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재조합 단백질 생산을 촉진하기 위한 상용 벡터 기술 플랫폼이 있습니까?

재조합 단백질 생산을 촉진하기 위한 상용 벡터 기술 플랫폼이 있습니까?


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저는 바이오메디컬 업계의 초보자입니다. 우리 팀은 재조합 단백질 생산을 촉진하기 위한 새로운 벡터 기술을 찾고자 합니다. 이러한 플라스미드를 제공하는 회사를 구글링하는 것은 어렵습니다.

존재하는지 아는 사람이 있습니까?

감사 해요!


단백질 치료제 시장 및 #8211 기술 발전으로 단백질 치료제 시장 성장 촉진

유전 공학 및 재조합 DNA 기술의 출현으로 이제 다양한 인간 단백질을 생산할 수 있습니다. BCC Research는 이러한 새로운 기술이 치료 단백질 시장을 새로운 차원으로 끌어올렸다는 것을 발견했습니다. 재조합 DNA 기술은 단백질 치료제의 제조를 용이하게 하고 전통적인 자연 추출 방법을 대체하고 있습니다. 고품질 재조합 치료제에 대한 수요 증가는 생산 수율 향상을 위한 포유동물 세포 기반 제조 시스템의 연구 개발에 동기를 부여하고 있습니다.

실제로, 단백질 치료제는 의료 산업의 중요한 부분이 되었으며 최근 몇 년 동안 그 수가 증가했습니다. 저분자 약물에 비해 많은 장점이 있는 단백질 요법은 정상적인 생물학적 과정을 방해할 가능성이 적고 내약성이 좋은 유망한 시장을 형성합니다. 단백질 치료제는 특이도가 높고 면역원성이 낮기 때문에 암, 당뇨병, 다발성 경화증과 같은 다양한 질병의 치료에 널리 사용됩니다.

수익 측면에서 단일 클론 항체가 가장 큰 시장 부문입니다. 많은 만성 질환의 증가된 발병률은 단일클론 항체의 사용을 주도했습니다. 그러나 이 부문은 후속 생물학적 제제의 진입으로 경쟁에 직면해 있습니다. 백신은 바이오 제약 산업의 또 다른 성장 부문입니다. 경제 상황 개선, 백신 접종에 대한 대중의 인식 증가, 바이러스 및 박테리아 감염을 근절하기 위한 정부의 세계적인 노력이 핵심 동인입니다. 개선된 제조 기술도 백신 시장에 활력을 불어넣었습니다.

질량 분석법과 같은 기술의 발전, 분자 유전학의 발전, 생산 기술의 발전은 모두 단백질 치료제 시장의 핵심 동인입니다. 또한, 의료 기술의 급속한 발전, 질병 진단의 향상, 신흥 시장에서의 의료 확대는 시장에 긍정적인 영향을 미칠 것입니다. 특허 만료 및 경쟁 심화도 주요 영향입니다.

단백질 의약품의 세계 시장은 2015년에 1,747억 달러에 도달했습니다. 5년 CAGR(연간 복합 성장률) 7.3%로 2020년까지 2,487억 달러에 이를 것으로 예상됩니다. 지역별로는 미국이 가장 큰 시장으로 평가되고 있습니다. 미국은 또한 가장 빠르게 성장하고 있으며 5년 CAGR 10.9%로 2020년까지 이 지역의 수익은 1,541억 달러가 될 것으로 예상됩니다. 2015년에는 2.6%의 5년 CAGR을 반영하여 2020년까지 총 481억 달러가 될 것으로 예상됩니다.

단백질 의약품 시장은 펩타이드 호르몬, 모노클로날 항체, 사이토카인, 치료 효소, 혈액 인자, 백신, 펩타이드 항생제 등의 유형에 따라 광범위하게 분석됩니다.


펩타이드 호르몬
펩티드 호르몬에는 인간 성장 호르몬, 인슐린, 에리트로포이에틴 및 성선 자극 호르몬이 포함됩니다. 비만의 증가와 신체 활동의 감소로 인해 호르몬 장애가 증가하고 있습니다. 소비자의 편의를 위한 전달 시스템 및 장치의 도입도 펩타이드 호르몬 시장을 활성화했습니다. 인슐린 시장은 당뇨병 인구의 증가로 인해 향후 몇 년 동안 성장할 것으로 예상됩니다. 그리고 성선 자극 호르몬은 가임 연령이 증가함에 따라 그에 비례하여 증가할 것으로 예상되는 불임 장애의 치료에 사용됩니다.

펩타이드 호르몬 시장은 크게 성장호르몬과 에리스로포이에틴으로 구분됩니다. 인간 성장 호르몬은 치료제로서 중요성을 얻었지만 일부 제품의 제네릭 버전은 이미 사용할 수 있습니다. 광범위한 신장 빈혈은 에리트로포이에틴에 대한 수요를 증가시켜 펩타이드 호르몬 시장의 주요 기여자가 되었습니다. 2세대 에리트로포이에틴인 다베포에틴은 환자에게 투여 빈도를 줄여주어 다베포에틴의 시장 점유율이 높아지고 있습니다.

펩타이드 호르몬의 세계 시장은 신약 승인에 힘입어 2015년 말까지 304억 달러에 이르렀습니다. 에리트로포이에틴 부문의 하락은 부분적으로 경쟁 심화로 인한 것이었습니다. 저렴한 바이오시밀러의 도입은 시장을 아래쪽으로 밀어낼 것으로 예상됩니다. 2015년 인간 성장 호르몬 시장은 제네릭 의약품의 등장으로 거의 정체 상태에 머물렀고 크게 성장할 것으로 예상되지는 않습니다.

백신
수익 창출 측면에서 백신은 제조업체에게 가장 밝은 분야 중 하나입니다. 성인용 백신의 수용 증가, 독감 예방에 대한 대중의 인식, 새로운 백신의 도입이 주요 성장 요인입니다. 다양한 정부 프로그램과 수막염, 디프테리아, 장티푸스와 같은 세균성 질병에 대한 대중의 인식이 높아짐에 따라 여러 국가에서 예방 접종률이 증가했습니다. 백신 시장은 인구 증가와 간경변, 간 질환 및 원발성 간암에 대한 치료 백신의 필요성에 의해 주도됩니다.

백신 시장은 완만한 성장 전망, 더 높은 자본 투자, 연구 개발 활동에 대한 투입 증가가 특징입니다. 새로운 제조 기술(예: 인플루엔자 백신에 부화란 사용)을 사용하면 백신을 제조하는 데 필요한 시간과 비용이 줄어듭니다. 세계보건기구(WHO)는 백신에 대한 접근성이 확대되면 2010년 말까지 2,460만~2,580만 명이 사망하는 것을 예방할 수 있을 것으로 예측했습니다.

전체 백신 시장은 말라리아와 같은 질병에 대한 새로운 백신의 혁신과 발견으로 인해 잘 성장할 것으로 예상됩니다. 바이러스 백신은 인플루엔자 및 간염과 같은 질병의 광범위한 확산으로 인해 가장 큰 부문을 차지합니다. 바이러스 백신 시장은 소아마비 및 홍역과 같은 질병에 대한 정부 인식 프로그램의 혜택을 받았습니다. 2015년에 128억 달러 규모의 박테리아 백신 시장이 크게 성장했습니다. 이 부문은 2020년까지 10.9%의 CAGR로 지속적으로 성장할 것으로 예상됩니다.

치료 효소
치료 효소는 다양한 유형의 대사 및 효소 장애로 이어질 수 있는 효소 결핍을 치료하는 데 사용됩니다. 일부 효소 장애는 효소 대체 요법이 필요하며, 이 요법에서는 영향을 받은 개인에게 비활성화되거나 없는 특정 효소가 실험실에서 분리되거나 생산되는 기능적 효소 분자로 대체됩니다. 효소 요법은 낭포성 섬유증, 췌장 기능 부전 및 특정 암에 사용됩니다.

글로벌 치료용 효소 시장은 리소좀 효소, 췌장 효소 등(주로 혈전용해 효소)으로 나뉩니다. 브랜드 제품의 판매 증가는 주로 전체 효소 시장의 성장을 주도하고 있습니다. 리소좀 부문이 지배하는 치료용 효소의 세계 시장은 2015년에 66억 달러에 도달했으며 2020년까지 10.4%의 CAGR로 성장할 것으로 예상됩니다.

단클론항체
지난 몇 년 동안 단클론항체로 인한 상업적 성과는 다른 치료 클래스와 비교할 수 없습니다. 단일클론항체 시장의 원동력은 암 발병률 증가를 포함하며, 치료제로서의 단일클론항체의 특정 이점은 면역학 및 종양학에서 충족되지 않은 치료 요구를 해결하기 위한 더 높은 수요와 새로운 표적 공간에 대한 접근의 결과로 인한 경쟁 감소를 포함합니다. 광범위한 작용 방식은 단일 클론 항체의 또 다른 놀라운 이점으로 다양한 질병에 유용합니다. 그들의 높은 특이성 때문에, 단일클론항체는 표적 치료제로서 매우 중요하게 되었다.

바이오시밀러 출시로 인해 단일클론항체 시장 시나리오가 변화하고 있다. 대부분의 단일클론항체의 특허는 2020년 이전에 만료될 예정입니다. 인플릭시맙 바이오시밀러인 첫 번째 바이오시밀러 분자는 2020년까지 8개가 추가될 예정입니다. 그러나 일련의 출시가 브랜드 항체 시장을 즉시 흔들지 않을 수도 있습니다. 단일클론항체의 복잡한 구조, 길고 복잡한 제조 공정, 엄격한 규제 요건으로 인해 많은 바이오시밀러의 시장 진입이 제한될 것입니다. 인간 모노클로날 항체 시장은 2020년까지 16.6%의 CAGR로 성장할 것으로 예상됩니다.

사이토카인
사이토카인 시장은 크게 콜로니 자극 인자, 인터루킨, 인터페론으로 특징지어집니다. 이 시장의 결정 요인은 B형 및 C형 간염 사이토카인 치료제의 출시와 면역 강화 사이토카인 치료제의 출시였습니다. 후자는 장기 이식 중 및 후에 사용되며 화학 요법 중 감염과 싸우기 위해 사용됩니다. 세계 사이토카인 시장은 완만하게 성장하고 있습니다. 간염 환자의 증가와 치료용 인터페론의 가격 인상이 원동력입니다. 유럽 ​​및 기타 국가에서 바이오시밀러의 가용성은 사이토카인 시장을 제한하는 요소입니다.

인터페론은 2015년 71억 달러로 사이토카인 시장을 주도했으며 과립구 집락 자극 인자가 그 뒤를 이었습니다. 인터루킨 세그먼트는 모든 지역의 고령화 인구와 그에 따른 연령 관련 황반변성 발병률 증가로 인해 2020년까지 가장 큰 성장을 경험할 것입니다.

혈액 인자
혈액 인자는 단백질 치료 산업의 주요 기여자입니다. 출혈 장애의 발생률이 증가함에 따라 혈액 인자의 더 많은 사용이 필요합니다. 노년층은 혈액제제에 대한 수요가 높아 질병에 걸리기 쉬우므로 인구 고령화도 또 다른 성장 요인입니다.

혈액 인자 시장은 주로 응고 인자(주요 부분)와 면역 글로불린으로 나뉩니다. 다양한 응고 인자의 재조합 버전은 이 부문의 성장을 위한 주요 동인입니다. 글로벌 면역글로불린 시장도 면역글로불린 치료제에 대한 지속적인 수요와 신규 적응증에 대한 기존 정맥주사용 면역글로불린 제품 승인 등으로 호황을 누리고 있다.

혈액 인자 시장은 2015년에 105억 달러에 도달했으며 향후 몇 년 동안 증가할 것으로 예상되는 응고 인자의 판매가 주도하고 있습니다. 재조합 기술을 통해 파생된 제품은 자연 추출 과정을 통해 파생된 제품에 비해 오염이 적기 때문에 제조업체와 소비자 모두에게 더 친숙합니다. 면역글로불린 시장을 이끄는 요인으로는 기존 제품 판매, 진단 증가, 면역질환 예방치료 증가 등이 있다.

펩티드 항생제
펩티드 항생제(사이클로스포린, 반코마이신, 바시트라신 등 포함)는 비교적 작은 분자입니다. 그들은 광범위한 병원체에 대해 신속하고 치명적으로 작용하고 많은 약물 내성 메커니즘을 피합니다. 장기 보존 및 조달 기술의 최근 발전은 장기 이식의 증가와 새로운 펩타이드 항생제의 개발에 기여했습니다.

2015년에 사이클로스포린은 거의 19억 달러에 달하는 펩타이드 항생제 시장의 가장 강력한 부분이었습니다. 항생제 내성 박테리아의 출현으로 반코마이신 사용이 감소했으며, 이는 메티실린 내성 황색 포도구균 감염에 대한 대체 또는 새로운 치료 옵션의 가용성에 직면하고 있습니다. 펩타이드 항생제 시장도 제네릭의 등장으로 부정적인 영향을 받고 있다. 그러나 이 시장은 최근 몇 년 동안 새로운 승인의 결과로 반등하고 2020년까지 증가할 것으로 예상됩니다.

단백질 치료제 시장에 영향을 미치는 요인

고령화 인구의 증가와 이에 따른 고령화 질환의 증가는 필연적으로 단백질 치료제 시장의 성장으로 이어질 것으로 예상된다. 당뇨병, 암, 자가면역 질환 및 심혈관 질환과 같은 만성 질환이 점점 더 만연해지고 있습니다. 세계 보건 기구(WHO)에 따르면 만성 질환은 2030년까지 전 세계적으로 7번째 주요 사망 원인이 될 것입니다. 단백질 치료제는 효능이 더 높고 부작용이 적기 때문에 이러한 질병 치료에 도움이 됩니다. 따라서 이러한 질병으로 고통받는 사람들의 증가는 단백질 치료제 시장의 성장으로 이어졌습니다.

제조 기술의 발전은 단백질 치료제 산업의 또 다른 주요 요인입니다. 전통적으로 단백질은 인간이나 다른 생물학적 자원에서 추출되었습니다. 예를 들어, 백신은 계란 배양을 사용하여 만들어졌습니다. 그러나 재조합 DNA 기술의 출현으로 제조업체는 이제 유전자 변형 유기체를 사용하여 많은 양의 백신을 생산할 수 있습니다. 혈액 제품은 처음에는 인간 혈장에서 추출되었지만 현재는 박테리아 발현 시스템이나 포유동물 세포 배양 시스템에서 DNA 기술을 사용하여 제조됩니다. 단백질 치료제 시장의 성장은 이러한 제조 기술의 발전을 반영할 가능성이 높습니다.

단백질 치료제의 높은 비용은 주요 과제입니다. 높은 제품 가격으로 인해 환자가 빠르고 효과적인 회복을 위해 필요로 하는 특정 치료법을 사용할 수 없습니다. 동시에 많은 국가에서 가격이 법으로 통제됩니다. 정부 기관은 소비자에게 의약품을 공급하는 비용의 큰 부분을 부담할 수 있는 국가 의료 기관의 통제를 통해 가격을 규제합니다. 유럽 ​​정부는 약가를 낮추기 위해 공격적인 가격 책정 전략을 채택하고 있습니다. 프랑스, 스페인, 독일과 같은 국가의 의료 개혁은 가격을 통제하고 제네릭을 승인했습니다. 미국에서는 민간 부문 구매에 대한 정부의 가격 통제가 없지만 연방법에 따라 제조업체는 여러 주 및 연방 의료 프로그램에 따라 상환 자격을 얻기 위해 특정 의약품에 대한 리베이트를 지불해야 합니다.

의료 및 의료 산업은 엄격한 규제를 받습니다. 지역/국가별 법률 및 규정은 제품이 성공적으로 개발 및 승인될 수 있는지 여부를 결정하는 중요한 요소입니다. 유익성-위해성 평가는 계속해서 신약 승인에서 주요 고려 사항이며 규제 당국은 승인 후 단계에서 의약품의 안전성에 점점 더 초점을 맞추고 있습니다. 모든 국가는 자체 규제법을 적용하므로 제조업체가 각 국가의 요구 사항을 충족하기가 더 어렵습니다. 따라서 규제 압력은 단백질 치료제 시장에서 문제를 야기합니다.

마지막으로, 유럽 및 기타 국가에서 바이오시밀러의 가용성은 단백질 치료제 시장에 대한 제한 요소입니다. 많은 베스트셀러 약물이 특허 만료를 앞두고 있어 바이오시밀러의 길을 열어가고 있습니다. 2015년 3월 미국 FDA는 필그라스팀에 대한 미국 최초의 바이오시밀러 Zarxio를 승인했습니다. 따라서 북미 시장 시나리오는 바이오시밀러의 등장과 함께 변화할 것으로 예상된다.

이 기사는 BCC Research에서 발행한 다음 시장 분석 보고서를 기반으로 합니다. Shalini Shahani Dewan의 단백질 의약품 글로벌 시장 및 제조 기술(BIO021E). 자세한 내용은 www.bccresearch.com을 참조하십시오.

이 호와 모든 과거호를 온라인으로 보려면 www.drug-dev.com을 방문하십시오.

샬리니 S. 드완 제약 화학에서 석사 학위를 취득했으며 14년 이상의 업계 경험을 보유하고 있습니다. 그녀는 그 공로로 인도 총리로부터 금메달을 수상했으며 인도와 미국의 최고 기업들과 함께 일했습니다. BCC Research에 대한 그녀의 다른 보고서에는 고급 약물 전달 시스템, 정형 외과 약물, 임플란트 및 장치에 대한 글로벌 시장 및 기술, 크로마토그래피용 시약에 대한 글로벌 시장이 포함됩니다.

로리 L. 설리반, ELS는 의료 커뮤니케이션 분야에서 20년의 경험을 가진 보스턴에 기반을 둔 작가이자 편집자입니다. 그녀는 생명 과학 편집 위원회의 인증을 받았습니다. 그녀는 생명 과학에 중점을 둔 BCC Research 블로그에 정기적으로 기고하고 있습니다.


추상적 인

자연적으로 발생하거나 인간이 설계한 모든 단백질이 단순한 영양소, 물 및 햇빛만을 사용하여 안전하고 저렴하며 거의 무제한으로 생산될 수 있는 세상을 상상해 보십시오. 이것은 농업 규모의 재조합 단백질 생산을 위해 식물의 힘을 활용하는 방법을 배우면서 언젠가 현실이 될 수 있습니다. 식물의 분자 농업은 다양한 기술 단백질을 생산하는 성공적인 방법으로 이미 입증되었습니다. 최초의 식물 유래 재조합 약제학적 단백질이 현재 상업적 승인을 앞두고 있으며 더 많은 것이 따를 것으로 예상됩니다.


첫 번째 질문: 어떤 유기체를 사용할 것인가?

단백질 합성 기계가 귀중한 단백질을 생산할 숙주 세포의 선택은 전체 과정의 개요를 시작할 것입니다. 다양한 분자 도구, 장비 또는 시약 등 프로젝트에 필요한 기술을 정의합니다. 미생물 중에서 사용 가능한 숙주 시스템에는 박테리아, 효모, 사상균 및 단세포 조류가 포함됩니다. 모두 장단점이 있으며 관심 단백질에 따라 선택이 달라질 수 있습니다(Demain and Vaishnav, 2009 Adrio and Demain, 2010). 예를 들어 진핵생물의 번역 후 변형(단백질 글리코실화와 같은)이 필요한 경우 원핵생물의 발현 시스템은 적합하지 않을 수 있습니다(Sahdev et al., 2008). 이번 리뷰에서는 특별히 대장균. 다른 시스템은 이 시리즈의 첨부 문서에 자세히 설명되어 있습니다.

사용의 장점 대장균 숙주 유기체가 잘 알려져 있기 때문입니다. (i) 비할 데 없는 빠른 성장 동력학을 가지고 있습니다. 포도당-염 배지에서 최적의 환경 조건이 주어지면 배가 시간은 약 20분입니다(Sezonov et al., 2007). 이것은 포화된 스타터 배양물의 1/100 희석액으로 접종된 배양물이 몇 시간 안에 정지기에 도달할 수 있음을 의미합니다. 그러나 재조합 단백질의 발현은 미생물에 대사 부담을 주어 생성 시간을 상당히 단축시킬 수 있다는 점에 유의해야 한다(Bentley et al., 1990). (ii) 높은 세포 밀도 배양이 쉽게 달성됩니다. 이론 밀도 한계 대장균 액체 배양은 약 200g 건조 세포 중량/l 또는 대략 1× 10 13 생존 박테리아/ml로 추정됩니다(Lee, 1996 Shiloach and Fass, 2005). 그러나 복잡한 매체의 기하급수적인 성장은 그 수치에 가까운 밀도로 이어집니다. 가장 간단한 실험실 설정(즉, 대장균 37ଌ, LB 배지 사용), ρ × 10 10 cells/ml가 상한일 수 있으며(Sezonov et al., 2007), 이는 이론상 한계의 0.1% 미만입니다. 이러한 이유로 높은 세포 밀도 배양 방법은 대장균 재조합 단백질을 생산하는 경우에도 성장이 가능합니다(Choi et al., 2006). 주력 유기체이기 때문에 이러한 전략은 생리학에 대한 풍부한 지식 덕분에 생겨났습니다. (iii) 풍부하고 복잡한 미디어는 쉽게 구할 수 있고 저렴한 구성 요소로 만들 수 있습니다. (iv) 외인성 DNA로의 형질전환은 빠르고 쉽습니다. 플라스미드 형질전환 대장균 5분 안에 수행할 수 있습니다(Pope and Kent, 1996).


2 재료 및 방법

2.1 공정 시뮬레이션

식물 기반 AMP 생산 및 정제 공정은 장비의 크기를 조정하고 재료를 수행할 수 있는 컴퓨터 모델링 도구인 SuperPro Designer® 버전 10(Intelligen, Inc., Scotch Plains, New Jersey http://www.intelligen.com)을 사용하여 모델링되었습니다. 및 에너지 균형, 흐름표 개발, 작업 일정 수립 및 병목 현상 제거. SuperPro Designer® 내장 단위 모델에는 생명 공학, 제약 및 식품 산업의 제조 공정 흐름도를 나타내도록 구성할 수 있는 제조 단위 작업 모음(>140)이 포함됩니다. 소프트웨어는 이러한 프로세스 흐름과 단위 작업을 사용하여 연간 운영 지출(OPEX) 및 자본 지출(CAPEX)을 포함한 프로세스 및 경제 보고서를 생성합니다. 모든 통화는 USD로 표시됩니다.

제조 공정 흐름(예: 단위 작업, 재료, 공정 매개변수)은 작업 공정 지식, 미공개 실험실, 파일럿 및 상업 규모 데이터, 문헌에 발표된 데이터를 사용하여 개발되었습니다. 내장된 SuperPro Designer® 장비 설계 모델은 장비 크기 조정에 사용되었습니다.

2.2 호스트 선택

니코티아나 벤타미아나 기본 사례 시나리오에서 식물 숙주 유기체로 사용됩니다. 니코티아나 벤타미아나 빠른 성장, 유전적 소인, 아그로박테리움 형질전환에 대한 감수성, 재조합 단백질의 높은 발현 수준을 기반으로 실내 식물 분자 농업 응용 분야에 광범위하게 사용됩니다. 29-31 이 종은 Kentucky BioProcessing Inc.(Owensboro, Kentucky), 32 Medicago Inc.(Québec, Quebec, Canada), 33 및 iBio CMO(Bryan, Texas)와 같은 회사에서 치료제 및 백신의 상업적 규모 생산에 사용됩니다. ). 34

모델링된 시설은 트랜스제닉을 사용하여 이전에 보고된 프로세스를 수용하도록 설계되었습니다. N. 벤타미아나 Icon Genetics GmbH(Halle/Saale, Germany)에서 개발한 이중 유도성 바이러스 벡터가 특징입니다. 발표된 결과는 안정한 DNA 프로레플리콘으로부터 분해된 바이러스 RNA 레플리콘의 유도가 잎에 스프레이로 적용된 1-20%(v/v) 에탄올 및/또는 뿌리의 흠뻑에 의해 유발될 때까지 재조합 단백질의 최소 배경 발현을 보여줍니다. 최대 4.3g/kg 식물 FW의 발현 수준을 달성합니다. 35 더 일반적이지만 아그로박테리움-매개된 일시적 발현 생산 플랫폼은 재조합 표적 분자의 신속한 생산을 가능하게 하며, 36 이 형질전환 시스템은 관련 추가 비용이 필요하지 않습니다. 아그로박테리움 투메파시엔스 준비, 진공 침투 및 아그로박테리움 도입 내독소 제거. 37

2.3 시설 설계

시뮬레이션된 제조 시설은 두 개의 개별 공정 모델/흐름표로 구성됩니다. (1) 식물 성장, 에탄올 유도 및 제품 생성을 모델링하는 상류 공정은 (2) 공정에서 제품을 정제하기 위한 하류 공정 모델에 공급됩니다. 식품 가공 보조 사양을 충족하는 제품 불순물. 업스트림 처리의 경우 품질 보증(QA), 품질 관리(QC) 및 우수 농업 및 수집 관행(GACP)과 관련된 실험실 비용 및 다운스트림 처리에 대한 FDA 식품 산업 현행 우수 제조 관행(cGMP)이 설계에 포함됩니다. 장비, 건축 자재 및 가격도 식품 cGMP 표준을 모델로 합니다. 38 Kentucky BioProcessing Inc.(Owensboro, Kentucky)의 상업적 규모의 식물 분자 농업 운영 위치가 위치 종속 비용의 기준으로 선택되었습니다. 위치 종속 비용(예: 전기 및 도시 수도)은 공개적으로 사용 가능한 Owensboro, Kentucky 도시 가격 차트(https://omu.org/)에서 얻은 값을 기반으로 합니다. 시뮬레이션된 제조 시설은 하루 24시간, 주 7일, 연간 운영 시간이 90% 또는 연간 329일인 그린필드 단일 제품 바이오제조 시설로 가정됩니다.

독립적인 시장 분석에서는 관심 있는 식품 안전 애플리케이션에 대해 연간 500kg AMP의 합리적인 기본 사례 시설 생산 수준을 예상합니다(미공개 데이터). 이러한 수요를 충족하기 위해 제안된 시설은 식물과 뿌리를 지지하기 위해 토양이 없는 기질에서 수경 기주 식물이 성장하도록 설계된 3층 수직으로 쌓인 실내 식물 재배 단계를 사용합니다. 재배 단계에는 발광 다이오드(LED) 조명 시스템과 순환식 썰물 및 수경 재배 물 공급 장치가 장착되어 있습니다. 재배 단계 식물 성장은 식물 재배실을 가로질러 자동화된 식물 수확기 및 추가 다운스트림 처리를 향해 단방향으로 전진하는 일련의 트레이로 나뉩니다. 자동화된 벨트는 수확된 식물 조직을 이중 스택 분해기 및 추가 다운스트림 처리로 운반합니다.

시설 및 공정 매개변수 입력의 편집은 표 S1–S4 또는 기본 사례 모델 자체에 나와 있으며 http://mcdonald-nandi.ech.ucdavis.edu/tools/techno-economics/에서 공개적으로 사용할 수 있습니다.

2.4 업스트림 처리

업스트림 처리 모델 순서도는 그림 1에 그래픽으로 표시되어 있습니다. N. 벤타미아나 업스트림 처리에서 소비되는 종자는 검증된 작업 종자 은행에서 사내에서 생성되며, 이는 검증된 마스터 종자 은행에서 차례로 생성됩니다. 종자 은행 방출 테스트에는 발아 효율 > 95%, 성장 동력학 확인 및 바이러스 테스트가 포함됩니다. 종자 생성과 관련된 CAPEX는 제외되지만 관련 종자 생산 비용은 추정 $9.50/g 종자에 포함됩니다(종자 1g은 약 9,500개 종자).

종자는 94의 밀도로 흙이 없는 식물 기질에 놓입니다. N. 벤타미아나 30 × 50 cm 트레이 당 씨앗. 묘목은 35일까지 제조 성숙기에 도달하기 위해 식물 성장 단계에서 수경 재배됩니다. 식물 성장을 위한 영양 용액은 최소한의 폐기물로 재순환되며 pH 및 전도도를 기반으로 일관된 품질을 위해 정기적으로 모니터링 및 조정됩니다. 제조 성숙기에 식물은 별도의 수경재배 저장고, 임시 인클로저용 커튼 및 이중 레일 스프레이 붐이 완비된 유도 공간으로 옮겨집니다. AMP의 재조합 발현은 FW 식물 조직 kg당 0.01L의 4%(v/v) 에탄올을 결합하여 뿌리 관주 및 공중 조직 분무를 통해 1시간 동안 유도됩니다. 그런 다음 식물은 배양 단계로 이동합니다. 유도 후 식물은 재조합 AMP를 발현하므로 별도의 공급 탱크와 수경 저장고를 통해 양액이 순환됩니다. 배양 단계의 영양 용액에는 미량의 에탄올이 포함될 수 있으며, 이는 조기에 AMP 생산을 시작하고 식물 성장 속도를 손상시킬 수 있습니다. AMP는 N. 벤타미아나 6일 동안 조직. 배양 단계의 양액은 배치 간에 재순환되지 않고 대신 생물 폐기물로 보내져 전체 양액의 식물 흡수율이 23%에 달합니다. 배양 단계에서 사용된 영양 용액은 용액에 존재할 수 있는 미량의 바이러스 발현 벡터를 처리하기 위해 생물 폐기물로 처리됩니다.

2.5 다운스트림 처리

다운스트림 처리 모델 흐름도는 그림 2에 그래픽으로 표시되어 있습니다. 다운스트림 처리는 식물 수확으로 시작됩니다. 이것은 공중의 자동 수확기 수집으로 시작됩니다. N. 벤타미아나 식물 조직. 사용된 토양이 없는 식물 기질은 나머지와 함께 폐기물로 보내집니다. N. 벤타미아나 루트 매트릭스. 이 단계의 폐기 비용은 무시할 수 있는 것으로 간주되며 모델에서 명시적으로 계산되지 않습니다. 식물 성장 기질의 처리에는 현장 퇴비화, 시설 경관에 뿌리 덮개로 사용, 농경지에 살포하기 위해 농부가 수집, 마지막 수단으로 매립지로 보내는 등 여러 경로가 있습니다. 성장 배지를 멸균하고 재사용하는 것이 가능하고 비용 효율적일 수 있지만 이는 모델에서 고려되지 않았습니다. 수확된 트레이는 트레이당 0.1L의 물이 포함된 자동 세척기에서 세척됩니다. 수확된 식물 조직은 자동 벨트를 통해 추출로 운반되며, 추출은 식물 바이오매스 입자 크기를 줄이기 위해 이중 스택 분해기로 시작됩니다. 붕해된 조직은 산성 추출을 위해 0.5(v/w) 추출 완충액:식물 FW의 추출 비율로 스크류 프레스로 보내집니다. 효율적인 추출 버퍼 및 조건 N. 벤타미아나 추출이 보고되었습니다. 39 모든 완충액 조성은 표 S5에서 볼 수 있습니다. 식물에서 만든 AMP 정제 프로토콜은 유사한 산성 추출을 사용하여 제거합니다. N. 벤타미아나 숙주 단백질. 11

식물 추출물은 접선 흐름 미세 여과를 사용하여 정화됩니다. 정화된 스트림은 20의 농도 계수에 대한 10kDa 분자량 컷오프를 사용하여 추가 접선 흐름 여과로 한외여과됩니다.

잔류물 스트림의 AMP는 결합 및 용리 작동 모드에서 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 정제됩니다. AMP는 용리 완충액(50mM 인산이수소나트륨, 1M NaCl)에서 등용매로 용리됩니다. 정제된 스트림은 3의 정용여과 인자(즉, 정용여과 완충액의 부피/용액의 부피)를 갖는 인산염 완충 식염수(PBS)로 완충제 교환을 위한 하나의 최종 접선 유동 여과 절차를 거칩니다. 정제된 제형은 분무 건조되고 1-L 플라스틱 백에 채워져 최종 벌크 AMP를 얻습니다.

제품 흐름과 직접 접촉하는 모든 하류 처리수는 역삼투압(RO) 용수입니다. 추출에서 제제화까지 모든 장비는 도시용수로 사전 린스, 0.5M NaOH로 부식성 세척, 도시용수로 후세척, 0.5%(w/w)로 산 세척으로 구성된 CIP(Clean-in-Place) 절차로 사후 처리됩니다. HNO3, 및 RO 물로 최종 헹구었다. 저장 탱크는 SIP(Steam-in-Place)로 전처리를 추가로 살균합니다.

2.6 시나리오 분석

기본 사례 시나리오 출력은 프로세스 경제성에 상당한 영향을 미치는 매개변수를 식별하는 데 사용되었습니다. 우리는 시설 성능 매개변수와 자원 구매 비용이라는 두 가지 매개변수 클래스에 대한 시나리오 분석에 집중했습니다. 시설 성능 매개변수는 모델의 물리적 출력에 직접적인 영향을 미치는 입력으로 정의됩니다. 일반적인 생명 공학 시설 성능 매개 변수에는 숙주 유기체 발현 수준, 단위 작업 회수 및 연간 생산 수준이 포함됩니다. 우리는 표현 수준과 연간 생산 수준을 조사하기로 결정했습니다. 시설 성능 매개변수의 영향을 분석하기 위해 작업 프로세스 지식을 기반으로 매개변수 범위를 설정한 다음 범위 내 각 매개변수 증분에 대한 기본 사례 시나리오에서 파생된 모델(재설계된 시설에 해당)을 개발했습니다. 시설 성능 매개변수 변경으로 인해 모델 입력 및 출력에 대한 일련의 변경이 발생합니다. 각 모델은 고정된 기본 케이스 시나리오 프로세스 입력의 제약을 유지하면서 주어진 매개변수 값의 결과 스트림 구성 및 처리량에 적응됩니다.

자원 구매 비용은 모델의 출력에 대한 자원 활용의 경제적 영향을 직접 제어하는 ​​입력으로 정의됩니다. 이 분석을 위해 구매 가격 매개변수는 OPEX 내의 비용 항목에 포함됩니다.

2.7 대체 시나리오

대체 시설 설계 시나리오는 기본 사례 시나리오 프로세스 경제의 맥락을 보다 광범위하게 탐색하기 위한 비교 모델로 개발되었습니다. 별도의 언급이 없는 한 대체 시나리오 모델은 기본 사례 시나리오 입력과 일치하도록 설계되었습니다. 각 대체 시나리오는 주요 시설 설계 가정의 영향을 분리하기 위해 선택되었습니다.

첫 번째 시나리오는 대체 형질전환 잎이 많은 식물 숙주 유기체인 시금치(시금치 올레라시아) 품종 Industra, 실내 성장 및 에탄올 유도성 발현의 기본 사례 시나리오. 일부 콜리신은 다음에서 성공적으로 발현되었습니다. 에스. 올레라시아 (시금치) 식물에 비해 발현 수준이 약 10배 낮았습니다. N. 벤타미아나 따라서 생산 수준을 높이려면 추가 연구가 필요합니다. 11, 14, 22 여러 살모신과 라이신은 시금치에서 높은 수준으로 발현될 수 있으며, 이는 시금치의 발현 수준에 필적합니다. N. 벤타미아나. 17, 20 이 대체 식물 숙주 유기체의 주요 차이점은 주요 알칼로이드인 니코틴이 부족하다는 것입니다. 니코티아나 종. 기본 사례 시나리오에서 상당한 다운스트림 처리는 니코틴 제거에 중점을 둡니다. 업스트림 및 다운스트림 처리 모델 순서도는 그림 1 및 그림 2에 그래픽으로 표시되어 있습니다. 기본 사례 시나리오 입력에 대한 전체 변경 목록은 표 S4에서 확인할 수 있습니다.

두 번째 시나리오는 야외에서 재배한 형질전환 에탄올 유도성 조사 니코티아나 타바쿰 실내 식물 성장 시설의 대안으로. Large Scale Biology Corporation은 이전에 조사했습니다. N. 타바쿰 야외에서 재배된 재조합 단백질 생산 및 해당 작업에 참여하는 직원은 제품 일관성에 대한 현장 조건 변동성을 특별히 고려하여 이러한 농업적 접근 방식을 추구할 것을 권장했습니다. 40 N. 타바쿰 대신 사용됩니다 N. 벤타미아나 농업 병원체 및 날씨 변동에 대한 회복력이 향상되었습니다. 40 업스트림 처리 모델은 현장에서 생산되는 식물에서 만든 셀룰라아제의 기술-경제적 분석에서 채택되었습니다. 26 업스트림 및 다운스트림 처리 모델 흐름도는 보충 정보, 그림 S1 및 그림 S2에 그래픽으로 표시되어 있습니다. 기본 사례 시나리오 가정에 대한 전체 변경 목록은 표 S6에서 볼 수 있습니다.


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단백질 발현 개요

단백질은 세포의 기능적 필요에 따라 합성되고 조절됩니다. 단백질의 청사진은 DNA에 저장되고 고도로 조절된 전사 과정에 의해 해독되어 전령 RNA(mRNA)를 생성합니다. mRNA에 의해 암호화된 메시지는 그런 다음 단백질로 번역됩니다. 전사는 DNA에서 mRNA로 정보를 전달하는 것이고 번역은 mRNA에 의해 지정된 서열에 기초한 단백질 합성이다.

전사 및 번역의 간단한 다이어그램. 이것은 DNA 염기쌍 서열(유전자)에서 아미노산 폴리펩타이드 서열(단백질)로의 정보의 일반적인 흐름을 설명합니다.

원핵생물에서는 전사와 번역 과정이 동시에 일어난다. mRNA의 번역은 성숙한 mRNA 전사체가 완전히 합성되기도 전에 시작됩니다. 이러한 유전자의 동시 전사 및 번역을 결합된 전사 및 번역이라고 합니다. 진핵생물에서 과정은 공간적으로 분리되어 핵에서 일어나는 전사와 세포질에서 일어나는 번역 또는 단백질 합성과 함께 순차적으로 일어난다.

원핵생물 대 진핵생물의 전사 및 번역 비교.

118페이지 분량의 이 핸드북은 단백질 발현에 대한 포괄적인 정보를 제공하며 특정 응용 분야 및 요구 사항에 적합한 발현 시스템 및 정제 기술을 선택하는 데 도움이 될 것입니다. 실험을 시작할 때 팁과 요령을 얻고 단백질 발현과 관련된 일상적인 문제에 대한 답을 찾으십시오.

전사는 원핵생물과 진핵생물 모두에서 개시(initiation), 연장(elongation), 종료(termination)의 세 단계로 일어난다. 전사는 이중 가닥 DNA가 풀리면서 RNA 중합효소의 결합을 허용할 때 시작됩니다. 전사가 시작되면 RNA 중합효소가 DNA에서 방출됩니다. 전사는 활성화제와 억제인자 및 진핵생물의 염색질 구조에 의해 다양한 수준에서 조절됩니다. 원핵생물에서는 mRNA의 특별한 변형이 필요하지 않으며 전사가 완료되기 전에도 메시지의 번역이 시작됩니다. 그러나 진핵생물에서는 mRNA가 추가로 처리되어 인트론(스플라이싱)을 제거하고 5' 말단에 캡을 추가하고 mRNA 3' 말단에 다중 아데닌을 추가하여 폴리A 꼬리를 생성합니다. 그런 다음 변형된 mRNA는 번역되는 세포질로 내보내집니다.

번역 또는 단백질 합성은 리보솜, 전달 RNA(tRNA), mRNA 및 단백질 인자와 같은 거대분자와 아미노산, ATP, GTP 및 기타 보조인자와 같은 소분자를 필요로 하는 다단계 프로세스입니다. 번역의 각 단계에는 특정 단백질 인자가 있습니다(아래 표 참조). 전체 과정은 원핵생물과 진핵생물 모두 비슷하지만 특별한 차이점이 있습니다.

개시 동안, 개시제 t-RNA에 결합된 리보솜의 작은 서브유닛은 개시 코돈(AUG)을 식별하고 결합하기 위해 5'말단에서 시작하는 mRNA를 스캔합니다. 리보솜의 큰 소단위체는 작은 리보솜 소단위체와 결합하여 개시 코돈에서 개시 복합체를 생성합니다. mRNA의 서열뿐만 아니라 단백질 인자는 개시 코돈의 인식 및 개시 복합체의 형성에 관여한다. 신장 동안 tRNA는 지정된 아미노산(tRNA 충전으로 알려짐)에 결합하고 리보솜으로 이동하여 중합되어 펩티드를 형성합니다. 성장하는 펩타이드에 추가되는 아미노산의 서열은 전사체의 mRNA 서열에 의존합니다. 마지막으로, 초기 폴리펩타이드는 리보솜이 종결 코돈에 도달할 때 종결 단계에서 방출됩니다. 이 시점에서 리보솜은 mRNA에서 방출되고 또 다른 번역 라운드를 시작할 준비가 됩니다.


재조합 단백질 생산을 촉진하기 위한 상용 벡터 기술 플랫폼이 있습니까? - 생물학

재조합 단백질이란? 단백질은 생명에 가장 중요한 생물학적 분자 중 하나입니다. 그리고 이 단백질들은 대사 반응 촉매, DNA 복제, 자극에 대한 반응, 한 위치에서 다른 위치로 분자 이동 등 유기체 내에서 광범위한 기능을 수행합니다. 그러나 우리가 이러한 단백질의 구조, 기능, 메커니즘, 경로 또는 기타 사실을 분석하고자 할 때 자연 공급원에서 그 양이 충분하지 않다는 것을 알게 될 것입니다. 이 경우 우리는 실험실에서 짧은 시간에 많은 양과 순도의 단백질을 저렴한 비용으로 생산해야 합니다. 따라서 재조합 단백질 기술이 필요하다. 재조합 단백질(Recombinant protein)은 단백질의 조작된 형태로, 다양한 방식으로 생성되어 다량의 단백질을 생산하고, 유전자 서열을 변형하고, 유용한 상용 제품을 제조한다. 재조합 단백질은 유전자 발현과 mRNA 번역을 지원하는 시스템에서 복제된 재조합 DNA에 의해 암호화됩니다. 일반적으로 표적 단백질의 cDNA 서열인 재조합 DNA는 잘 특성화된 프로모터의 제어 하에 있고 선택된 숙주 세포 내에서 표적 단백질을 발현하여 높은 수준의 단백질 발현을 달성하도록 설계되었습니다. 재조합 DNA 기술에 의한 유전자 변형은 돌연변이 단백질 또는 다량의 단백질의 발현으로 이어질 수 있다.

적절한 단백질 발현 시스템을 선택하는 것이 재조합 단백질 발현의 성공을 위한 열쇠입니다. 표적 단백질 특성, 의도된 적용, 단백질 수율 및 비용을 비롯한 여러 요인을 고려해야 합니다. 또한, 많은 단백질 발현 프로젝트, 특히 큰 단백질, 막 단백질, 핵 단백질 및 번역 후 변형이 심한 단백질에 대한 과제가 존재합니다.

요즘에는 여러 표현 시스템을 사용하고 있습니다. 시스템마다 기능과 응용 프로그램이 다릅니다. 여기에서는 연구 및 산업 분야에서 일반적으로 사용되는 4가지 시스템을 소개합니다. 그것들은 박테리아 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 바큘로바이러스 발현 시스템 및 포유동물 발현 시스템이다.

그림1. 4가지 표현 시스템

E.coli 발현 시스템은 주요 용도이자 가장 성숙한 발현 시스템입니다. 주된 방법은 표적 DNA 단편을 삽입한 벡터를 숙주 세포에 전달하는 것이다. 그런 다음 IPTG에 의해 단백질 발현을 유도합니다.

가장 초기에 개발되고 가장 널리 사용되는 고전적 발현 시스템으로서 E. coli 발현 시스템은 명확한 유전적 배경, 빠른 번식, 저렴한 비용, 높은 발현, 제품의 쉬운 정제, 우수한 안정성, 강력한 오염 방지 능력의 장점을 가지고 있습니다. 그리고 넓은 적용 범위. 그러나, 원핵생물 발현 시스템에는 많은 단점이 있습니다. 모든 단백질이 용해되는 것은 아닙니다. 세포질에서 잘못 접힌 단백질은 봉입체(inclusion body)라고 불리는 불용성 응집체를 형성하여 정제가 어려울 수 있습니다. 또한, 원핵생물 발현 시스템의 번역 후 변형 처리가 불완전하고 발현된 생성물의 생물학적 활성이 낮다.
따라서, 다른 보다 정교한 시스템도 개발되고 있으며, 이러한 시스템은 이전에 E.coli에서 불가능하다고 생각된 단백질, 예를 들어 글리코실화된 단백질의 발현을 허용할 수 있습니다.

그림2. 잘못 접힌 본체 및 봉입체

새로운 외인성 단백질 발현 시스템으로서 효모 발현 시스템은 원핵 및 진핵 발현 시스템의 장점을 모두 포함했습니다. 유전공학 분야에서 널리 활용되고 있다. Saccharomyces cerevisiae의 완전한 유전자 서열은 1996년에 시퀀싱되었습니다. 양조 및 빵 산업에서 S.cerevisiae의 사용은 수천 년 동안 알려져 왔으며 독소를 생성하지 않고 FDA에서도 인정했습니다. 따라서 효모 시스템에서 발현되는 생산물은 많은 숙주 안전성 실험이 필요하지 않습니다.

그러나, 새로운 효모 시스템에 비해 S.cerevisiae 발현 시스템은 강력하고 엄격한 조절 프로모터가 없는 고밀도 배양에 적합하지 않습니다. 그리고 분비 효율이 낮다. 특히 분자량이 30kD 이상인 표적 단백질은 거의 분비되지 않는 경우가 많다.

나중에 사람들은 분열 효모와 메탄올 효모 발현 시스템을 개발했습니다. 그 중 메탄올 효모 발현 시스템은 가장 널리 사용되는 효모 발현 시스템이다. 현재 주로 사용되는 메탄올 효모는 H Polymorpha, Candida Bodini 및 Pichia Pastris입니다. Pichia Pastoris는 가장 인기 있는 도구입니다. 메탄올 효모의 대부분은 메탄올 효모 산화효소 유전자-1(AOX1)을 포함합니다. 외인성 유전자는 프로모터(PAOX1)의 작용하에 발현되었다. PAOX1은 탄소원으로 포도당 또는 글리세롤을 사용하는 강력한 촉진제입니다. 메탄올 효모에서 AOX1 유전자의 발현은 일반적으로 억제되었다. 그리고 PAOX1은 메탄올이 유일한 탄소원일 때 활성화될 수 있습니다. 따라서, AOX1 유전자의 발현은 유전자의 제어하에 증가될 수 있었다. 외인성 단백질 생산을 표현하기 위한 메탄올 효모의 사용은 종종 최대 그램입니다. S.cerevisiae와 비교하여 그 번역은 포유동물 세포에 더 가깝고 과당화를 겪지 않습니다.

곤충 발현 시스템은 고등 진핵생물과 유사한 외래 단백질을 번역하고 변형하는 능력을 갖는 널리 사용되는 진핵생물 발현 시스템이다. 재조합 배큘로바이러스에 의한 곤충 세포 시스템의 외인성 단백질 발현은 보다 대중적인 발현 방법이다. 단백질 수준은 최대 1입니다.

500mg/L. 그러나 배양액, 산소공급, 대수증식 등 많은 요인에 의해 제한되고 영향을 받습니다.

Baculovirus는 알려진 곤충 바이러스의 가장 큰 그룹이며 가장 초기에 가장 많이 연구되고 적용 가능한 곤충 바이러스입니다. 배큘로바이러스 게놈은 80-160kb 크기의 단일 폐쇄 원형 이중 가닥 DNA 분자입니다. 그것의 게놈은 곤충 핵에서 복제되고 전사될 수 있습니다. DNA 복제는 baculovirus의 껍질에서 조립되는데, 이는 유연성이 뛰어나고 외부 DNA 삽입물의 큰 조각을 수용할 수 있습니다. 그것은 큰 DNA 조각의 발현을 위한 이상적인 운반체입니다.

baculovirus 시스템의 주요 장점은 다음과 같습니다.

  1. 재조합 단백질은 단백질 올바른 접힘 및 이황화 결합과 같은 완전한 생물학적 기능을 가지고 있습니다.
  2. 번역 후 수정
  3. 총 단백질 양의 최대 50%까지 높은 수준의 발현
  4. 큰 삽입 단백질 수용
  5. 여러 유전자를 동시에 발현합니다.

주요 단점은 외인성 단백질 발현이 바이러스 감염으로 인해 세포가 죽기 시작하는 매우 늦은 바이러스 프로모터의 제어 하에 있다는 것입니다.
글리코실화가 척추동물에서 발견되는 글리코실화와 다를 수 있지만 곤충 발현 시스템은 일반적으로 막 단백질 생산에 사용됩니다. 일반적으로 숙주의 범위가 제한되어 있고 변형 없이 척추동물을 감염시키지 않기 때문에 포유류 바이러스보다 사용하는 것이 더 안전하다.

포유류 세포에서 발현되는 재조합 단백질은 일반적으로 플라스미드 형질감염 및 바이러스 벡터 감염을 사용합니다. 플라스미드 형질감염을 사용한 안정적인 세포주는 몇 주 또는 심지어 몇 달이 걸리는 반면 바이러스 벡터는 며칠 내에 빠르게 세포를 감염시킬 수 있습니다.

단백질 발현의 시간적, 공간적 차이에 따라 발현 시스템은 일시적, 안정 및 유도 발현 시스템으로 나눌 수 있습니다. 일시적 발현 시스템은 선택 압력 및 외인성 벡터가 없는 숙주 세포 배양물이 세포 분열 동안 점차적으로 손실되는 것을 의미한다. 표적 단백질 발현 기간이 짧다. 과도 발현 시스템의 장점은 간단하고 짧은 실험 기간입니다. 안정적인 발현 시스템이란 숙주 세포에서 캐리어 DNA가 장기간 안정적으로 복제 및 발현되는 것을 의미합니다. 선택 저항 및 압력 단계가 필요하기 때문에 안정적인 표현은 상대적으로 시간이 많이 걸리고 힘든 작업입니다. 유도 발현 시스템은 표적 유전자가 외래 소분자에 의해 유도될 때 발현되기 시작하는 것을 말한다. 이종 프로모터, 인핸서 및 증폭 가능한 유전자 마커의 사용은 단백질 생산을 증가시킬 수 있습니다.
포유동물 발현 시스템은 단백질 개시 신호, 처리, 분비, 글리코실화에서 독특한 이점을 가지며 온전한 거대분자 발현에 적합하다.

Fig3. 안정적인 세포주 개발

포유류 세포에 의해 생산되는 외래 단백질은 천연 단백질에 더 가깝고, 원핵생물 발현 시스템이나 효모 및 곤충 세포와 같은 다른 진핵생물 발현 시스템에 의해 생산되는 단백질보다 훨씬 더 많은 활성을 갖는다. 이 기술의 단점은 복잡하고 요구 사항이 높으며 수율이 낮고 때로는 바이러스 감염이 존재한다는 것입니다.

무엇보다 이러한 모든 표현 체계에는 장단점이 있습니다. E.coli 및 효모 발현 시스템의 장점은 높은 발현 수준과 저렴한 비용입니다. 그러나 그들의 변형 시스템은 곤충 세포 및 포유류 세포와 다릅니다. 포유류 세포에서 생산되는 단백질은 천연 단백질과 유사합니다. 그러나 단점은 낮은 표현 수준과 복잡한 작업입니다. 상이한 발현 시스템에 의해 생성된 재조합 단백질의 생물학적 활성 및 면역원성은 전환된 번역 후 처리로 인해 때때로 상이하다. 따라서 어떤 발현 시스템을 선택해야 하는지 고려할 때 표적 단백질에 독성이 있는지, 단백질에 생물학적 활성이 필요한지, 해당 단백질에 글리코실화가 필요한지, 비용 효율성, 수율, 정화, 안전 등. 경험이 풍부한 실험 지식을 바탕으로 이러한 모든 요소를 ​​고려하여 우리의 전문 지식이 적절한 결정과 선택을 할 것입니다.

1 번 테이블. 단순히 표현 시스템을 비교

세균 발현 시스템 효모 발현 시스템 곤충 발현 시스템 포유류 발현 시스템
속도 ★★★★ ★★★ ★★
생산하다 ★★★ ★★★★ ★★
PTM
(인간에 비해)
★★ ★★★ ★★★★
비용 ★★★★ ★★★ ★★
애플리케이션 원핵생물 단백질, 단순 진핵생물 단백질 세포내/분비단백질, 이황화결합단백질, 당화단백질 막단백질, 대형단백질,
바이러스 백신, 신호 단백질, 사이토카인, 키나제
복잡한 진핵생물 단백질, 정확한 PTM이 필요한 단백질

당사의 모든 단백질 발현 시스템 서비스를 제공합니다. 재조합 단백질 및 발현 시스템 선택에 대해 궁금한 사항이 있으시면 언제든지 문의해 주세요!


감사의 말

비판적인 토론과 원고 읽기에 대해 Stefan Dübel(독일 브라운슈바이크 공과대학)에게 감사드립니다. 또한 몇 가지 실험을 수행한 기술자 Franziska Resch, Saskia Helmsig 및 Nadine Konisch와 이전 학생인 Stefanie Claudia Pohl에게 감사드립니다. 우리는 EU FP6 지원 조정 활동 자금 지원 활동 "프로테옴 바인더"(계약 026008)와 EU FP7 공동 프로젝트 "Affinity Proteome"(계약 222635) 및 "Affinomics"(계약 241481)의 재정 지원을 인정합니다.


홍역 벡터

지난 8월 프랑스와 벨기에에서는 복제 홍역 백신 바이러스를 기반으로 한 COVID-19 백신을 테스트하기 위해 지원자를 모집하기 시작했습니다. 이 소위 슈워츠 균주는 1960년대에 닭 세포에 대한 연속 계대에 의해 약화되었습니다. 이 바이러스는 SARS-CoV-2의 전체 길이 스파이크 단백질을 발현하고 쥐에서 테스트되었다고 오스트리아 테미스에 벡터 기술을 허가한 프랑스 파스퇴르 연구소의 과학자들이 말했습니다. 이전에 SARS 및 MERS에 대해 마우스에서 테스트되었습니다.

이전에 노인의 감염이나 젊은이의 예방 접종으로 얻은 홍역에 대한 기존 면역이 동일한 벡터를 기반으로 한 Chikungunya 백신에 대한 반응을 약화시키지 않는 것으로 나타났습니다. 홍역 매개체는 “세포로 들어간 다음 더 많은 홍역 백신을 만듭니다. 코로나19 백신 실험을 주도하고 있는 파스퇴르 연구소의 백신 과학자 크리스티안 게르케(Christiane Gerke)는 "다시 나오고 더 많은 세포를 감염시키겠지만 몇 주기 후에는 멈춘다"고 말했다. 홍역 균주가 복제한다는 사실은 이를 아데노바이러스 벡터와 구별하고 기존 항체가 중요하지 않은 이유를 설명할 수 있습니다. Gerke는 "홍역 항체가 초기에 모든 백신을 제거하지 않는 한 백신은 스스로 복제합니다"라고 말합니다.

홍역 백신 균주의 살아있는 특성은 면역 저하된 개인에게 제공할 수 없음을 의미합니다. 그러나 Swartz 균주는 약 50개의 돌연변이를 가지고 있으며 홍역 백신 균주는 이러한 약독화 족쇄를 결코 벗어나지 못하고 건강한 사람들에게 질병을 일으켰습니다. "유망한 후보입니다."라고 Krammer는 말합니다. 파스퇴르 연구소는 지원자들이 백신 접종을 시작했는지 여부를 확인할 수 없었습니다. 지난 6월 테미스는 백신 포트폴리오가 중요한 머크에 인수됐다.

바이러스 벡터의 성공은 백신 개발 전반에 영향을 미칩니다. Krammer는 "바이러스 벡터가 시장에 출시되기까지 매우 오랜 시간이 걸렸습니다. "내가 보기에 이것은 일반적으로 백신 개발을 가속화할 것입니다." 즉, 코로나19 백신으로 성공적인 결과가 있는 한 말이다. 이러한 백신 중 하나에 대한 규제 기관의 실수는 여러 질병에 대한 벡터 기반 백신의 잠재력을 지연시킬 수 있다고 Krammer는 말합니다.


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코멘트:

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