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아가로스 겔 전기영동 중 단백질과 DNA 거동의 차이점은 무엇입니까?

아가로스 겔 전기영동 중 단백질과 DNA 거동의 차이점은 무엇입니까?


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저는 겔 전기영동에 관한 과학 프로젝트를 계획하고 있는데 어떤 것이 있는지 알고 싶습니다. 측정 가능한, 정량화 가능한 (예를 들어, 그래프나 차트로 나타낼 수 있는 것들) 아가로스 겔 전기영동 동안 단백질과 DNA의 거동 간의 차이. 자세한 입력과 유용한 링크는 대단히 감사합니다.


겔 전기영동 동안 분자가 어떻게 움직일지를 결정하는 두 가지 중요한 특성이 있습니다.

  • 분자의 크기와 모양
  • 분자의 전하

전기장을 가하면 모든 분자는 전하에 따라 움직입니다. 젤 자체는 더 큰 분자의 움직임을 방해합니다. 이것은 작은 분자가 큰 분자보다 더 멀리 이동할 것임을 의미합니다.

RNA 및 DNA와 같은 핵산은 인산 골격에서 균일한 음전하를 띠고 있습니다. 이는 일반적으로 크기와 모양에 따라 분리된다는 것을 의미합니다(플라스미드는 초나선형, 원형 ​​또는 선형과 같은 다양한 형태로 존재할 수 있음).

단백질은 전하가 다르며, 일부는 일반적으로 겔 전기영동에 사용되는 pH에서 양전하를 띠고, 일부는 음전하를 띠고, 일부는 해당 pH에서 전하를 띠지 않습니다. 따라서 단백질을 젤 위에서 단순히 실행하면 일부는 뒤로 이동하고 일부는 앞으로 이동하고 일부는 전혀 이동하지 않습니다.

단백질을 크기에 따라 분리하기 위해 세제 SDS를 사용하여 단백질을 변성시키고 균일한 전하를 제공합니다(SDS는 음전하를 띱니다). 단백질은 또한 아가로오스가 아닌 폴리아크릴아미드 겔에서 실행됩니다. 아가로오스의 기공 크기가 일반적인 크기의 단백질에 적합하지 않기 때문입니다.

나는 단백질에 아가로스를 사용하는 사람을 본 적이 없지만 더 큰 단백질에 가능하고 때때로 사용되는 것 같습니다. 프로토콜을 설명하는 한 논문을 찾았습니다. 그들은 4-5% 범위의 매우 높은 농도의 아가로스를 사용했습니다. 나는 그들이 잘 처리하지 않을 것이라고 생각하지만 직접 시도해야합니다. 검사하는 단백질이 조금 더 크면 아가로스를 사용할 수 있습니다.


SDS PAGE와 겔 전기영동의 차이점

일반적으로 단백질 및 디옥시리보핵산(DNA)에 대해 물체의 질량을 확인하기 위해 전기영동을 사용할 수 있습니다. DNA 가닥이 화학 물질에 도입되면 정보 처리 속도가 빨라지거나 느려질 수 있습니다. 알려진 질량의 DNA 마커는 전기영동이 종료되면 이동하는 물체의 크기를 대략적으로 측정하는 데 사용됩니다. 전기영동은 분자생물학자와 생화학자에게 가장 많이 사용되는 도구일 것입니다.

이 과정에서 일반적으로 사용되는 두 가지 유형의 전기영동이 있습니다. 이들은 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 천연 겔 전기영동입니다.

SDS-PAGE는 전기영동 이동성에서 단백질을 분리하기 위해 생화학, 법의학, 생물학 및 유전학과 같은 분야에서 사용되는 겔 전기영동의 비선택적 방법입니다. SDS는 DNA 추출 중 세포 용해를 돕고 SDS-PAGE에서 단백질을 분리하는 데 사용할 수 있는 음이온성 계면활성제입니다. 전기 영동 동안 단백질 혼합물은 먼저 SDS 용액에서 액화됩니다. 그런 다음 Mercaptoeethanol이라는 물질을 적용하여 이황화 결합을 제거하여 단백질을 선형으로 만듭니다. 그런 다음 전기 영동이 시작됩니다. 결과는 분자의 두 잔기를 생성할 것이며, 그 중 하나는 SDS-PAGE입니다.

SDS-PAGE의 부재는 단백질이 2차 및 3차 구조를 모두 잃지 않고 일반적으로 직선 막대로 열리지 않는다는 점에서만 겔 전기영동을 수행할 수 있기 때문에 문제가 되지 않습니다.

한편, 천연 겔 전기영동은 겔을 항대류 매질로 사용한다. 일반적으로 DNA, 리보핵산(RNA) 및 단백질과 같은 생물학적 거대분자의 분리에 사용됩니다. 나노 입자의 분리에도 사용할 수 있습니다.

기본 겔 전기영동에 사용되는 두 가지 주요 겔, 즉:

더 큰 분자에 사용되는 아가로스 겔. 이 젤은 두 분자 밴드 사이의 작은 차이를 식별하지 못합니다. 또한 DNA 분리에만 사용됩니다. 아가로스 겔의 시각화는 ethidium bromide의 혼합물로 수행됩니다.

더 작은 분자에 사용되는 폴리아크릴아미드 겔. 이 젤은 분자 밴드 간의 차이를 식별합니다. DNA 외에도 단백질을 분리할 수도 있습니다.

1.SDS-PAGE는 생화학, 법의학, 생물학 및 유전학과 같은 분야에서 사용되는 비선택적 젤 전기 영동 방법으로 전기 영동 이동성에서 단백질을 분리하는 반면 젤 전기 영동은 일반적으로 DNA와 같은 생물학적 거대 분자의 분리에 사용됩니다. 리보핵산(RNA) 및 단백질. 나노 입자의 분리에도 사용할 수 있습니다.

2. 기본 겔 전기 영동에는 아가로스 겔과 폴리 아크릴 아미드 겔의 두 가지 유형이 있습니다.


DNA 단편 분리를 위한 아가로스 겔 전기영동

아가로스 겔 전기영동은 100bp에서 25kb(1)에 이르는 다양한 크기의 DNA 단편을 분리하는 가장 효과적인 방법입니다. Agarose는 해조류 속 Gelidium과 Gracilaria에서 분리되며 반복되는 agarobiose(L- 및 D-galactose) 소단위로 구성됩니다(2). 겔화 동안 아가로스 폴리머는 비공유적으로 결합하고 기공 크기가 겔의 분자 체질 특성을 결정하는 번들 네트워크를 형성합니다. 아가로스 겔 전기영동의 사용은 DNA 분리에 혁명을 일으켰습니다. 아가로스 겔을 채택하기 전에 DNA는 주로 크기의 근사만을 제공하는 자당 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분리되었습니다. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 DNA를 분리하기 위해 DNA를 겔의 미리 주조된 웰에 로딩하고 전류를 인가합니다. DNA(및 RNA) 분자의 인산염 백본은 음전하를 띠므로 전기장에 놓으면 DNA 조각이 양전하를 띤 양극으로 이동합니다. DNA는 질량/전하 비율이 균일하기 때문에 이동 거리는 분자량의 로그에 반비례하는 패턴으로 아가로스 겔 내에서 DNA 분자가 크기별로 분리됩니다(3). 아가로스 겔을 통한 DNA 이동의 주요 모델은 "편향된 반복"이며, 이에 따라 앞전이 앞으로 이동하고 나머지 분자를 따라 당깁니다(4). 겔을 통한 DNA 분자의 이동 속도는 1) DNA 분자의 크기 2) 아가로스 농도 3) DNA 형태(5) 4) 인가 전압 5) 에티듐 브로마이드의 존재 6) 유형에 따라 결정됩니다. 아가로스 및 7) 전기영동 완충액. 분리 후 DNA 분자는 적절한 염료로 염색한 후 자외선 아래에서 시각화할 수 있습니다. 이 프로토콜을 따르면 학생들은 다음을 수행할 수 있어야 합니다. 겔 매트릭스 내에서 DNA 단편이 분리되는 메커니즘 이해 DNA 분자의 형태가 겔 매트릭스를 통한 이동성을 결정하는 방법 이해 필요에 따라 적절한 농도의 아가로스 용액 식별 준비 DNA 시료의 전기영동을 위한 아가로스 겔 겔 전기영동 장치 및 전원 공급 장치 설정 DNA 조각 분리를 위한 적절한 전압 선택 ethidium bromide가 DNA 밴드의 가시화를 허용하는 메커니즘 이해 분리된 DNA 조각의 크기 결정.


겔 전기영동 동안 원형 플라스미드 DNA는 어떻게 작동합니까?

겔 전기영동 조건(에티듐 브로마이드의 존재, 겔 농도, 전기장 강도, 온도 및 전기영동 완충액의 이온 강도 포함)은 플라스미드 DNA의 이동성에 영향을 미칠 수 있습니다. 아가로스 겔의 그물과 같은 특성으로 인해 원형 플라스미드 DNA가 아가로스 메쉬에 더 쉽게 잡히게 됩니다.

전기영동 트래핑은 전기영동력(트랩에 대해 원형 플라스미드 DNA를 당기는 힘)과 확산(원형 플라스미드 DNA가 트랩을 탈출하도록 허용) 사이의 균형입니다. 따라서 큰 원형 분자는 작은 DNA보다 갇힐 가능성이 더 큽니다. Supercoiled DNA는 꼬인 DNA의 크기가 작기 때문에 트랩하기가 더 어렵습니다.


결과 및 논의

적합한 염료의 식별 및 특성화

도 1에서, 레인 N1–N7 전기 영동 동안 양극(양극)으로 이동하는 음으로 하전된(음이온) 염료를 나타냅니다. 레인 P1–P7 전기 영동 동안 음극(음극)으로 이동하는 양전하(양이온) 염료를 나타냅니다. 양전하를 띤 염료가 표준 DNA 겔 전기영동과 반대 방향으로 이동함에 따라 이러한 염료를 포함하는 겔은 웰이 음극 대신 양극에 더 가깝도록 탱크에 배치되어 염료가 겔을 통해 음극으로 이동할 수 있습니다.

겔 전기영동에서 염료의 이동 아가로스 겔(1%), 1X TBE 완충액, 100V에서 45분 동안 전기영동. 염료의 정체는 표 I을 참조하십시오. N1-N7 레인 양극으로 이동하고 레인 P1–P7 음극으로 이동했습니다. 젤은 염료가 적절한 방향으로 이동하도록 배향되었습니다. 막대는 염기쌍(bp)으로 표시된 크기의 DNA 단편에 의해 이동된 거리를 나타냅니다.

각 염료 밴드에 의해 이동된 평균 거리는 표 I에 정리되어 있습니다. 막대는 동일한 조건에서 1kb DNA 사다리(Promega)의 250개 염기쌍(bp)에서 10,000bp까지의 DNA 단편의 이동된 거리를 나타냅니다.

로그에 대한 마이그레이션 거리의 표준 곡선10 DNA 단편의 bp 크기를 구성하고 염료가 이동한 거리를 기반으로 각 염료의 등가 "크기"를 추정하는 데 사용했습니다. 이동 거리는 염료의 전면 가장자리에서 측정되며 염료 이동은 겔 농도, 겔 유형, 완충액의 유형 및 pH와 같은 여러 요인에 의해 영향을 받습니다[ 1, 4, 5](그림 5 참조). 2). 따라서 표 I에 나열된 선형 DNA 단편에 대한 각 염료의 동등한 "크기"는 명목이지만 나중에 논의되는 바와 같이 교육 실험에 사용할 수 있습니다.

한천-한천 겔 및 전해질 용액에서 염료에 의해 이동된 거리.

양전하를 띤 염료는 전기장에서 DNA와 반대 방향으로 이동합니다. 겔 전기영동에서 DNA 샘플을 시뮬레이션하기 위해 양전하를 띤 염료를 사용해야 하는 경우 학생의 혼동이나 오해를 해결하는 데 적절한 주의를 기울여야 합니다. 반면에 음전하를 띤 염료는 깨끗하고 재현 가능하게 이동하므로 DNA 샘플에 대한 이상적인 대체품입니다.

여러 다른 염료인 카민, 페놀 레드, 브로모크레졸 그린, 뉴트럴 레드를 테스트한 결과 pH 8.0에서 전기영동하는 동안 이동하지 않는 것으로 나타났습니다.

적합한 전해질의 식별 및 특성화

일반적인 실험실 염은 물에 최종 10mM까지 용해되었습니다(표 II 참조). pH 및 전도도를 측정했습니다. 전기 영동 동안 흐르는 전류는 Bio-Rad 전원 공급 장치의 전류 판독값에서 기록되었습니다. 모든 장치는 22°C의 초기(주변) 온도에 있었습니다. 실행 종료 시 탱크의 전해질 온도 상승을 기록했습니다.

전해질 공식 농도 pH 비 전도도(μs cm -1 ) 60V에서 60분 동안 전기영동
전류 범위(mA) 온도 증가(°C)
트리스-붕산염-EDTA 미정 8.0 620 17–19 2.0
아세트산나트륨 채널3쿠나 10m 남 7.5 702 19–22 2.4
탄산 수소 나트륨 나코3 10m 남 8.2 767 21–22 2.5
인산수소이나트륨 2HPO4 10m 남 8.7 1590 39–59 5.2
인산수소이칼륨 케이2HPO4 10m 남 8.8 2017 49–66 6.7
수산화 칼륨 10m 남 11.6 1860 24–30 3.7

중탄산나트륨(10mM)은 pH 및 전도도에 대해 1X TBE 완충액과 거의 일치하는 전해질을 쉽게 사용할 수 있고 쉽게 제조할 수 있어 염료의 겔 전기영동에 편리한 대안이 됩니다. 아세트산 나트륨(10mM)도 적절한 대체품입니다. 인산염 완충액은 더 높은 전도도를 가지고 있어 탱크를 통해 더 높은 전류가 흐르도록 했고, 이로 인해 때때로 한천 겔의 일부를 부드럽게 하는 국부적 가열이 발생했습니다. K 사용2HPO4 그리고 나2HPO4 1~5m M 농도에서 이 문제를 최소화했습니다.

1x TBE보다 낮은 전도도를 갖는 전해질을 사용한 전기영동은 전류 흐름을 감소시키고 염료의 이동을 늦췄다. 전기 영동 속도를 높이기 위해 고전압에서 전도도가 낮은 전해질을 사용할 수 있습니다[ 13, 14 ]. 이것은 교육 시간이 제한된 경우 유용할 수 있지만 더 높은 전압을 사용하면 특수 장비가 필요하고 전기적 위험이 증가하여 교실에 적합하지 않기 때문에 조사되지 않았습니다.

다른 전해질도 테스트했지만 부적합한 것으로 나타났습니다. 요오드화칼륨과 티오황산나트륨은 침전물을 생성하는 반면 염화나트륨은 일부 프로토콜 [6, 8]에서 제안된 높은 전도성을 가지며 전기영동 동안 염소의 불쾌한 냄새를 발생시킵니다.

적합한 염료-전해질 조합의 식별 및 특성화

일부 염료는 특정 전해질과 혼합될 때 색조 또는 강도가 변한다는 점에 주목했습니다. 이 상호작용은 염료 용액과 전해질 용액을 혼합하고 흡광도의 변화를 결정함으로써 체계적으로 측정되었습니다(표 III 참조). 약 50μl의 각 염료(0.0125%로 연속 희석)를 96웰 미세역가 플레이트에서 150μl의 전해질과 혼합했습니다. 150μl 물에서 50μl 염료의 대조군 샘플과 비교한 흡광도의 차이(광학 밀도의 차이, dOD1)가 기록되었습니다. 각 염료에 대한 흡광도 판독값은 대조 샘플의 흡수 스펙트럼으로부터 결정된 대조 샘플의 피크 흡광도 파장에서 이루어졌습니다. 모든 판독값은 Bio-Rad Benchmark Plus 마이크로플레이트 분광광도계에서 이루어졌습니다.

물든 색 피크 흡수 파장(nm) 염료와 전해질을 혼합했을 때의 흡광도 변화
채널3쿠나 나코3 2HPO4 케이2HPO4
크실렌 시아놀 FF 520 −0.084 −0.079 +0.009 −0.047 −0.583
메틸 레드 460 +0.199 +0.020 +0.036 +0.047 +0.047
메틸 오렌지 464 −0.128 −0.068 −0.167 −0.176 −0.016
크레졸 레드 435 −0.237 −0.692 −0.039 −0.603 −0.739
브로모페놀 블루 589 +0.224 +0.262 −0.005 −0.253 +0.151
오렌지 G 475 −0.128 −0.005 +0.026 −0.042 −0.075
폰소 S 615 −0.006 +0.004 −0.003 −0.013 −0.384
야누스 그린 600 −0.220 −0.151 −0.081 −0.222 −0.394
브릴리언트 그린 625 1.566 1.692 −0.019 1.687 DC
메틸 바이올렛 581 −0.021 +0.182 −0.052 −0.136 1.580
사프라닌 오 512 −0.072 −0.080 −0.080 −0.009 −0.171
크리스탈 바이올렛 589 −0.151 3.178 −0.051 1.585 DC
파이로닌 Y(G) 547 −0.177 1.769 −0.094 −0.266 2.193
메틸 그린 632 −0.022 −0.170 −0.071 −0.120 DC
  • “디씨.” 조합이 완전히 탈색되었음을 나타냅니다. 음의 dOD 값은 물에만 용해된 염료에 비해 전해질에 용해된 염료의 흡광도가 감소함을 의미하며, 이에 따라 색상 이동 또는 색상 강도의 감소를 나타낸다. 반대로, 양의 dOD 값은 색상 강도의 증가를 나타낼 수 있습니다. 이탤릭체로 표시된 수치는 1.0 OD 단위 이상의 감소를 나타냅니다.

일반적으로 음으로 하전된 염료는 대체 전해질에서 안정적으로 유지되지만 일부 양으로 하전된 염료는 색상 강도의 손실에 따라 흡광도가 크게 감소합니다. 7개의 양전하를 띤 염료의 전체 패널은 Na에서만 색상을 유지했습니다.2HPO4.

모든 염료는 1X TBE 완충액에서 사용할 때 안정적이었습니다(그림 1 참조).

적절한 전해질 조합의 식별 및 특성화

전기영동에 사용되는 겔 슬래브는 확립된 아가로스 겔 제형과 유사한 적절한 물리적 특성을 가져야 합니다. 겔은 최종 농도가 1%(w/v)가 되도록 10m M 전해질 용액에 한천 분말을 현탁시켜 만들고 전자레인지에서 끓였습니다. 짧은 냉각 기간 후, 용융된 겔을 빗이 삽입된 미니겔 주조 트레이에 부었다. 경화 후, 젤은 모양과 일관성의 유지를 확인하기 위해 각각의 전해질에서 60V에서 60분 동안 실행되었습니다.

염기성 pH의 전해질 용액만 적합합니다. 산성 pH의 전해질 용액을 사용하면 한천 젤의 설정을 방해하여 매우 부드럽고 끈적한 젤이 생성되기 때문입니다(데이터는 표시되지 않음). 표 IV는 테스트된 겔-전해질 조합의 특성을 보여줍니다. 일반적으로 수산화칼륨은 이 전해질로 만든 겔이 착색되고 웰의 형태를 유지하지 못하는 부드럽고 끈적한 질감을 갖는 경향이 있기 때문에 겔 전기영동에 사용하기에 부적합하다는 것이 발견되었습니다.

전해질 Agar-agar (Swallow Globe 브랜드) 한천(장미 브랜드) 곤약젤리(레드맨 브랜드) 곤약젤리(Jim Willie 브랜드) 세균성 한천(Oxoid)
채널3쿠나 NS NS
나코3 미디엄 미디엄
2HPO4 NS NS
케이2HPO4 미디엄 미디엄
씨, 에이 씨, 에이 씨, 에이
  • √ = 전기영동에 적합 A = 겔이 접착력 있음 C = 겔에 색이 있거나 탁하게 보임 M = 전기영동 중에 겔이 녹음 R = 겔이 너무 빨리 굳음.

Konnyaku 기반 젤은 Na로 만든 젤도 적합하지 않았습니다.2HPO4 및 CH3COONa는 슬래브 젤을 적절하게 주조하기에는 너무 빨리 굳어지는 반면, K로 만든 것은2HPO4 및 NaHCO3 전기 영동 중에 녹는 경향이 있습니다. 전기 영동 동안 곤약 기반 젤이 들어 있는 탱크를 통한 전류 흐름과 전도도가 한천 또는 아가로스로 만든 젤보다 더 높은 것으로 관찰되었습니다. 아마도 상업용 곤약 분말 혼합물에 탱크의 전해질로 침출된 화합물이 포함되어 있기 때문일 수 있습니다. 따라서 전도도를 증가시킵니다.

선택된 겔-전해질 조합에서 염료의 전기영동

전기 영동 탱크에 사용되는 전해질의 안정성을 기반으로 전기 영동에 사용하기 위해 염료 패널을 선택했습니다. 이들은 자일렌 시아놀 FF, 메틸 오렌지, 크레졸 레드, 브로모페놀 블루, 오렌지 G 및 폰소 S였습니다. 각 염료의 이동은 미니겔에서 60V에서 60분 동안 전기영동한 후 기록되었습니다. 염료는 개별적으로 그리고 표 IV에서 적합한 것으로 확인된 겔-전해질 조합에 대해 6가지 염료 모두의 혼합물로 실행되었습니다. 염료 혼합물은 아가로스-TBE 겔에서 전기영동 동안 깨끗하게 분리되며 전기영동 동안 서로 반응하거나 상호작용하지 않는 것으로 보입니다(데이터는 표시되지 않음).

그림 2는 선택된 전해질에서 1% 한천(Swallow Globe 브랜드)으로 만든 겔에서 6개의 음으로 하전된 염료 패널에 의해 이동된 거리를 보여줍니다. 염료에 의해 이동된 거리는 각 전해질에서 약간 다르며 pH에 따라 변하는 것으로 나타났습니다. Rose 브랜드 한천과 세균학적 한천으로 만든 젤은 유사한 결과를 나타냈습니다(데이터는 표시되지 않음). 일반적으로 전해질의 pH가 높을수록 염료가 더 많이 이동합니다. 사용된 4가지 전해질 모두에서 크레졸 레드는 브로모페놀 블루와 함께 이동하는 반면, TBE 완충액에서는 크레졸 레드가 브로모페놀 블루보다 적게 이동합니다(그림 1 및 표 I 참조). 이것은 TBE의 pH가 8.0, CH의 값 사이의 값이기 때문에 pH 의존적으로 보이지 않습니다.3COONa와 NaHCO3.

DNA 겔 전기영동 시뮬레이션

DNA 샘플의 겔 전기영동은 일반적으로 전도성 완충액에 담근 수평 "잠수함" 아가로스 겔에서 수행됩니다. 전기영동 탱크의 완충액에 전류가 흐르면 전기장이 생성됩니다. DNA의 인산염 그룹은 음전하를 띠고 있어 DNA 분자에 전체적으로 음전하를 띠게 됩니다. 전기장에서 DNA는 전기영동 챔버의 양으로 대전된 전극(양극)으로 이동합니다[ 1 ].

DNA 단편은 더 작은 단편이 큰 단편보다 겔 매트릭스의 기공을 통해 더 이동함에 따라 크기에 따라 분리됩니다. 마이그레이션된 거리는 로그에 반비례합니다.10 DNA 단편의 분자량. 이동 속도는 젤 전체에 적용된 전계 강도에 의해 결정됩니다. 전기장의 세기는 전위차(인가 전압)에 정비례하고 전기장의 길이에 반비례합니다[ 4 , 5 ]. 전압을 높이거나 전극 사이의 거리를 줄이면 전계 강도가 증가하여 DNA 단편 이동 속도가 증가할 수 있습니다. 그러나 인가 전압이 높을수록 전기 영동 탱크에 흐르는 전류가 많아져 열이 발생하여 젤이 녹을 수 있습니다[4,5].

전기영동 후 아가로스 겔을 에티듐 브로마이드로 염색합니다. Ethidium bromide는 DNA 분자에 결합하고 UV 광선 아래에서 형광을 발하여 DNA의 "밴드" 위치를 나타냅니다[ 1 , 2 ]. 알려진 크기의 DNA 단편으로 구성된 "DNA 사다리"(마커)는 겔의 DNA 샘플과 함께 실행할 수 있습니다. 미지의 샘플 단편의 크기는 사다리에 있는 DNA 단편의 이동 거리와 비교하여 결정할 수 있습니다[1,4,5].

여기에 제시된 대체 재료는 전체 또는 부분적으로 교육 응용 프로그램에 사용하기 위해 DNA 겔 전기영동을 시뮬레이션하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 관련된 프로세스에 대한 학생들의 개념적 이해를 관리하기 위해 특정 사항을 염두에 두어야 합니다. 염료 대체물의 다채로운 특성이 학생들을 혼란스럽게 하고 오해를 일으키지 않도록 주의해야 합니다. 예를 들어, 색상이 시뮬레이션된 DNA 단편의 "크기"를 결정하지 않는다는 것과 여기에서 염료를 사용하는 것은 시각화 목적으로 DNA를 염색하는 것과 다르다는 것을 강조하는 것이 중요합니다.

또 다른 요점은 염료의 분자량이 겔에서 이동하는 거리를 단독으로 결정하지 않는다는 것입니다. DNA와 달리 염료 화합물은 서로에 대해 다른 전하 밀도를 가질 수 있습니다. 따라서 염료의 분자량은 염료에 의해 형성된 모의 DNA 밴드의 겉보기 "크기"와 직접적인 관계가 없습니다.

염료 기반 겔 전기영동이 "알려진 DNA 단편"의 분자량에 대해 이동된 거리의 표준 곡선을 구성하여 "알려지지 않은 DNA 단편"의 분자 크기를 결정하기 위한 목적으로 DNA 겔 전기영동을 시뮬레이션하기 위한 용도의 경우, 각 밴드의 명목상 "크기"는 표 I에 나와 있습니다. 각 염료의 겉보기 "크기"는 표준 DNA 사다리의 DNA 조각에 의해 이동된 거리에서 생성된 표준 곡선에서 추정되었습니다.

이 값은 예를 들어 사다리 믹스에 존재하지 않는 염료의 "크기"를 추정하는 데 사용할 수 있는 표준 곡선을 구성하기 위해 학생 실험에서 각 염료에 의해 이동된 측정된 거리와 함께 사용할 수 있습니다. 값은 (1.0 ± 0.2)%의 겔 농도에 대해 합리적으로 정확합니다.

즉석 겔 전기영동

상용 전기영동 장치가 있는 경우 가장 일관되고 안전한 젤 실행을 제공합니다. 그렇지 않으면 쉽게 구할 수 있는 재료로 즉흥 연주하는 것이 비교적 간단하고 프로토콜을 사용할 수 있습니다[ 8, 9 ]. 작은 폴리프로필렌 식품 저장 용기에 젤을 캐스팅한 다음 사용 현장에서 전기 영동[8]의 경우 특히 효과적입니다.

설명된 디자인에 대한 유용한 개선 사항 중 하나는 젤에 직접 삽입된 염료에 적신 여과지 스트립을 사용하는 대신 로드할 염료 샘플을 유지하기 위해 우물을 생성하기 위해 "빗"으로 젤을 주조하는 것입니다. 빗은 기존 전기영동 세트에서 가져오거나 슬롯을 1-1.5mm 두께의 플라스틱 시트 조각으로 절단하여 만들 수 있습니다. 이것은 캐스팅하는 동안 빗을 배치하고 지지하는 데 더 많은 노력이 필요하지만, 염료 밴드는 우물에 로드할 때 번짐이 적고 더 잘 정의된 것처럼 보입니다.

또한 전극에 4-5mm 직경의 탄소 막대를 사용하여 설정을 개선하는 것이 좋습니다. 백금 또는 스테인리스강의 전극은 내식성으로 인해 바람직하지만 고가의 전문 품목입니다. 나동선이 많이 사용되지만[8,9], 이는 착색된 석출물이 생성되고 공정에서 부식되는 단점이 있다. 탄소 막대는 저항이 더 높지만 부식되지 않고 재사용할 수 있습니다.

악어 집게가 달린 구리 와이어가 각 탄소 막대의 끝에 고정되었습니다. 악어 클립과 탄소 막대의 끝은 클립의 금속이 전해질 용액과 접촉하는 것을 방지하기 위해 실험실용 밀봉 필름("파라필름")으로 단단히 포장되었습니다. 젤을 식품 용기(~15cm x 10cm 또는 6인치 x 4인치)에 넣은 후 벽에서 약 2cm 떨어진 용기의 긴 면과 평행하게 젤을 자릅니다. 끝을 들어 올렸다. 생성된 2개의 홈통에 하나의 탄소 막대를 배치하여 서로 평행하지만 반대쪽 끝에 연결된 전선이 있도록 합니다. 이러한 방식으로 배열되면 상당히 균일한 전기장이 겔의 중앙 부분을 통과하여 60분 이내에 12V에서 염료의 효과적인 전기영동 분리가 가능합니다(그림 3 참조).

즉석 겔 전기 영동을 위한 집에서 만든 장치. 1% 한천-한천 겔, 10m M 중탄산나트륨 전해질 용액. 웰당 약 7.5μl의 각 염료 용액을 로드하고 60분 동안 12V를 적용했습니다. 모든 염료는 20% 글리세롤 용액으로 구성됩니다. 차선 (왼쪽에서 오른쪽으로): 0.1% 크실렌 시아놀 FF, 0.1% 브로모페놀 블루, 0.2% 오렌지 G, 0.1% 폰소 S. 다음 4개의 레인이 반복됩니다. 이 집에서 만든 챔버의 전계 강도는 ~2 V cm -1 입니다.

안전을 위해 그리고 작은 용기 내의 열 축적을 최소화하기 위해 낮은 전압(<24V)만 사용해야 합니다. 범용 12V DC 변압기(200–500mA)를 쉽게 구할 수 있으며 이 용도에 적합합니다. 전류 흐름은 12~20mA 범위에 있는 것으로 나타났습니다. 프로세스 속도를 높이기 위해 12V에서 24V 사이의 더 높은 전압이 필요하고 적절한 실험실 전원 공급 장치를 사용할 수 없는 경우, 대부분이 이 범위의 전압 출력을 가지므로 컴퓨터 노트북용 전원 공급 장치를 사용할 수 있습니다. 전극이 서로 접촉하지 않도록 하는 것과 같이 단락을 방지하기 위해 모든 경우에 주의해야 합니다.

즉석 탱크의 낮은 전계 강도 내에서 염료의 이동은 느립니다. 따라서 사용하기에 가장 좋은 염료는 명확하게 분리된 밴드를 보는 데 걸리는 시간을 최소화하기 위해 가장 빠르게 이동하는 염료입니다. Ponceau S, 오렌지 G 및 브로모페놀 블루는 가장 빠르게 이동하는 반면 자일렌 시아놀 FF는 가장 느리게 이동하므로 네 번째 염료로 유용합니다. 네 가지 염료가 모두 함께 잘 분리된 다채로운 밴드 세트를 만듭니다.

염료 기반 겔 전기영동을 이용한 수업 활동

알려지지 않은 DNA 단편의 크기 결정 – 연구실에서 DNA 겔 전기영동의 일상적인 응용 중 하나는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 또는 박테리아로부터 플라스미드 DNA 추출과 같은 실험에서 생성된 DNA 단편의 분석입니다. DNA 조각의 크기 결정은 기본 기술이며 "염색 사다리"를 준비하고 다른 하나 또는 두 개의 염료를 "미지의 DNA"로 사용하여 쉽게 시뮬레이션할 수 있습니다.

사다리에 선택한 염료는 잘 분리되어야 합니다. 염료 사다리는 처음부터 준비해야 하며 단순히 여러 염료를 혼합하여 개별 염료가 희석되어서는 안 됩니다. 사다리를 위해 선택한 염료의 무게를 잰 다음 동일한 병에 넣은 다음 동일한 부피의 20% 글리세롤 용액을 단일 염료인 것처럼 추가해야 합니다.

"알 수 없는 DNA" 샘플은 이상적으로는 DNA 사다리 믹스에 포함되지 않은 염료여야 합니다. 그런 다음 학생들은 사다리 믹스와 알려지지 않은 샘플로 젤을 실행하고 표 I에 제공된 명목 "bp 크기" 값을 사용하여 표준 곡선의 그래프를 구성한 다음 그래프를 사용하여 알려지지 않은 샘플의 크기를 추정할 수 있습니다[ 1 ].

DNA 지문 – 아마도 염료 기반 겔 전기영동의 가장 간단하고 가장 일반적인 응용은 "법의학 DNA 지문" 시뮬레이션일 것입니다. 이것은 여러 "용의자"의 DNA 프로필을 나타내는 염료 혼합물의 여러 변형을 준비하고 그 중 하나의 복제 준비를 "범죄 현장 DNA" 샘플로 지정하여 달성할 수 있습니다. 이에 대한 변형은 고유한 "범죄 현장 DNA" 샘플을 사용하여 용의자의 무죄를 선고하는 것입니다.

유전자형 식별 – 교실 수업에 사용되는 인기 있는 PCR 기반 실험은 다음과 같은 특정 위치에서 학급의 각 학생의 유전자형을 결정하는 것입니다. 알루 PV92 [ 1 ]. 유전자형은 DNA 밴드 중 하나 또는 둘 모두의 존재에 대해 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 시각화됩니다. 각 밴드는 유전자 또는 유전자좌에 대한 두 가지 가능한 대립유전자 중 하나를 나타냅니다. 이 연습은 유전과 집단 유전학의 개념을 가르치는 데에도 사용할 수 있습니다. 메틸 오렌지와 오렌지 G, 크레졸 레드, 폰소 S와 같은 유사한 색상의 쌍을 이루는 염료 또는 브릴리언트 그린과 메틸 그린의 양이온 염료는 이러한 실험에서 증폭된 DNA의 두 대립형질 형태를 시뮬레이션하는 데 사용할 수 있으며 따라서 PCR 없이도 많은 핵심 교육 포인트를 다룹니다.

앞서 언급한 표준 DNA 과학 연습 외에도 염료 기반 겔 전기영동은 탐구 중심 학습을 안내하는 시스템으로 사용될 수도 있습니다. 다른 사람들은 또한 이동 방향에 대한 전하의 영향과 같은 물리 과학 개념에 대한 논의를 연결하기 위해 동일한 겔에 양이온 및 음이온 염료를 모두 사용하는 것을 제안했습니다. 전기장[ 7 ](그림 4 참조).

하전된 염료의 예. 두 가지 예시 염료의 구조. 주황색 G는 음이온성 또는 음전하를 띤 염료입니다. Pyronine Y(Pyronine G라고도 함)는 양이온성, 양전하를 띤 염료입니다[ 12 ].


프로토콜

1부: 젤 실행하기

  1. 지난 시간의 M13KO7 샘플에 2.5μl 로딩 염료를 추가합니다. 로딩 염료에는 전기영동의 진행을 추적하는 염료로 자일렌 시아놀(젤 끝에서 가장 작은 조각이 흘러나오지 않도록!)과 샘플이 웰에 가라앉는 데 도움이 되는 글리세롤이 포함되어 있습니다.
  2. eppendorf 튜브를 가볍게 흔들어 내용물을 섞은 다음 microfuge에서 빠르게 회전시켜 튜브의 내용물을 바닥으로 가져옵니다.
  3. 아래 표에 표시된 순서대로 젤을 로드합니다. 한 그룹은 웰 1 - 3에 로드하고 다른 그룹은 웰 5 - 7에 로드합니다. 샘플을 로드하려면 P200 끝에 25μl를 넣습니다. 버퍼의 표면 아래 및 우물 바로 위에 팁을 낮춥니다. 팁을 우물 자체로 너무 깊이 내리면 우물 바닥에 구멍이 날 위험이 있습니다(구멍이 잘 뚫린 경우 = 나쁨!). 샘플을 우물로 배출하십시오. 겔 상자에서 팁을 제거할 때까지 피펫 플런저를 놓지 마십시오(또는 샘플을 팁으로 다시 끌어들일 것입니다!).
  4. 모든 샘플이 로드되면 젤 상자를 전원 공급 장치에 연결하고 젤을 125V에서 45분 이상 실행하지 마십시오.
  5. 젤 사진을 찍고 관련 DNA 밴드를 절제하는 방법을 보여줍니다.
로드할 레인, 샘플 및 볼륨.
레인 시료 로드할 볼륨
1 1kb 마커 5(마이크로)
2 M13KO7 자르지 않은 샘플 모든 반응 부피(

젤 로딩. (MIT OpenCourseWare의 그림)

파트 2: DNA 분리/정제

아가로스에서 DNA를 정제하려면 Qiagen에서 판매하는 키트를 사용합니다. 시약에는 정보가 없는 이름이 있으며 그 내용은 독점적입니다. Agarose Purification 키트는 실리카겔 멤브레인으로 DNA를 스핀 컬럼에 결합하고 염을 씻어내고 멤브레인에서 DNA를 용출해야 합니다.

  1. 550(µl) 추가 QG 아가로 오스 조각에.
  2. 아가로스가 완전히 용해될 때까지 50°C에서 10분 동안 배양합니다. 몇 분마다 50°C 열에서 튜브를 꺼내 내용물을 가볍게 쓸어 넘길 수 있습니다. 이것은 아가로스를 용해하는 데 도움이 됩니다.
  3. eppendorf 튜브에 125μl의 이소프로판올을 추가합니다.
  4. 교수진으로부터 수집 튜브(투명)가 있는 QIAquick 스핀 컬럼(보라색)을 받으십시오. 스핀 컬럼에 라벨을 붙인 다음(수집 튜브가 아님!) 용해된 아가로스 혼합물을 컬럼 상단에 파이펫팅합니다. 60초 동안 수집 튜브의 컬럼을 미세분리합니다. QIAquick 컬럼의 최대 용량은 800 µl입니다! If you have more than 800 µl in your mixture, you will need to repeat this step.
  5. Discard the flow-through in the sink and replace the spin-column in its collection tube. Add 750 µl of PE to the top of the column and spin as before.
  6. Discard the flow-through in the sink and replace the spin-column in the collection tube. Add nothing to the top but spin for 60 seconds more to dry the membrane.
  7. Trim the cap off a new eppendorf tube and label the side with your team color and the date. Place the spin-column in the trimmed eppendorf tube and add 30 µl of EB to the center of the membrane.
  8. Allow the column to sit at room temperature for one minute and then spin as before. The material that collects in the bottom of the eppendorf tube is your purified plasmid backbone, ready to be ligated. Give it to the teaching faculty who will store it with your insert until next time.

Part 3: Titering Phage

One technique you will see several times this term is plating for plaques. The idea of this technique is simple. Since phage infection slows down the growth of bacteria, any phage-infected cell will grow less quickly than an uninfected one, giving rise to a zone that is more clear on a lawn of fully grown cells. This zone is called a plaque and by counting the number of plaques formed, it is possible to measure the number of infective phage in the sample you are testing. The number of infected phages is measured as PFUs, which is "plaque forming units per ml."

Plaques formed by bacteriophage upon infection of susceptible bacteria. Source: Assorted Views of Bacteriophage Plaques. © Quiroz. Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.

  1. Start by placing 6 LB plates in the 37° incubator to prewarm them. If there is any condensation on the surface of the plates, then you can leave the lids slightly ajar to dry the plate surface.
  2. Aliquot 200 µl of bacteria into 6 small, sterile test tubes. The bacteria you are using are the strain ER2267 since this strain has a selectible F'. Label the tops of each tube with a colored sticker and one of the following: none, none, 10 -4 E4, 10 -6 E4, 10 -4 K07, 10 -6 K07.
  3. The teaching faculty have two phage stocks for you to compare, an M13KO7 phage stock and a stock of another M13 phage called E4. You will need to serially dilute each stock, making stepwise 1/100 dilutions in eppendorf tubes. For example, add 10 µl of a phage stock to 990 µl sterile water for a 10 -2 dilution, then repeat, using 10 µl of the 10 -2 dilution into 990 µl sterile water to make a 10 -4 dilution. Vortex the dilutions before removing any liquid and change pipet tips to prepare each new dilution. Continue serially diluting the phage to final concentrations that are 10 -4 th and 10 -6 th as concentrated as the starting stock.
  4. Mix 10 µl of one of the 10 -4 dilutions into a tube with bacteria.
  5. Mix 10 µl of one of the 10 -6 dilution into another tube with bacteria.
  6. Repeat with the dilutions of the other phage stock.
  7. One of the teaching faculty will show you how to mix 3 ml of top agar into one of the uninfected samples you have prepared and how to pour the molten mix onto the surface of a prewarmed LB plate.
  8. You and your partner should add top agar to the other uninfected sample and the four phage infected ones.

Allow the top agar to solidify by leaving the plates on the bench at least 5 minutes then stack them and wrap them with your colored tape and finally move them to the 37° incubator to grow overnight. One of the teaching faculty will remove them from the incubator tomorrow and store them for you until next time.


Principle:

The negatively charged DNA molecules migrate towards the positive charge under the influence of constant current, thus the separation depends on the mass and charge of DNA. The DNA molecules are forced to move through the agarose gel pores. The rate of the migration depends on,

      • The strength of the field
      • The hydrophobicity of the DNA
      • The ionic strength of the buffer
      • The size and shape of the DNA
      • The temperature of the buffer

      Three of the important factors that affect DNA migration rate are,

      As we discussed earlier if the concentration of agarose is lower, the DNA can migrate easily and faster and vice versa.

      The supercoiled DNA migrates faster than the linear DNA and circular DNA.

      The supercoiled form of DNA is more compact than other forms and this is the reason for its speedy migration.

      If the size of a DNA is larger, the migration rate of it is lower and therefore PCR product of several hundred base pairs migrates faster than the total genomic DNA.


      When is gel electrophoresis used to separate DNA fragments?

      Gel electrophoresis can be used for a range of purposes, for example:

      • To get a DNA fingerprint for forensic purposes
      • To get a DNA fingerprint for paternity testing
      • To get a DNA fingerprint so that you can look for evolutionary relationships among organisms
      • To check a PCR reaction.
        See the video clip: Using gel electrophoresis to check a PCR reaction
      • To test for genes associated with a particular disease.
        Find out more in the article, Gel electrophoresis can be used to find genes associated with a disease.

      Now this image is pretty good but what is the problem?

      Here the annealing temperature of the primer is not selected properly. So the primer is compromised with other complementary sequences present in the genome. The annealing temperature is too low in comparison with its actual annealing temperature.

      Due to this reason, more than 4 bands of PCR amplicons are observed in the gel. Further, see the green arrow, a bubble hindered the separation of the DNA ladder.

      Conclusively, the PCR is not performed with the optimum PCR conditions.


      SYBR Green

      The SYBR Green I and II stains (again, marketed by Molecular Probes) are optimized for different purposes. Because they bind to DNA, they are still considered potential mutagens and because of that, they should be handled with care.

      SYBR Green I is more sensitive for use with double-stranded DNA, while SYBR Green II, on the other hand, is best for use with single-stranded DNA or RNA. Like the popular ethidium bromide stain, these highly sensitive stains fluoresce under UV light.

      Both SYBR Green I and II are recommended by the manufacturer to be used with "254 nm epi-illumination Polaroid 667 black and white film and a SYBR Green gel stain photographic filter" to achieve detection of 100 pg of RNA or single-strand DNA per band.


      Successful DNA Plasmid Preps

      Although DNA plasmid preps can return multiple forms of DNA, there is only one kind you want for successful cloning and transfection: supercoiled. Make sure you know how to increase your recovery of good quality supercoiled DNA. Did this help you understand why you get three bands when running plasmid DNA on agarose gels? Do you have any other plasmid prep tips? We’d love to hear in the comments.

      Originally published October 8, 2014. Reviewed and republished April 2021.


      비디오 보기: ბიოლოგია, X კლასი - ნუკლეინის მჟავები - დნმ და რნმ #ტელესკოლა (할 수있다 2022).


코멘트:

  1. Yozshull

    나는 당신이 착각하고 있다고 생각합니다. 나는 그것을 증명할 수 있습니다. 오후에 나에게 편지를 보내면 논의 할 것입니다.

  2. Fenrigrel

    올바른 문구



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