 활용[26]은 세포에서 생산적 경로와 하우스키핑 경로를 동시에 공급하기 위해 완전히 활성인 대사 경로를 결합하는 능력을 제한할 수 있습니다. 그러나 이 계층 구조를 제어하는 ​​메커니즘에 대한 우리의 지식은 지속적으로 개선되어[27, 28] 새로운 엔지니어링 기회를 제공합니다.

여기에서 테스트한 새로운 전략 중에서 Ru5P에서 DXP를 생산하기 위한 nDXS의 사용은 세포 성장에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 최대 3배까지 리코펜 축적을 개선했기 때문에 가장 성공적이었습니다(그림 8). 이 증가는 아직 표준 DXS 효소로 달성된 것과는 거리가 멀지만(그림 4), nDXS가 점 돌연변이의 결과로 DXP를 생산하는 능력을 획득한 돌연변이 효소로 확인되었다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. DXP 합성에 최적화되어 있지 않습니다. 우리의 추정은 Ru5P 기질의 약 10%만이 nDXS에 의해 DXP로 변환된다는 것입니다. 돌연변이 효소의 DXS 활성을 증가시키는 것은 적응 실험실 진화 접근법에 사용할 수 있는 새로운 자동화 플랫폼을 사용하는 경우 실현 가능하고 심지어 빨라야 합니다[29, 30]. 최적화된 nDXS는 표준 DXS를 사용하는 보완 전략을 통해 nDXS에 의한 Ru5P의 변환에서 얻은 추가 DXP 입력으로 성장에 영향을 미치지 않는 한계까지 피루베이트 및 GAP를 사용하는 MEP 경로를 푸시할 수 있습니다. 야생형 ribB 단백질[31]의 결정 구조의 이용 가능성은 새로 선택된 돌연변이가 nDXS의 DXS 활성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 추론할 수 있도록 해야 합니다. 이 정보는 궁극적으로 DXP를 생산할 수 있는 합성 효소를 생성하는 데 매우 가치가 있을 수 있는 정보입니다. Ru5P 또는 내인성 MEP 경로 또는 박테리아의 기타 필수 대사 과정을 방해하지 않는 기질에서. 보완 전략으로 Ru5P의 공급은 5탄당 인산 경로를 재배선함으로써 향상될 수 있습니다. Ru5P는 C5 기질이므로 탄소 손실 없이 nDXS에 의해 DXP로 전환됩니다(두 개의 C3 전구체로 시작하여 탈카르복실화를 포함하는 DXS에 의해 촉매되는 반응 제외). 함께, nDXS의 최적화된 버전을 단독으로 또는 다른 전략과 함께 사용하면 IPP 및 DMAPP 생산을 새로운 높은 수준으로 높일 수 있습니다.

우리가 테스트한 또 다른 새로운 전략은 세포 성장 스트레스에 반응하는 내인성 프로모터를 사용하여 DXS 발현을 미세하게 조절하는 것이었습니다(그림 6). 사용 프카타 프로모터 우리는 빈 플라스미드 대조군과 비교하여 리코펜 축적의 4배 증가만을 달성했으며, 이는 테스트된 조건에서 이 프로모터의 전사 활성이 MEP 경로를 효과적으로 부스트하기에는 너무 낮아 결국 전사를 억제할 수 있는 스트레스 조건에 도달할 수 없음을 시사합니다. 더 강력하지만 여전히 스트레스에 반응하는 프로모터를 사용하는 것이 더 효과적일 수 있습니다. NS 프카타 프로모터는 조절 특성을 유지하면서 전사 활성을 증가시키도록 조작될 수 있습니다. 대안적으로, 다른 농도의 IPTG의 존재하에 성장한 KTLYC(p424-DXS) 세포의 전사체 분석은 세포가 정상적으로 성장할 때 고도로 발현되지만 세포 성장이 IPTG 의존적 방식으로 손상될 때 억제되는 유전자를 식별할 수 있도록 해야 합니다 (즉, DXS 활동이 너무 높을 때). 그런 다음 이러한 유전자의 프로모터는 합성 오페론에 사용되어 DXS(및 IDI, DXR, nDXS 등)의 공급을 증가시키고 따라서 최적의 성장 조건에서 이소프레노이드 전구체의 가용성을 증가시킬 수 있지만 성장 억제 효과가 나타날 때 하향 조절합니다 나타나다. 이것은 세포가 신진 대사를 재조정하고 나중에 이소프레노이드 과잉 생산을 다시 취할 시간을 줄 것입니다.

우리가 테스트한 보다 "고전적인" 접근 방식, 즉 아세틸-coA에서 IPP 및 DMAPP를 생성하기 위한 외인성 MVA 경로의 사용 및 MEP 경로 유전자의 과발현을 통해 우리는 하나의 박테리아로 얻은 결과를 직접 외삽할 수 없다는 결론을 내렸습니다. (예 대장균) 다른 박테리아(예: P. 푸티다). 예를 들어, MVA 경로를 사용하면 일반적으로 DXS 상향 조절보다 더 잘 작동합니다. 대장균 [32,33,34] 그러나 우리는 반대 행동을 관찰했습니다. P. 푸티다. 유사한 관찰이 이전에 이소프렌을 생성하기 위해 광독립영양 조건에서 성장하는 남조류에서 보고되었습니다[35]. 박테리아 MVA 경로 오페론의 존재는 리코펜 축적을 7배 향상시켰으며(그림 3), 모노테르펜 생산에 대해 동일한 오페론을 유발하는 것으로 보고된 10배 증가와 유사합니다. P. 푸티다 DSM 12264 셀 [4]. 대조적으로, DXS를 포함하는 플라스미드의 존재는 유도 없이 KTLYC 세포에서 리코펜 축적을 15배까지 촉진할 수 있었습니다(그림 4b). DXS의 제한적인 역할이 방출될 때 리코펜 합성에 대한 IDI 과잉 생산의 효과가 거의 완전히 부족합니다. P. 푸티다 (그림 4d)도 에서 관찰 된 것과 다릅니다. 대장균 [29].


논의

뿌리 식민지화는 유해하거나 반대로 유익한 영향을 줄 수 있는 식물 뿌리 근처의 비생물적 및 생물적 요인 모두에 의해 영향을 받습니다. 성공적인 식민지화를 위해서는 박테리아가 식물의 존재를 인식하고 유해한 요인의 역효과에 대처하고 식물 뿌리 표면에 성공적으로 부착해야 합니다.

우리는 이전에 다음과 같이 설명했습니다. 주먹-과발현은 생물막 형성과 랩에이 ~에 NS. 푸티다 [22,23,31]. LapA는 세포 표면에 필요한 단백질입니다. NS. 푸티다 생물 및 비생물 표면에 부착 [23,45]. 따라서, 주먹- 과잉 표현 NS. 푸티다 보리 뿌리에 대한 박테리아의 부착을 증가시켜야 하며 이전에 설명한 바와 같이 식민지화의 첫 번째 단계를 감소시키지 않아야 합니다[31]. 우리는 Fi가 ROS 내성 조절에 관여할 수 있다고 가정했습니다. NS. 푸티다 그리고 접착력 감소 주먹-집락화의 첫 번째 단계에서 과발현 균주 F15는 외인성 ROS에 대한 민감도 증가의 결과일 수 있습니다.

사실 과도하게 표현하면 주먹 ~에 NS. 푸티다 H 감소2영형2- 세포의 내성, 예상대로 카탈라아제 유전자 추가 카타 의 민감도를 완화시켰다. 주먹-ROS에 대한 과발현 균주(그림 1B). 게다가 과도하게 표현된 주먹 ~에 NS. 푸티다 내인성 ROS의 양을 증가시키고 보리 뿌리의 집락화 능력을 감소시켰는데, 이는 갈산 보충에 의해 세포외 ROS의 양이 증가될 때 훨씬 더 감소되었다(그림 2). 동시에, 야생형 균주는 보리 뿌리에서 갈산 증가 ROS에 민감하지 않았다(그림 2C). 우리는 보리 뿌리의 ROS에 대한 민감도가 박테리아 세포의 생리학적 조건에 따라 달라질 수 있다고 제안합니다. 아마도 야생형 균주는 보상 메커니즘을 사용하여 보리 뿌리에서 방출되는 외인성 ROS를 해독할 수 있었고, NS. 푸티다 과장된 표현으로 주먹 아니였다. 이것은 Fis가 일부 특정 유전자의 전사를 조절함으로써 ROS 내성에 영향을 미칠 수 있는지에 대한 의문을 제기했습니다.

우리는 박테리아의 ROS 내성을 조절할 수 있는 Fis 의존성 유전자를 확인하기 위해 트랜스포존 돌연변이 유발을 수행하고 19개의 미니 Tn을 확인했습니다.5 F15에 삽입 누아엔 오페론 유전자. 이 발견은 누아엔 Fis에 의한 오페론은 내인성 ROS를 감소시키는 대체 메커니즘으로 ROS 내성에 관여할 수 있습니다. 과연, 삭제 누아엔 내인성 ROS 감소 주먹-과발현 세포(그림 2B) 및 외인성 ROS에 대한 내성 증가(그림 1B). 유전자 누아 에게 세포질막에서 NADH 탈수소효소 I에 조립되는 NuoA-N 단백질을 암호화합니다[15,46,47]. 이 복합체는 막을 가로지르는 양성자 전위와 관련된 반응에서 2개의 전자를 NADH에서 퀴논으로 전달하는 것을 촉매하는 호흡 사슬 효소입니다[48].

두 가지 가설이 NADH 탈수소효소 I이 내인성 ROS의 양에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 설명할 수 있습니다: ROS 자체를 생성하거나 환원제 NADH를 고갈시킵니다. 전자 수송 중에 NADH 탈수소효소 I이 다음에서 ROS를 생성할 수 있음이 밝혀졌습니다. 대장균 [16]. 이 경우, ROS는 NADH 산화 및 보조인자 FMN을 통한 전자 수송 동안 발생할 수 있다[16]. 또는 환원제인 NADH의 고갈이 내인성 ROS를 증가시킬 수 있습니다. 예를 들어, 성장 배지에 있는 항생제의 존재는 많은 산화 스트레스 유전자를 유도합니다. NADH 퍼옥시다제 및 글루타티온 환원효소[21], 이에 따라 박테리아는 ROS 해독에 사용하기 위해 NADH가 필요합니다. 따라서 강제 표현은 누아엔 유전자 주먹-과발현은 NADH의 결핍을 일으켜 내인성 ROS의 해독을 불가능하게 할 수 있습니다. 어떤 가설이 사실이든 F15ΔnuoA-N에 대한 내인성 및 외인성 ROS의 합이 더 낮으면 외인성 ROS에 대한 박테리아의 내성이 높아지고 집락화 효율이 증가합니다(그림 1B, 2C 및 2D). 또한, F15와 달리 F15ΔnuoA-N의 집락화 효율은 주먹-과발현 배경(그림 2C). 의 첨부인 것 같다. NS. 푸티다 우리가 이전에 보고한 바와 같이 ROS의 해독과 주요 접착인 LapA의 존재라는 두 가지 요인에 따라 달라집니다. 주먹-과잉 표현은 표현을 증가시킵니다. 랩에이 [22,23]. 따라서 박테리아가 ROS를 효과적으로 해독할 수 있는 경우 세포 표면의 증가된 양의 LapA는 뿌리에 대한 부착을 향상시킬 것입니다.

미니 Tn의 식별5 환원력의 유지를 담당하는 여러 다른 유전자의 삽입은 NAD(P)H 고갈 가설을 뒷받침합니다. 비록 소수의 mini-Tn5 메티오닌 생합성 유전자로의 삽입이 선택되었고, mini-Tn5 PP_5275에 삽입 및 메트R-1 (PP_1063) H를 복원했습니다.2영형2- 에도 불구하고 야생형 수준에 대한 내성 주먹-과발현(S3 테이블). ROS는 생체 분자, 특히 단백질의 티올 잔기를 산화시켜 티올 스트레스를 생성하여 효소를 비활성화할 수 있는 이황화 결합을 생성하는 것으로 알려져 있습니다[49]. 따라서 박테리아는 단백질의 이황화 결합을 줄이기 위해 환원력이 필요하며 메티오닌 생합성에 사용되는 NADPH는 박테리아에서 ROS를 해독하는 강력한 환원제입니다[50,51]. 따라서 Fis의 증가된 양은 산화된 생체 분자의 환원에 영향을 미칠 수 있습니다. NS. 푸티다 자연 환경에서 하향 조절되는 메티오닌 생합성을 유지하기 때문입니다. 식물 뿌리는 식물 성장 촉진 박테리아를 유인하기 위해 아미노산을 분비하기 때문에[52,53], 식물 뿌리 근처의 박테리아에서 아미노산 생합성이 하향 조절될 가능성이 더 높습니다. 하향 조절의 이유는 아마도 에너지를 절약할 뿐만 아니라 NADPH와 같은 환원제의 고갈을 피하기 위함일 것입니다.

또한 케톤산은 NADPH와 무관한 방식으로 ROS를 중화할 수 있습니다[54]. 예를 들어, ROS가 과도하면 이황화 결합을 감소시키는 데 사용되는 Krebs 순환 대사산물인 알파-케토글루타레이트의 축적이 향상됩니다. 슈도모나스 플루오레센스 [54]. 따라서 mini-Tn의 삽입이 가능하다.5 메티오닌 생합성 및 알파-케토글루타레이트 대사 유전자에서 티올 스트레스 완화 주먹-과발현 배경(S3 표). 따라서 식민지화 과정에서 박테리아는 대사를 조절하여 외인성 ROS의 발현을 하향 조절함으로써 외인성 ROS의 독성 효과에 대처할 수 있습니다. 누아엔 오페론과 NADH, NADPH 및 케톤산의 양을 높게 유지하여 환원력을 증가시킵니다.

상당한 수의 트랜스포존 돌연변이체에 트랜스포존 삽입이 있었기 때문에 누오 오페론 유전자와 4개의 잠재적인 Fis 결합 부위가 상류 서열에서 예측되었다. 누아 유전자, 우리는 Fis에 의한 이 오페론의 조절을 깊이 연구했습니다. 조직 누아엔 유전자는 다른 박테리아에서 유사합니다: 그들은 하나의 오페론에 위치하며 이자형. 대장균, 살모넬라 엔테리카 그리고 NS. 형광등 [15,55,56]. 유사한 존재 누오 오페론 구조 NS. 푸티다 을 의미한다 누아엔 오페론 유전자는 NS. 푸티다 또한.

NS 누아엔 오페론 NS. 푸티다 두 명의 발기인이 앞에 있습니다. 누아 유전자와 이러한 프로모터는 RpoS에 의해 간접적으로 하향 조절됩니다(그림 4). Fis는 Fis 의존성 프로모터의 상류에 있는 다중 결합 부위에 결합하고(그림 5 및 6) 전사를 상향 조절합니다(그림 7). 이러한 결과는 누오-오페론 NS. 푸티다 박테리아가 ROS를 중화할 에너지를 갖고 스트레스에 의해 하향 조절될 때, 추가 ROS의 해독 가능성이 감소할 때 영양소의 존재하에 강화된다. 우리의 결과는 두 개의 Fis 결합 부위가 NS. 푸티다 누아 전적으로. 근위 Fis 결합 부위 Fis-nuo2는 5' 말단에서 약 -70 bp에 위치합니다. 누아 mRNA N-I(그림 3). 이러한 거리는 RNA 중합효소와 직접적으로 상호작용하는 활성제의 특징입니다[57]. Fis-nuo4로 표시된 영역은 아마도 DNA 토폴로지의 조절을 통해 전사 조절에도 관여하는 것으로 보입니다. Fis-nuo4는 5' 끝에서 -290bp에 위치합니다. 누아 mRNA N-I(그림 3)는 DNA 루프를 생성함으로써만 이 거리에서 전사를 활성화할 수 있습니다. 따라서 우리는 Fis-nuo4에 대한 Fi의 결합이 Fis-nuo4의 전사를 향상시키는 DNA 토폴로지를 변경할 수 있다고 제안합니다. 누아엔 오페론.

결론적으로, 이 연구에서 우리는 ROS 내성 및 보리 뿌리 집락화에 대한 글로벌 레귤레이터 Fis의 관여를 설명했습니다. NS. 푸티다. ROS 내성 및 뿌리 집락화 효율에 대한 Fis의 부정적인 영향은 Fis의 전사 수준 향상을 통해 나타날 수 있습니다. 누아엔 오페론과 내인성 ROS의 축적. Fis는 프로모터 영역에 결합합니다. 누아엔 오페론은 오페론 프로모터의 상류에 있는 Fis-nuo2 및 Fis-nuo4 부위에 결합하여 전사를 촉진합니다.


차동 응답 NS벤 의 발기인 NS슈도모나스 푸티다 mt-2에서 BenR 및 XylS로의 대사 충돌 방지 미디엄-크실렌 생분해

NS슈도모나스 푸티다 mt-2는 벤조에이트 대사에 대한 두 가지 대안적이고 잠재적으로 상충되는 경로를 포함합니다. 메타 에 의해 인코딩된 경로 자일 pWW0 플라스미드의 유전자와 마스터 NS미디엄 프로모터 및 XylS, 염색체로 인코딩된 하나 직교 에 의해 시작된 경로 NS 및 BenR 단백질. 모든 교차 활성화 NS XylS에 의한 프로모터는 분해 과정에서 대사 충돌을 일으켜야 합니다. 미디엄-자일렌은 중간체로 생성된 3-메틸벤조에이트(3MBz)가 직교 경로를 생성하고 독성 막 다른 대사 산물을 생성합니다. 활성화 NS XylS에 의해 리포터 기술과 두 가지의 메신저 RNA 개시 주변의 관심 서열을 표적으로 하는 타일링 어레이를 모두 사용하여 재방문했습니다. NS 그리고 NS미디엄 발기인. 초민감성 분석 luxCDABE 융합, 검사 자일X ~ 대 베나 성적표 및 성장 테스트 벤R 돌연변이는 다양한 조건에서 XylS의 자연 발현 범위가 NS 세포가 내인성 또는 외인성 3MBz에 직면하는지 여부. 이것은 전사 인자를 결합하는 연산자의 특성에서 비롯된 것으로 보입니다. NS 의 발기인 NS. 푸티다 mt-2는 XylS와의 강한 상호작용을 피하기 위해 진화한 것으로 보입니다.


내용물

대부분의 박테리아 속과 마찬가지로 슈도모나드[주 1]의 마지막 공통 조상은 수억 년 전에 살았습니다. 그들은 Walter Migula에 의해 처음 확인되었을 때 19세기 말에 처음 분류되었습니다. 그 이름의 어원은 당시 명시되지 않았으며 7판에 처음 등장했다. Bergey의 체계적인 세균학 매뉴얼 (박테리아 명명법의 주요 권위) 그리스어로 가짜 (ψευδής) "거짓" 및 -모나스 (μονάς/μονάδος) "단일 단위", 이는 거짓 단위를 의미할 수 있지만, Migula는 아마도 그것을 거짓으로 의도했을 것입니다. 모나스, nanoflagellated protist [7] (이후 "monad"라는 용어는 미생물학의 초기 역사에서 단세포 유기체를 나타내기 위해 사용되었습니다). 곧, Migula의 다소 모호한 원래 설명과 일치하는 다른 종들이 많은 자연 적소에서 분리되었고, 당시 많은 종들이 속으로 지정되었습니다. 그러나 많은 균주가 보다 최근의 방법론과 보존적 거대분자 연구와 관련된 접근 방식을 기반으로 재분류되었습니다. [8]

최근에, 16S rRNA 서열 분석은 많은 박테리아 종의 분류 체계를 재정의했습니다. [9] 결과적으로 속 슈도모나스 이전에 속으로 분류된 균주를 포함합니다. 크리세오나스 그리고 플라비모나스. [10] 이전에 속으로 분류된 기타 균주 슈도모나스 지금은 속으로 분류됩니다 부르크홀데리아 그리고 랄스토니아. [11] [12]

2020년에는 494개의 계통분석이 완료됩니다. 슈도모나스 게놈은 두 개의 잘 정의된 종을 확인했습니다(녹농균 그리고 P. 클로로라피스) 및 4개의 더 넓은 계통 발생 그룹(P. fluorescens, P. stutzeri, P. syringae, P. putida) 사용 가능한 프로테옴의 충분한 수. [13] 4개의 더 넓은 진화 그룹에는 평균 뉴클레오티드 동일성 수준에 따른 종의 정의에 따라 하나 이상의 종이 포함됩니다. [14] 또한 계통유전체학적 분석을 통해 잘못된 종이나 진화 그룹에 잘못 주석이 달린 여러 균주를 확인했습니다. [13] 이 잘못된 주석 문제는 다른 분석에서도 보고되었습니다. [15]

2000년에, a의 완전한 게놈 서열 슈도모나스 종은 더 최근에 결정되었으며, 다음을 포함한 다른 균주의 서열이 결정되었습니다. 녹농균 균주 PAO1(2000), P. 푸티다 KT2440(2002), P. 단백질 Pf-5(2005), P. 주사기 파토바 토마토 DC3000(2003), P. 주사기 파토바 주사기 B728a (2005), P. 주사기 파토바 파세솔리카 1448A(2005), P. 형광 Pf0-1 및 P. 엔토모필라 L48. [8]

2016년까지 400종 이상의 슈도모나스 서열화되어 있었다. [16] 수백 종의 게놈을 시퀀싱한 결과 속 내에서 매우 다양한 종들이 밝혀졌습니다. 실제로 많은 게놈이 슈도모나스 유전자의 50-60%만 공유합니다. 녹농균 그리고 P. 푸티다 5350개 중 2971개 단백질만 공유(또는

2020년까지 500개 이상 완공 슈도모나스 게놈은 Genebank에서 구할 수 있었습니다. 계통유전체 분석은 494개의 완전한 프로테옴을 활용하고 모든 균주가 공유하는 297개의 핵심 오르토로그를 확인했습니다. [13] 속 수준에서 이 핵심 오르토로그 세트는 대사, 번역 및 전사에 관여하는 단백질에 대해 풍부하고 전체 속의 계통수를 생성하는 데 사용되어 슈도모나스 주요 진화 그룹. [13] In addition, group-specific core proteins were identified for most evolutionary groups, meaning that they were present in all members of the specific group, but absent in other 슈도모나드. For example, several 녹농균-specific core proteins were identified that are known to play an important role in this species' pathogenicity, such as CntL, CntM, PlcB, Acp1, MucE, SrfA, Tse1, Tsi2, Tse3, 그리고 EsrC. [13]

Members of the genus display these defining characteristics: [17]

Other characteristics that tend to be associated with 슈도모나스 species (with some exceptions) include secretion of pyoverdine, a fluorescent yellow-green siderophore [18] under iron-limiting conditions. Certain 슈도모나스 species may also produce additional types of siderophore, such as pyocyanin by 녹농균 [19] and thioquinolobactin by 슈도모나스 플루오레센스,. [20] 슈도모나스 species also typically give a positive result to the oxidase test, the absence of gas formation from glucose, glucose is oxidised in oxidation/fermentation test using Hugh and Leifson O/F test, beta hemolytic (on blood agar), indole negative, methyl red negative, Voges–Proskauer test negative, and citrate positive.

슈도모나스 may be the most common nucleator of ice crystals in clouds, thereby being of utmost importance to the formation of snow and rain around the world. [21]

Biofilm formation Edit

All species and strains of 슈도모나스 have historically been classified as strict aerobes. Exceptions to this classification have recently been discovered in 슈도모나스 생물막. [22] A significant number of cells can produce exopolysaccharides associated with biofilm formation. Secretion of exopolysaccharides such as alginate makes it difficult for pseudomonads to be phagocytosed by mammalian white blood cells. [23] Exopolysaccharide production also contributes to surface-colonising biofilms that are difficult to remove from food preparation surfaces. Growth of pseudomonads on spoiling foods can generate a "fruity" odor.

항생제 내성

대부분 슈도모나스 종 are naturally resistant to penicillin and the majority of related beta-lactam antibiotics, but a number are sensitive to piperacillin, imipenem, ticarcillin, or ciprofloxacin. [23] Aminoglycosides such as tobramycin, gentamicin, and amikacin are other choices for therapy.

This ability to thrive in harsh conditions is a result of their hardy cell walls that contain porins. Their resistance to most antibiotics is attributed to efflux pumps, which pump out some antibiotics before they are able to act.

녹농균 is increasingly recognized as an emerging opportunistic pathogen of clinical relevance. One of its most worrying characteristics is its low antibiotic susceptibility. [24] This low susceptibility is attributable to a concerted action of multidrug efflux pumps with chromosomally encoded antibiotic resistance genes (e.g., mexAB-oprM, mexXY, etc., [25] ) and the low permeability of the bacterial cellular envelopes. Besides intrinsic resistance, 녹농균 easily develops acquired resistance either by mutation in chromosomally encoded genes or by the horizontal gene transfer of antibiotic resistance determinants. Development of multidrug resistance by 녹농균 isolates requires several different genetic events that include acquisition of different mutations and/or horizontal transfer of antibiotic resistance genes. Hypermutation favours the selection of mutation-driven antibiotic resistance in 녹농균 strains producing chronic infections, whereas the clustering of several different antibiotic resistance genes in integrons favours the concerted acquisition of antibiotic resistance determinants. Some recent studies have shown phenotypic resistance associated to biofilm formation or to the emergence of small-colony-variants, which may be important in the response of 녹농균 populations to antibiotic treatment. [8]

Sensitivity to gallium Edit

Although gallium has no natural function in biology, gallium ions interact with cellular processes in a manner similar to iron(III). When gallium ions are mistakenly taken up in place of iron(III) by bacteria such as 슈도모나스, the ions interfere with respiration, and the bacteria die. This happens because iron is redox-active, allowing the transfer of electrons during respiration, while gallium is redox-inactive. [26] [27]

Animal pathogens Edit

Infectious species include 녹농균, P. oryzihabitans, 그리고 P. plecoglossicida. 녹농균 flourishes in hospital environments, and is a particular problem in this environment, since it is the second-most common infection in hospitalized patients (nosocomial infections) [ 인용 필요 ] . This pathogenesis may in part be due to the proteins secreted by 녹농균. The bacterium possesses a wide range of secretion systems, which export numerous proteins relevant to the pathogenesis of clinical strains. [28] Intriguingly, several genes involved in the pathogenesis of P.aeruginosa, ~와 같은 CntL, CntM, PlcB, Acp1, MucE, SrfA, Tse1, Tsi2, Tse3, 그리고 EsrC are core group-specific, [13] meaning that they are shared by the vast majority of 녹농균 strains, but they are not present in other 슈도모나드.

Plant pathogens Edit

P. 주사기 is a prolific plant pathogen. It exists as over 50 different pathovars, many of which demonstrate a high degree of host-plant specificity. Numerous other 슈도모나스 species can act as plant pathogens, notably all of the other members of the P. 주사기 subgroup, but P. 주사기 is the most widespread and best-studied.

Although not strictly a plant pathogen, P. tolaasii can be a major agricultural problem, as it can cause bacterial blotch of cultivated mushrooms. [29] Similarly, P. agarici can cause drippy gill in cultivated mushrooms. [30]

Since the mid-1980s, certain members of the genus 슈도모나스 have been applied to cereal seeds or applied directly to soils as a way of preventing the growth or establishment of crop pathogens. This practice is generically referred to as biocontrol. The biocontrol properties of P. 형광 그리고 P. protegens strains (CHA0 or Pf-5 for example) are currently best-understood, although it is not clear exactly how the plant growth-promoting properties of P. 형광 are achieved. Theories include: the bacteria might induce systemic resistance in the host plant, so it can better resist attack by a true pathogen the bacteria might outcompete other (pathogenic) soil microbes, e.g. by siderophores giving a competitive advantage at scavenging for iron the bacteria might produce compounds antagonistic to other soil microbes, such as phenazine-type antibiotics or hydrogen cyanide. Experimental evidence supports all of these theories. [31]

Other notable 슈도모나스 species with biocontrol properties include P. 클로로라피스, which produces a phenazine-type antibiotic active agent against certain fungal plant pathogens, [32] and the closely related species P. aurantiaca, which produces di-2,4-diacetylfluoroglucylmethane, a compound antibiotically active against Gram-positive organisms. [33]

Some members of the genus are able to metabolise chemical pollutants in the environment, and as a result, can be used for bioremediation. Notable species demonstrated as suitable for use as bioremediation agents include:

  • P. alcaligenes, which can degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. [34]
  • P. mendocina, which is able to degrade toluene. [35]
  • P. pseudoalcaligenes, which is able to use cyanide as a nitrogen source. [36]
  • P. resinovorans, which can degrade carbazole. [37]
  • P. veronii, which has been shown to degrade a variety of simple aromaticorganic compounds. [38][39]
  • P. 푸티다, which has the ability to degrade organic solvents such as toluene. [40] At least one strain of this bacterium is able to convert morphine in aqueous solution into the stronger and somewhat expensive to manufacture drug hydromorphone (Dilaudid).
  • Strain KC of P. stutzeri, which is able to degrade carbon tetrachloride. [41]

One way of identifying and categorizing multiple bacterial organisms in a sample is to use ribotyping. [42] In ribotyping, differing lengths of chromosomal DNA are isolated from samples containing bacterial species, and digested into fragments. [42] Similar types of fragments from differing organisms are visualized and their lengths compared to each other by Southern blotting or by the much faster method of polymerase chain reaction (PCR). [42] Fragments can then be matched with sequences found on bacterial species. [42] Ribotyping is shown to be a method to isolate bacteria capable of spoilage. [43] Around 51% of 슈도모나스 bacteria found in dairy processing plants are P. 형광, with 69% of these isolates possessing proteases, lipases, and lecithinases which contribute to degradation of milk components and subsequent spoilage. [43] Other 슈도모나스 species can possess any one of the proteases, lipases, or lecithinases, or none at all. [43] Similar enzymatic activity is performed by 슈도모나스 of the same ribotype, with each ribotype showing various degrees of milk spoilage and effects on flavour. [43] The number of bacteria affects the intensity of spoilage, with non-enzymatic 슈도모나스 species contributing to spoilage in high number. [43]

Food spoilage is detrimental to the food industry due to production of volatile compounds from organisms metabolizing the various nutrients found in the food product. [44] Contamination results in health hazards from toxic compound production as well as unpleasant odours and flavours. [44] Electronic nose technology allows fast and continuous measurement of microbial food spoilage by sensing odours produced by these volatile compounds. [44] Electronic nose technology can thus be applied to detect traces of 슈도모나스 milk spoilage and isolate the responsible 슈도모나스 종. [45] The gas sensor consists of a nose portion made of 14 modifiable polymer sensors that can detect specific milk degradation products produced by microorganisms. [45] Sensor data is produced by changes in electric resistance of the 14 polymers when in contact with its target compound, while four sensor parameters can be adjusted to further specify the response. [45] The responses can then be pre-processed by a neural network which can then differentiate between milk spoilage microorganisms such as P. 형광 그리고 P. 아우레오파시엔스. [45]

Recently, 16S rRNA sequence analysis redefined the taxonomy of many bacterial species previously classified as being in the genus 슈도모나스. [9] Species removed from 슈도모나스 are listed below clicking on a species will show its new classification. The term 'pseudomonad' does not apply strictly to just the genus 슈도모나스, and can be used to also include previous members such as the genera 부르크홀데리아 그리고 Ralstonia.


행동 양식

Mathematical modeling with piecewise-linear differential equations

Formalization of each of the regulatory components of the TOL system (Figure 1) as binary logic gates and the assembly of the complete network as a digital circuit has been described before [17]. The streamlined scheme of Figure 2c was used as a guide to the formulation of equations for each of the regulatory and metabolic steps of the network. To this end, we adopted piecewise-linear (PL) differential equations [45] for describing the circuit dynamics as described [21, 46]. The rationale of this approach is that production of metabolites in the model is determined by state equations, which define the metabolic reactions as the result of [i] the presence of substrates and [ii] the activation of a regulation function that encodes transcriptional and metabolic interactions. Under this scheme, a regulatory function accounts for the expression of a given gene and the production of the corresponding protein owing to the presence of an effector. Specific regulatory functions can thus be expressed as:

This equation indicates that the synthesis of product NS is a function of the presence of the effector j. 이 방정식에서, NS+ is a step function, a Boolean operator that is set to a value 1 if the concentration of j (NS j ) is above a particular threshold (θ j ), and to a value 0 if the concentration is below θ j . 합성 NS occurs at a rate determined by 케이 NS only when NS j >θ j , and does not take place if NS j <θ j . 이 경우, j is an activator of the synthesis of NS. By the same token, the effect of a repressor can be represented using a negative step function:

which is set to a value 1 when NS j <θ j , and to a value 0 when NS j >θ j . On this basis, the production of a given component of the network as a result of the combined influence of different effectors can be written as, e.g.:

where the appearance of product NS is regulated by the activator j and the repressor 케이. Such a component NS is synthesized only if j is present and 케이 is absent. This is equivalent to a logic device (a logic gate) involving an AND/NOT operator (ANDN), taking j 그리고 케이 as inputs and producing NS as output. In this way, it is possible to model all possible transcriptional and metabolic interactions in the system as logic constructs, determining the production of particular compounds as a function of the presence or absence of some of the others [47]. Furthermore, it is possible to set different thresholds for the concentration of a particular compound when it controls different synthesis rates at different concentrations. For instance, if effector j regulates the synthesis of A and B, we can set the constraint θ j 1 <θ j 2 , to indicate that synthesis of A is regulated by a lower concentration of j than the synthesis of B. These constraints are known as threshold inequalities [21] and are described below for the TOL system. 그런 threshold inequalities are related to the effective concentration of a given molecular species (e.g., a TF) above which it is able to have a regulatory effect on a target (e.g. promoter). In the case of TF-promoter pairs, inequalities are entered in the corresponding equations by means of a threshold value (θ j ) which represents the relative affinity of the TF under consideration for one or more target promoters. The active concentration of each of the components is then determined by its production rate (expressed by 케이 NS ), and its degradation rate (NS NS * x NS ), which is a strictly positive function, proportional to the concentration of the compound. These simple expressions of positive and negative step functions were adopted for representing all possible regulatory interactions in the system. The resulting set of equations was then implemented with the GNA (Genetic Network Analyzer) software [21]. GNA models describe the evolution of the regulatory circuit by specifying qualitative constraints on the parameters of the system. This allows the model to be reliably run even if the actual threshold concentrations and the reaction rates at stake are not known. One set of constraints thus includes such threshold inequalities. A second type of constraints consists of the so-called focal inequalities that set the possible steady-state concentrations of the components in the system with respect to their threshold values, for instance:

This inequality indicates that when component NS is produced at rate 케이 NS and degraded with a rate constant NS NS , so that its concentration converges towards the level 케이 NS/g NS [45], it exceeds the threshold θ NS 1 , but not θ NS 2 . This allows an estimate of the concentration of the components in reference to their threshold values, even in absence of quantitative information on the parameters of the system. The inequalities for the TOL model were set as shown in Table 1.

It is possible to follow the dynamics of the regulatory network by computing a temporal progression of so-called qualitative states, each consisting of the levels of the concentration variables with respect to their thresholds. In each qualitative state the trend of the concentration variables (increasing/decreasing/steady) determines the possible transitions to successor states. The resulting directed graph of qualitative states and transitions between qualitative states is called a state transition graph (for a more detailed description, see [21, 46]. Note that the PL equations above and the associated transition graph describe the temporal order of signal propagation in the network when the first input signal is present and the system moves toward a steady state (where the concentrations of the components stop to change). The actual time interval during which the system remains in a state before reaching the next is not contained in these qualitative models. However, the representation reliably predicts the temporal ordering of states, and thus the consecutive changes in the levels of each of the components of the network.

Using the biological assumptions for known regulatory interactions (Figure 1) and the resulting logic operations (Figure 2c), we defined four PL equations describing XylR, XylS, 높은 그리고 메타 production (Table 1). The sole input for the system was 미디엄-xylene, which was defined as an input variable i.e. one having a constant concentration along the simulations, [21]. For implementation of 인 실리코 mutations, we changed threshold inequalities as follows. In one case 오후 activation was simulated in the absence of the XylSh loop by setting the parameter θ 2 XylSh to be higher than the maximal concentration reachable upon 추신 activation (No XylS hyper-expression condition, Table 1). Similarly, simulation of the 오후 activation event in a scenario lacking XylSa, we set the 높은 pathway not to produce enough concentrations of 3 MBz for creating XylSa (No XylSa condition, Table 1). Consideration of different threshold inequalities in the TOL model allowed us to simulate the specific conditions as discussed in the Results section.

Strains, chemicals and growth conditions

대장균 CC118 strain [48] was used as the host for plasmid constructions and maintenance, while P. 푸티다 mt-2 [41] was employed for the analysis of promoter activity with reporter constructs (see below). 대장균 was grown in Luria-Bertani (LB) medium at 37°C. Unless indicated otherwise, P. 푸티다 was cultured in a minimal medium M9 supplemented with MgSO4 (2.0 mM), citrate or succinate (0.2%) as the only carbon source and grown at 30°C. Plasmids were conjugally transferred from 대장균 에게 P. 푸티다 with a tripartite mating procedure [48] using 대장균 HB101 (RK600) as the helper strain. When required, growth media was supplemented with kanamycin (Km, 50 μg/ml) or chloramphenicol (Cm, 30 m/ml). All chemicals and substrates, including aromatic effectors (미디엄-xylene, 영형-xylene, 3-methylbenzyl alcohol and 3-methyl benzoate) were purchased from Sigma-Aldrich.

Construction of reporter gene fusions

The TOL promoters , 추신 그리고 오후 were separately cloned in pSEVA226, a Km R broad host range vector (RK2 origin of replication) bearing a promoterless luxCDABE [49] operon downstream of the multiple cloning site of pUC (Silva-Rocha ., in preparation). To this end, each of the promoters of interest was amplified from P. 푸티다 mt-2 DNA through PCR reactions with Pfu DNA polymerase (Promega) using primer pairs PUF (5'-GCG GAA TTC TTG ATC AAA TC GA CA GG TG GT TAT G-3') and PUR (5'-GCG CGG ATC CGT CTC GTA TAG CTA GCA ACC GCC-3') for , PSF (5'-GGC CGA ATT CAT TCC ATC TGC CAC TTT AG-3') and PSR (5'-CGG CCG GAT CCC GGT TCT CTT ATT TTA ATG TGG-3') for 추신, and PMF (5'-CGG CCG AAT TCG GTT TGA TAG GGA TAA GTC C-3') and PMR (5'-CGG CCG GAT CCT CTG TTG CAT AAA GCC TAA-3') for 오후. These primers introduced in each case 에코RI와 HI sequences in equivalent sites of the 5' and 3' regions of each promoter (underlined in the primer sequence). PCR products were purified, digested with 에코RI와 HI (NewEngland BIolabs), ligated to pSEVA226 cleaved with the same enzymes and transformed in chemically competent 대장균 CC118 cells. The resulting clones were named pSEVA226-, pSEVA226-추신 and pSEVA226-오후. Sequence fidelity of the cloned promoters was verified in all cases by DNA sequencing.

Promoter activity quantification and data processing

The activity of the TOL promoters in response to inducers was examined with different procedures depending on the nature of the specific chemical tested. In case of soluble inducers (3MBA and 3 MBz), overnight grown P. 푸티다 cells harboring the reporter plasmid under examination were diluted 1:20 in fresh minimal media with the inducer of interest at a final concentration of 1 mM. 200 μl aliquots (with four replicates) of the thereby diluted cells were placed in 96-well Microplates (Optilux™, BD Falcon) and incubated in a Wallac Víctor II 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) at 30°C, the optical density at 600 nm (OD600) and the bioluminescence being recorded every 30 min. Promoter activity was quantified by normalizing bioluminescence in respect to cell density (i.e. bioluminescence/OD600). For testing volatile inducers (미디엄-xylene and 영형-xylene), single colonies of P. 푸티다 clones bearing the reporter plasmids indicated were patched on M9/citrate agar plates, grown overnight an exposed to saturating vapors of a 1 M inducer solution in DMSO. Non-disruptive monitoring of promoter output was carried out with a VersaDoc™ Imaging System (BioRad) and the results processed with the ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). In either case, graphic representations of promoter activities were generated with MATLAB software (MathWorks).


논의

SQ is one of the most abundant organosulfur compounds in the biosphere, following glutathione, Cys, and Met, and the global production of SQ is estimated at 10 gigatons per year (2, 22). Although the biosynthesis of SQ and SQDG in plants, algae, cyanobacteria, and archaea has been studied in considerable detail (e.g., 23, 24), much less is known about the degradation reactions and the recycling of the carbon and sulfur bound in SQ and SQDG. The lipid can easily be hydrolyzed by plant acyl-hydrolases, which liberate SQ-glycerol (1), and glucosidases can liberate SQ in the next step (25) however, it is still unclear whether higher plants are capable of splitting the carbon/sulfur bond in SQ at significant rates. Indeed, inorganic sulfate is the predominant source of sulfur for growth of plants and algae, for example, and plant growth can become sulfur/sulfate-limited, for example, in soils that are sulfur-deficient due to intensive agriculture and to the effective measures to reduce sulfur emissions to the atmosphere in recent years (26, 27) phytoplankton growth in freshwater environments can also become sulfate/sulfur-limited (28). The recycling of the sulfur bound in SQ is catalyzed by heterotrophic bacteria, which can easily be enriched from soil (5, 7 ⇓ –9), and involves the degradation intermediates DHPS and SL, but no release of sulfate, if SQ-utilizing bacteria are grown in pure culture (10 ⇓ –12). Later work demonstrated that SQ can be degraded completely by two-member bacterial communities, that is, by a primary degrader with transient release of SL or DHPS and a secondary degrader with release of sulfate (11, 12). Pathways for the degradation of DHPS and SL, including desulfonation, have been described (13, 15, 29) where, briefly, DHPS is oxidized to SL and the SL is mineralized via one of three known pathways and desulfonative enzymes [i.e., SL sulfolyase (SuyAB EC 4.4.1.24), sulfoacetaldehyde acetyltransferase (Xsc EC 2.3.3.15), cysteate sulfolyase (CuyA EC 4.4.1.25)]. However, details on the pathways, enzymes, and genes for the conversion of SQ to DHPS and SL were missing. A first pathway, sulfoglycolysis leading to DHPS, was found in 대장균 K-12, and this pathway seems to be widespread in Enterobacteria (12). A second pathway, leading to SL, in a typical soil and freshwater bacterium, an isolate of P. 푸티다, has been revealed in this study.

Strain SQ1 is able to access half of the carbon atoms of SQ for its heterotrophic aerobic growth through abstraction of a nonsulfonated C3-unit in the form of pyruvate, whereas the C3-organosulfonate half of the substrate is not dissimilated but excreted in the form of SL (Fig. 1 NS 그리고 NS). Four organosulfonate intermediates were detected (SGL, SG, KDSG, and SLA), and five corresponding enzymes were identified [NAD + -dependent SQ dehydrogenase, SGL lactonase, SG dehydratase, KDSG aldolase, and NAD(P) + -dependent SLA dehydrogenase]. Hence, this primary degradation pathway for SQ in P. 푸티다 SQ1 follows a catabolic route that resembles an Entner–Doudoroff pathway for SQ (Fig. 1 NS 그리고 NS), as was obviously suspected previously (10).

It is striking that the enzymes that catalyze the analogous reactions in either the SQ or GP Entner–Doudoroff pathway in P. 푸티다 SQ1 are encoded and regulated in different gene clusters (operons), as is the case with sulfoglycolysis and classical glycolysis in 대장균 K-12 (12). It is even more surprising that most of these enzymes belong to different enzyme families. Only SG dehydratase and PG dehydratase belong to the same protein family [dihydroxy-acid/6-phosphogluconate dehydratases Cluster of Orthologous Groups (COG) 0129]. SQ dehydrogenase (0090) belongs to the NAD(P) + -dependent short-chain alcohol dehydrogenase family (COG1028), and thus to a different family than typical GP 1-dehydrogenases (COG0364). Further, the SGL lactonase (0091) is a sugar lactone hydrolase family protein (COG3386), whereas PGL lactonase is an archetypal glucosamine-6-phosphate isomerase/6-phosphogluconolactonase family protein (COG0363). The KDSG aldolase (0100) is a 2-keto-3-deoxyrhamnonate aldolase family protein (COG3836), and is most similar to 2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acid/4-hydroxy-2-oxovalerate aldolases of aromatic-ring cleavage pathways, whereas the KDPG aldolase is an archetypal KDPG/4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase family protein (COG0800). These phylogenetic differences are reflected in the observed substrate specificities of the enzymes of the SQ pathway, as far as tested in this study. It remains unclear which factors are responsible for the enzymes’ specificity for 6-deoxy-6-sulfo- (monoanionic) over 6-phospho-substituted (dianionic) substrate analogs, and thus for their recruitment into the pathway, but these questions can now be addressed.

The newly identified SQ degradation gene cluster of P. 푸티다 SQ1 also contains other genes that are likely to be involved in SQ utilization. Gene 0097 is predicted to encode a sulfite/small organosulfonate exporter (TauE PF01925) (30, 31), and this gene was cotranscribed during growth with SQ (Fig. 3). Hence, gene 0097 most likely encodes for an inducible SL exporter. Gene 0094 is predicted to encode an alpha-glucosidase (COG1501 family 31 glycosyl hydrolase), and this gene was also cotranscribed (Fig. 3) and highly coexpressed (Fig. 3 NS 그리고 NS), specifically during growth with SQ. Hence, we predict that gene 0094 encodes for hydrolysis of SQ-glyceride (e.g., for utilization of the whole sulfolipid SQDG as a growth substrate). Further, gene 0092 was cotranscribed (Fig. 3) and is predicted to encode an aldose epimerase (COG2017), most likely for catalysis of the equilibrium of alpha- and beta-anomers of SQ such function would imply that the SQ Entner–Doudoroff pathway is anomer-specific. Finally, SQ transport might be encoded by the cotranscribed (Fig. 3) predicted sodium/solute symporter (SSS) family transporter gene (0094) or by the predicted galactonate major facilitator superfamily (MFS) transporter gene (0098) the outer membrane porin (OMP) gene (0093) may be involved in degradation of SQDG.

Thirty genome sequences of P. 푸티다 strains are available for genome-wide comparisons within the IMG search platform (as of April 2015), and in three of these genomes, syntenic SQ gene clusters were found, as illustrated in Fig. 5 (in P. 푸티다 strains H8234, OUS82, and SJ3). Putative SQ-degradation gene clusters with homologs for the core genes identified in P. 푸티다 SQ1 were found in other gamma-Proteobacteria, and in beta- and alpha-Proteobacteria, but as differently assembled (nonsyntenic) gene clusters, as illustrated in Fig. 5. For some of these clusters, a corresponding SLA dehydrogenase candidate gene (indicated in red in Fig. 5) was not found however, the predicted SL exporter (TauE gene 0097 in strain SQ1) and alpha-glucosidase gene (0094) appeared to be conserved in most of these candidate SQ-gene clusters (indicated in gray in Fig. 5). Such gene clusters were found in genomes of species of (gamma-Proteobacteria) 비브리오, 아에로모나스, and Enterobacteria (세라티아, Plesiomonas, Hafnia, Leminorella, 그리고 Edwardsiella) of (beta-Proteobacteria) 부르크홀데리아, Janthinobacterium, 그리고 Herbaspirillum and of (alpha-Proteobacteria) 근경, Ensifer, Microvirga, Salinarimonas, 그리고 Acidocella (Fig. 5). Interestingly, some of these strains are isolated gut symbionts (e.g., the Enterobacteria strains Hafnia alvei ATCC51873, Leminorella grimontii DSM5078, 세라티아 특. Ag2) and/or potential pathogens (e.g., 비브리오, Plesiomonas, Halomonas), whereas other strains represent typical marine- or saline-associated bacteria (e.g., Halomonas, Salinarimonas) and typical freshwater-, soil-, and plant rhizosphere-associated bacteria (e.g., 근경, Ensifer, Herbaspirillum, Microvirga). Whether these isolated strains are indeed able to use SQ for growth, and whether utilization of SQ is indeed a relevant trait in the habitats from which these strains originated, needs to be addressed.

Illustration of the SQ-degradation gene cluster in P. 푸티다 SQ1 with its five identified core genes (NS) and of homologous, predicted SQ-degradation gene clusters found in genomes of other P. 푸티다, other gamma-Proteobacteria (NS), and in beta- and alpha-Proteobacteria ( 그리고 NS, respectively). Homologous gene clusters in bacterial genomes were retrieved from the Joint Genome Institute’s IMG database by the Gene Cassette Search tool and the Gene Neighborhood viewer. Shown are gene clusters that contain gene homologs for at least four of the five core enzymes of the SQ Entner–Doudoroff pathway (genes are indicated by color coding). Also, candidate genes for SL export and for a predicted SQ-glyceride (SQG) alpha-glucosidase (main text) were frequently found to be conserved within these homolog clusters (gene symbols in gray). Note that other candidate genes in the clusters are not specified in this figure (gene symbols in white) for example, more variable genes were predicted for outer membrane porins, other transporters, or regulation (Fig. 1).


비디오 보기: 익성펀드를 조국펀드로 둔갑시킨 검사와 기자들 동향. 윤석열 장모 혐의 몰아주기 빨간아재 (팔월 2022).