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컴피턴트 세포 준비 중 염화칼슘의 역할

컴피턴트 세포 준비 중 염화칼슘의 역할


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$CaCl_2$가 세포벽에 정착하여 테이코산과 결합을 형성하여 세포벽을 덜 음으로 만드는 것으로 알고 있습니다. 또한 양전하로 인해 DNA를 끌어당깁니다(DNA는 인산염 그룹으로 인해 음전하를 띠고 있음). 그러나 $CaCl_2$가 하는 다른 것이 있습니까? 또한 $CaCl_2$의 작업이라면 화학적으로 유능한 세포 준비를 만드는 표준 프로토콜에서 $MgCl_2$를 먼저 추가하는 이유는 무엇입니까?


$CaCl_2$의 작동 방식에 대한 결정적인 증거는 없지만 제안된 메커니즘은 귀하가 제안한 것과 매우 유사합니다. $CaCl_2$가 수용액에서 해리될 때 $Ca^{2+}$ 이온은 DNA의 인산염 그룹과 세포막의 지질다당류 내부 코어에 결합합니다(Dagert , 1979), 그것들을 중화시킨다. 그 후, 열 충격으로 이 DNA가 숙주로 흡수될 수 있습니다(열 충격이 어떻게 작용하는지 또한 알려져 있지 않습니다. 증가된 온도가 세포막에 구멍을 생성한다고 제안됩니다, 이 답변 참조). 시각적 표현은 다음 다이어그램을 참조하십시오(여기에서).

$MgCl_2$와 관련하여 $Mg^{2+}$의 역할도 완전히 이해되지 않았습니다. 그러나 $Mg^{2+}$는 세포 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다(Hanahan , 1983). $Mg^{2+}$가 리보솜의 기능에 필요한 중요한 요소이기 때문일 수 있습니다(Nierhaus , 2014). 여하튼 $Ca^{2+}$보다는 능력치를 높이는 역할이 적은 것 같습니다.

추신.: 실험 중 $Mn^{2+}$, $Rb^+$ 및 $K^+$도 $Ca^{2+}$(Hanahan , 1983).

참조:

  1. Dagert, M.; Ehrlich, S. (1979). "염화칼슘에서 장기간 배양하면 환자의 능력이 향상됩니다. 대장균 세포". 유전자. 6(1): 23-28. doi:10.1016/0378-1119(79)90082-9. PMID 383576

  2. Douglas Hanahan, 변환에 관한 연구 대장균 플라스미드 포함, 분자생물학 저널, 166권, 4호, 1983년, 페이지 557-580, ISSN 0022-2836, http://dx.doi.org/10.1016/S0022-2836(83)80284-8.

  3. 니어하우스 K.H. $Mg^{2+}$, $K^+$ 및 리보솜 J. Bacteriol. 2014년 196 3817-3819


유능한 세포 준비 중 염화칼슘의 역할 - 생물학

컴피턴트 세포 준비 및 고효율 플라스미드 형질전환을 위한 개선된 시스템 대장균 균주

투 지밍
중국-영국 HUST-Res Crop Genetics Engineering and Genomics Joint Laboratory
생명과학기술대학
화중과학기술대학교
중국 우한시 4300074
전화: 86 27 87556214
팩스: 86 27 87548885
이메일: [email protected]

허광위안*
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
생명과학기술대학
화중과학기술대학교
중국 우한시 4300074
전화: 86 27 87556214
팩스: 85 27 87548885
이메일: [email protected]

케시우 X. 리
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
생명과학기술대학
화중과학기술대학교
중국 우한시 4300074
전화: 86 27 87556214
팩스: 86 27 87548885

Mingjie J. 첸
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
생명과학기술대학
화중과학기술대학교
중국 우한시 4300074
전화: 86 27 87556214
팩스: 86 27 87548885

장준리
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
생명과학기술대학
화중과학기술대학교
중국 우한시 4300074
전화: 86 27 87556214
팩스: 86 2787548885

링 첸
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
생명과학기술대학
화중과학기술대학교
중국 우한시 4300074
전화: 86 27 87556214
팩스: 86 2787548885

칭야오
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
생명과학기술대학
화중과학기술대학교
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동핑 P. 리우
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
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환예
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
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화중과학기술대학교
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시젠타오
중국-영국 HUST-RRes 작물 유전 공학 및 유전체학 공동 연구실
생명과학기술대학
화중과학기술대학교
중국 우한시 4300074
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경제적 지원: 국가 첨단 기술 개발 계획("863" 계획).

키워드:
유능한 세포, 대장균, 플라스미드, 저장, 변환.

cfu: 식민지 형성 단위
TB: CaCl의 변환 버퍼2 해결책.

이 문서는 유능한 세포의 준비, 플라스미드 준비 및 우리 실험실의 박테리아 스톡에 저장하기 위해 확립된 효율적인 박테리아 형질전환 시스템에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여 여러 다른 플라스미드가 추가 실험을 위해 증폭되었습니다. 박테리아 형질전환을 위한 적격 세포는 75mM의 최적 농도로 염화칼슘 방법으로 제조하였다. 세 가지 다른 변종 대장균 테스트된 것은 DH5α, TG1 및 XL1 blue이며 가장 효율적인 균주는 XL1 blue입니다. 최적의 광학 밀도(OD600) 적격 세포 준비에 대한 범위는 조사된 각 균주에 대해 다양했으며 XL1 blue의 경우 TG1의 경우 0.15-0.45, 0.2-0.5, DH5α의 경우 0.145-0.45였습니다. 컴피턴트 세포의 보관 시간과 형질전환 효율과의 상관관계를 연구한 결과, -20℃에서 7일, -70℃에서 15일간 보관할 수 있는 것으로 나타났다. 정상적인 CaCl의 변경인 이전 방법에 대한 세 가지 중요한 변경이 이루어졌습니다.2 solution to TB solution, 배지를 LB에서 S.O.C.로 변경, DMSO 또는 PEG 첨가8000 플라스미드로 유능한 세포를 형질 전환하는 동안. 배지를 LB에서 S.O.C.로 변경하면 형질전환체의 성장이 훨씬 빨라지고 형질전환 효율이 증가했습니다. DMSO 또는 PEG 첨가8000 변환 효율을 100~300배 높였습니다. 당사의 개선된 세균 형질전환 시스템은 형질전환 효율을 약 10 3배 높일 수 있어 고효율 세균 형질전환 시스템이 됩니다.

플라스미드를 박테리아 유능한 세포로 변환하는 것은 분자 복제의 핵심 기술입니다. 1970년대 초 Cohen(Cohen et al. 1973)은 R-인자 및 재조합 플라스미드를 대장균 염화칼슘 방법을 사용하는 세포. 그 이후로 이 방법은 편리성으로 인해 널리 사용되었습니다. 사용되는 대체 형질전환 방법은 전기천공법으로 최대 10 9 - 10 10 형질전환체/μg DNA의 형질전환 효율을 높입니다(Ryu and Hartin, 1990). McCormac(McCormac et al. 1998)은 의 고도로 유능한 세포의 생산을 위한 간단한 방법을 발표했습니다. 아그로박테리움 tunrefaciers/리조비움 전기천공을 통한 변형을 위해. Okamoto(Okamoto et al. 1997)도 고효율 변환을 보고했습니다. 바실러스 브레비스 그러나 전기천공법에 의해 전기천공법을 위해서는 많은 실험실에서 제공할 수 없는 특수 장비가 필요합니다. Tsen은 특정 변종을 발견했습니다. 대장균 세포외 플라스미드를 낮은 빈도로 '자연적으로' 세포질에 통합할 수 있습니다(Tsen et al. 2002). Kurien과 Scofield는 박테리아 콜로니 형질전환의 빠르고 적당히 효율적인 방법을 설명했습니다(Kurien and Scofield, 1995). 보다 최근에 Chen은 유전자 변형을 위한 편리하고 신속한 대안을 제안했습니다. 대장균 플라스미드로. 수혜자 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하고 Ca 2+ 를 포함하는 선택적 배지 플레이트에 직접 퍼짐으로써 소위 '플레이트 변형'은 칼슘을 사용한 고전적 형질전환 방법과 거의 동일한 형질전환 효율을 달성할 수 있지만 전체 프로토콜은 약 2분(Chen et al 2001). 이 방법을 바탕으로 효율적인 시스템을 구축했습니다. 대장균 형질전환 플라스미드를 위한 유능한 세포. 그런 다음 플라스미드는 향후 실험을 위해 플라스미드를 증폭할 수 있는 우리의 중국-영국 공동 연구실에 박테리아 스톡으로 저장할 수 있습니다.

NS 대장균 DH5α 및 대장균 TG1은 우한 대학(중국) 출신 대장균 XL1 파란색은 Hubei University(중국)와 Rothamsted Research(영국)의 제품입니다.

우리 연구실에서 사용된 다음 플라스미드는 다양한 출처에서 얻어 우리 연구실에 보관되었습니다.

마커 유전자 플라스미드. pUC18, pDE4, pDE108, pDE 110, pCal-gus, pCal-neo, pAct1D-gus, pAHC 25, pRT99-gus, PRT99, pAHC20, pUGFP, pCX GFP.

HMW 글루테닌 플라스미드. p1Ax1, p1Dx5, p1Dy10, p1Dy12, pHMW-gus, pHMW-nos, pGAD2.

세균 증식용 배지

LB 매체. 10g/L Bacto-Tryptone, 5g/L Bacto-Yeast Extract, 5g/L NaCl, NaOH 오토클레이브를 사용하여 pH를 7.5로 조정하여 멸균합니다. 오토클레이브 배지를 55℃로 냉각시키고 암피실린(최종 농도 100μg/ml)을 첨가한다. LB 플레이트의 경우 오토클레이브 전에 1.5% Bacto-agar(15g/L)를 첨가했습니다.

S.O.C. 중간. 2% 트립톤(박토), 0.5% 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 포도당.

버퍼 및 추가 솔루션

결핵(CaCl2) 용액(Inoue et al. 1990). 10mM 파이프, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl. (파이프 3.021g/l, CaCl2.2H2O 2.205g/l, KCl 18.637g/l, MnCl2.4H2O 10.885g/l). MnCl을 제외한 모든 성분2 혼합하고 KOH를 사용하여 pH를 6.7로 조정하였다. 그런 다음 MnCl2 용해되고, 용액은 미리 세척된 0.45μm 필터 유닛을 통해 여과에 의해 멸균되고 4℃에서 보관되었고, 모든 염은 고체로 첨가되었고, 항상 보관되고 차갑게 사용되었다.

ALPHA Biotechnologies Company, LTD(SigmaD5879)에서 구입한 DMSO.

8000 Sino-American Company(중국 우한), PEG에서 구입8000 (40%) 용액을 -20ºC에 보관함.

유능한 세포의 준비

유능한 박테리아 세포의 형질전환에는 염화칼슘과 전기천공법의 두 가지 주요 방법이 있습니다(Dargert et al. 1979 Okamoto et al. 1997 Topcu, 2000). 우리는 염화칼슘 방법을 선택합니다.

염화칼슘법. 10μl 글리세롤 스톡 대장균 플라스미드를 함유하지 않은 균주를 실온에서 해동시키고 40 ml의 액체 S.O.C.에 첨가하였다. 미디어. 이 배양물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, OD가 될 때까지 200rpm에서 2-3시간 동안 진탕하면서 37℃에서 인큐베이터-진탕기로 옮겼다.600 0.2-0.4에 도달했습니다. 최적의 외경600 다른 박테리아 균주에 대해 다양했습니다. 초기 로그 단계를 결정하는 것이 중요합니다. 세포를 4℃에서 1분 동안 8000rpm에서 원심분리하여 펠렛화한 다음, 멸균 냉결핵(CaCl)의 1/2 부피(20ml)에 재현탁시켰다.2) 용액을 넣고 25분 동안 얼음에서 배양합니다. 위와 같은 또 다른 원심분리 단계 후, 생성된 세포 펠렛을 멸균된 저온 TB(CaCl)의 1/10 부피(4 ml)에 재현탁시켰다.2) 최종 적격 세포 현탁액을 산출하는 용액. Competent cell은 4ºC에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다.

글리세롤 스톡으로 저장하기 위한 유능한 세포의 준비. 적격 세포 현탁액 1.6ml를 멸균된 저온 저장 튜브에 옮기고 멸균된 100% 글리세롤 0.4ml를 추가하여 최종 농도가 20% 글리세롤이 되도록 한 다음 함께 혼합합니다. 글리세롤 재고는 나중에 사용하기 위해 -4ºC, -20ºC 및 -70ºC에 별도로 배치됩니다.

박테리아 변형

플라스미드 형질전환과 항생제 선택. 박테리아 세포의 염화칼슘 처리는 열 충격 단계 후에 DNA를 흡수할 유능한 세포를 생성합니다. DNA 분자, 즉. 이 방법으로 도입된 플라스미드는 박테리아 숙주 세포에서 복제됩니다. 박테리아 세포의 회복을 돕기 위해 열 충격 처리 후 세포를 비선택적 성장 배지와 함께 잠시 배양합니다. 그러나 플라스미드로 형질전환된 박테리아 세포의 비율이 낮고 플라스미드가 모든 딸 세포에서 증식하지 않을 가능성이 있기 때문에 플라스미드를 포함하는 박테리아 세포를 선택해야 합니다. 이것은 일반적으로 항생제 선택을 사용하여 수행됩니다.

대장균 XL과 같은 균주1 파란색, DH5α 및 TG1 암피실린과 같은 일반적인 항생제에 민감합니다. 따라서 DNA의 복제 및 조작에 사용되는 플라스미드는 예를 들어 암피실린에 대한 항생제 내성 유전자를 보유하도록 조작되었습니다. 따라서 형질전환 절차에 따라 박테리아를 암피실린이 포함된 배지에 플레이팅하면 플라스미드 DNA를 소유한 박테리아만이 암피실린을 대사하고 집락을 형성하는 능력을 갖게 됩니다. 이러한 방식으로 플라스미드 DNA를 포함하는 박테리아 세포를 선택할 수 있습니다.

우리 연구실의 세균 형질전환 프로토콜

  1. 고체 S.O.C.의 예열 플레이트 그리고 S.O.C. 37℃에서 1시간 동안 암피실린(최종 농도 100μg/ml).
  2. 100μl 컴피턴트 세포를 취하고 1μg/μl 플라스미드 DNA 0.5μl을 추가합니다.
  3. DMSO 또는 PEG 추가8000 (40%) 1 μl.
  4. 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
  5. 90초 동안 42ºC에서 열 충격. (더 빠른 변환 방법을 위해 이 단계를 무시하거나 생략할 수 있습니다.)
  6. 2분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
  7. 400 μl 액체 S.O.C.를 추가합니다. 중간.
  8. 인큐베이션 쉐이커에서 45분 동안 37ºC에서 인큐베이션합니다.
  9. 혼합물의 절반(50 μl)을 암피실린이 포함된 예열된 플레이트에 펼치고 나머지 절반을 암피실린이 포함되지 않은 대조군 플레이트에 펼치십시오.
  10. S.O.C.를 위해 밤새 37ºC에서 플레이트를 배양합니다. 중간(12-16시간).

성장의 초기 로그 단계에서 세포를 사용하는 것은 유능한 세포를 준비하는 데 중요한 요소입니다. 성장 곡선을 연구하여 최적의 OD600 범위를 결정할 수 있습니다. 세 가지 다른 성장 곡선 대장균 균주는 그림 1에 나와 있습니다. 우리의 실험은 최적의 광학 밀도(OD600) 적격 세포 준비에 대한 범위는 조사된 각 균주에 대해 다양했으며(그림 2), XL1 blue의 경우 TG1의 경우 0.15-0.45, 0.2-0.5, DH5α의 경우 0.145-0.45였습니다. 또 다른 중요한 요소는 CaCl의 농도입니다.2. 50-100mM 염화칼슘을 사용할 수 있지만 75mM CaCl2 in TB 용액이 최적 농도인 것으로 밝혀졌다.

변환 효율 계산(콜로니 형성 단위 [cfu])

형질전환 효율은 1μg의 플라스미드 DNA가 생산하는 cfu의 수로 정의되며, 알고 있는 양의 DNA를 사용하여 대조 형질전환 반응을 수행한 후 DNA microgram당 생성되는 cfu의 수를 계산하여 측정합니다.

변환 효율 방정식(cfu/µg)

형질전환체 cfu = 세균 콜로니 수 및 희석비 및 원래 형질전환 부피/도금 부피

예: 플레이트에서 21개의 콜로니가 관찰되는 경우, 플레이팅 전에 형질전환된 컴피턴트 세포를 10000배로 희석하고 원래 형질전환 부피는 100μl, 50μl를 사용하여 플레이팅한 경우, 형질전환체 cfu는 다음과 같습니다.

21 & 곱하기 10000 & 곱하기 100/50 = 4.2 & 곱하기 10 5

형질전환 효율 = 형질전환체 cfu/플라스미드 DNA(µg).

플라스미드 DNA를 0.5μl(1μg/μl) 첨가하면 형질전환 효율 = 4.2 × 10 5 /0.5 = 8.4 × 10 5 cfu/µg가 된다.

다양한 박테리아 균주에 대한 마이크로그램 플라스미드 DNA당 형질전환 효율은 표 1에 나와 있습니다. 이는 6회 반복의 평균 데이터이며, 가장 효율적인 균주는 XL1 blue임을 보여줍니다. 우리의 개선된 방법은 일반적인 방법(Sambrook et al. 1989)보다 형질전환 효율을 약 1000배 증가시킬 수 있지만 Quick 방법(Chen et al. 2001)은 형질전환 효율을 일반 방법(Sambrook et al. 1989)보다 약 60-150배 낮춥니다. ).

다른 박테리아 균주에 다른 방법을 사용하여 다른 플라스미드의 형질전환 효율은 그림 3에 나와 있습니다. 우리는 pUC18을 사용하여 시스템을 설정하고 pUGFP, pAHC25, p1Ax1, p1Dx5, p1Dy10을 사용하여 시스템을 테스트한 다음 평균 형질전환을 계산했습니다. 그 다음 이 개선된 방법을 사용하여 pDE 110, pRT99, pAHC20, pABPIgus, pRT101, pRTL2, pCX GFP, p1Dy12, pJD2, pHMW-gus, pHMW-nos, pGAD2, pGAD12 등은 우리의 개선된 방법이 일반 방법(Sambrook et al. 1989)보다 훨씬 더 형질전환 효율을 증가시킬 수 있지만 Quick 방법(Chen et al. 2001)은 일반 방법(Sambrook et al. 1989).

형질전환 효율에 대한 상이한 온도에서의 컴피턴트 세포 저장 시간의 영향

형질전환 효율에 대한 상이한 온도에서의 컴피턴트 세포 저장 시간의 효과가 연구되었다. pAHC25 plasmid를 사용하여 -4ºC, -20ºC, -70ºC에 각각 1시간, 1박, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 10일 동안 보관한 XL1 blue Competent cell을 형질전환합니다. , 15일 및 20일. 일반 변환 방법을 사용했습니다. 최종 결과는 그림 4에 나와 있습니다. -20°C에서 컴피턴트 세포 보관 시간이 형질전환 효율에 미치는 영향은 XL1 blue 컴피턴트 세포를 -20°C에서 보관하고 형질전환 효율의 명백한 감소 없이 1시간에서 7일 동안 사용할 수 있음을 보여줍니다. 반대로 형질전환 효율은 3일에서 7일로 증가하다가 점차 감소하였다. 그림 4는 다른 온도에서 Competent cell 보관 시간이 형질전환 효율에 미치는 영향을 보여주고 있으며, 이는 Competent cell이 -20°C에서 7일 동안, -70°C에서 15일 동안 보관할 수 있음을 보여줍니다.

변환 효율은 분자 복제 실험에서 매우 중요하며 많은 요인의 영향을 받을 수 있습니다. Takahashi는 플라스미드 형질전환의 간단한 방법을 보고했습니다. 대장균 급속 동결에 의해 (Takahashi et al. 1992). 가장 중요한 것은 박테리아 세포가 초기 대수 성장 기간에 있어야 한다는 것인데, Ryu와 다른 저자들은 형질전환을 위한 초기 대수 단계의 중요성을 지적했습니다(Ryu and Hartin, 1990). DNA를 흡수할 수 있는 박테리아를 "컴피턴트(competent)"라고 하며, 성장 초기 로그 단계에서 칼슘 클로라이드로 처리하여 능력을 유도할 수 있습니다. 박테리아 세포막은 염화물 이온은 투과하지만 칼슘 이온은 투과하지 않습니다. 염화물 이온이 세포에 들어갈 때 물 분자는 하전 입자를 동반합니다. 이러한 물의 유입은 세포를 부풀게 하고 DNA 흡수에 필요하며 이 흡수의 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 우리의 실험은 다양한 균주가 대장균 와 같이 다른 성장 특성을 가지고 있습니다. 대장균: XL1 파란색, TG1 및 DH5α, 따라서 최적의 OD600 적격 세포의 준비에 사용되는 범위는 다양합니다. XL1 blue의 경우 TG1 0.2-0.5 및 DH5α 0.145-0.45의 경우 0.15-0.45입니다. 이러한 최적 OD 외부의 과증식 또는 과소증식 세균 배양에서 준비된 적격 세포600 범위는 감소되거나 변형 능력이 없을 것입니다. 우리 연구실에서는 XL1 blue가 가장 높은 형질전환 효율을 나타내는 것으로 밝혀져 더 일반적으로 사용됩니다. 유능한 세포의 준비를 위한 박테리아는 일상적으로 OD로 배양됩니다.600 = 0.2-0.4.

형질전환 효율에 영향을 미칠 수 있는 두 번째 요소는 보관 및 사용 중에 적격 세포를 저온 환경에서 유지해야 한다는 것입니다. Dargert(Dargert and Ehrlich, 1979)는 적격 세포가 24-48시간 동안 염화칼슘에서 4℃에서 보관될 수 있다고 보고했습니다. 전성기 12~24시간에는 변환 효율이 3~5배 상승한 후 평균 수준으로 감소합니다. 우리의 실험은 유능한 세포가 형질 전환 능력을 분명히 감소시키지 않고 15일 동안 -70ºC에서 저장할 수 있음을 보여줍니다. 그러나, Competent cell을 -20ºC에 보관하면 2-7일에 가장 높은 형질전환 효율이 나타납니다. 그러나 보관 기간이 7일을 초과하면 변환 효율성이 크게 떨어집니다. 컴피턴트 세포를 4ºC에 보관하면 3일 만에 능력을 잃습니다. 적격 세포는 액체 N에서 장기간 보관할 수 없습니다.2 한 번 이상 해동할 수 없습니다.

또 다른 중요한 요소는 CaCl의 농도입니다.2. 50-100mM 염화칼슘을 사용할 수 있지만 75mM CaCl2 in TB 용액이 최적의 농도인 것으로 밝혀졌다. Brian과 Heler(Brian and Heler, 1996)는 TFB를 전통적인 CaCl의 대체물로 처음 사용했습니다.2 해결책. 변환 효율을 100배 이상 높인 TB 솔루션을 사용했습니다. 전통적인 CaCl 사용2 37ºC에서 방법, 아니. 형질전환체/μg 플라스미드 DNA는 1× 10 5였습니다.

10× 10 5 . 동일한 조건에서 TB를 사용하면 결과가 없습니다. 형질전환체/μg 1× 10 7의 플라스미드 DNA

DMSO 또는 PEG 첨가8000 박테리아 형질전환 동안 또한 형질전환 효율에 영향을 미칠 수 있다. Hanahan(Hanahan et al. 1991)은 DMSO의 첨가가 형질전환 효율을 크게 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 유사하게, 폴리에틸렌 글리콜/염화칼슘(PEG/CaCl) 용액에서 적격 세포 및 플라스미드 DNA의 배양2) 짧은 배양과 열 충격이 뒤따르면 DNA가 효율적으로 흡수됩니다(Kurien and Scofield, 1995). 우리의 실험은 DMSO 또는 PEG의 추가가8000 변형 과정 동안 Cohen의 방법보다 100-300배 더 높은 변형 효율을 제공할 수 있습니다.

박테리아 배양 배지는 또한 형질전환 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. Jessee(Fierro, 2004 Maeda et al. 2004)는 S.O.C. 유능한 세포의 준비를 위한 박테리아의 성장을 위한 배지. S.O.C. S.O.C.에서 형질전환체를 더 빨리 관찰할 수 있을 뿐만 아니라 박테리아의 더 빠른 성장을 초래하는 LB 배지보다 더 풍부한 배지입니다. LB 배지에서 24시간 후와 달리 12시간 후 배지에서 형질전환 효율이 훨씬 더 높습니다. S.O.C. LB보다 10~30배 높은 효율을 제공합니다.

열충격 단계가 DNA 흡수에 중요한지 여부에 대해 약간의 논쟁이 있지만 가열 단계가 뒤따르면 염화칼슘 처리의 효과가 향상될 수 있는 것으로 알려져 있습니다(Chen et al. 2001 Kimoto and Taketo, 2003). . 언제 대장균 42°C의 온도에 노출되면 열 충격 유전자라는 유전자 세트가 발현되어 박테리아가 그러한 온도에서 생존할 수 있습니다. 그러나 42ºC 이상의 온도에서는 박테리아가 DNA를 흡수하는 능력이 감소하고 더 ​​극단적인 온도에서는 박테리아가 죽습니다. 필수는 아니지만 열 충격은 변형 효율을 높일 수 있습니다. Van der Rest(Van der Rest et al. 1999)는 전기천공 후 열 충격을 사용하여 야생형의 고효율 변형을 유도한다고 설명했습니다. 코리네박테리움 글루타미쿰 이종 플라스미드 DNA로. Chen(Chen et al. 2001)은 유전자 변형을 위한 편리하고 신속한 방법을 제안했지만 대장균 플라스미드의 경우 열 충격 단계가 생략되어 결과 변환 효율이 약 100배 낮습니다.

저자는 유익한 토론을 해준 Rothamsted Research(UK)의 Peter Shewry 교수와 원고를 비판적으로 읽고 수정한 Rothamsted Research(UK)의 Caroline Sparks 교수에게 감사드립니다. 이 작업을 지원해 주신 가족, 동료 및 학생들에게 감사드립니다.

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참고: Electronic Journal of Biotechnology는 출판일 이후에 원고에 인용된 온라인 참고 문헌이 더 이상 제공되지 않는 경우 책임을 지지 않습니다.

/> 변경 사항에 대한 변경 사항


유능한 세포를 만드는 염화마그네슘의 기능은 무엇입니까?

E. coli는 자연적으로 형질전환이 되지 않기 때문에 2가 및 다가 양이온(칼슘, 마그네슘, 망간, 루비듐, 헥사민코발트)을 사용하는 화학적 방법으로 DNA를 흡수하는 능력이나 능력을 유도해야 합니다. 막 투과성의 변화는 DNA가 외막, 내막 및 세포벽으로 구성된 대장균의 세포 외피를 통과하도록 합니다. E. coli의 외막은 유체모자이크모형을 막에 적용하여 이해할 수 있으며 인지질, 단백질, 지질다당류로 구성되어 있다. 세포벽층을 통한 외막과 내막의 융합에 의해 많은 유착 채널 또는 영역이 형성됩니다. 변형 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 이전 연구에서는 이러한 채널이 세포막을 가로질러 DNA 분자의 수송을 허용함을 나타냅니다. 그러나 들어오는 DNA의 음전하는 박테리아의 외부 표면에 있는 거대분자의 음으로 대전된 부분에 의해 반발됩니다. CaCl2의 첨가는 DNA와 외부층의 다중음이온 사이의 불리한 상호작용을 중화시키는 역할을 한다. DNA와 컴피턴트 세포는 지질막을 안정화하고 칼슘 이온과 세포의 음성 성분 사이의 상호작용을 증가시키기 위해 얼음 위에서 30분 동안 추가로 배양됩니다. 그런 다음 반응 혼합물을 42oC에서 짧은 시간 동안 열 충격에 노출시킵니다. 온도의 변화는 0oC에서 달성된 반결정질 막 상태의 유동성을 변경하여 DNA 분자가 접착 영역을 통해 세포에 들어갈 수 있도록 합니다.

이전 연구에 따르면 일부 E. coli 균주는 리포다당류의 구성 차이로 인해 다른 균주보다 형질전환에 더 취약합니다. 긴 O-연결된 다당류를 가진 E. coli는 DNA가 세포에 들어가는 것을 차단하거나 방해합니다. 매체에 마그네슘을 첨가하면 표면에 있는 분자의 이온 상호작용을 향상시켜 변형 수율을 증가시키고 따라서 보다 효율적인 변형을 위해 막의 유연성을 변경합니다.


유능한 세포 준비 중 염화칼슘의 역할 - 생물학

유능한 세포의 준비

몇 가지 매우 효율적인 준비 방법 대장균 형질전환을 위한 적격 세포가 기술되어 있다(예를 들어 Hanahan의 방법과 Inoue의 방법). 그들은 일반적으로 일상적인 변환에서 좋은 결과를 제공합니다. 그러나 프로토콜이 다양한 대장균 유전자 연구에 사용되는 균주에 비해 상당수의 균주는 형질전환체를 거의 제공하지 않는 경향이 있습니다. 아마도 이러한 프로토콜이 특정 대장균 형질전환에 적합한 균주, 이자형. NS. DH1, DH5, JM109 및 그 파생물. 아래에 설명된 염화칼슘 방법은 일반적으로 모든 대장균 변형 효율은 최적의 변형에 적용된 초효율 방법보다 상대적으로 낮지만 변형 효율은 상대적으로 낮습니다.

1. 3ml의 LB에 E. coli를 37 ºC에서 밤새 흔듭니다.

2. 200ml 플라스크에 50ml의 LB에 0.5ml의 밤새 배양액을 추가합니다. 국물은 37 ºC로 예열해야 합니다. 37 ºC에서 배양액을 흔든다.

3. OD 600을 모니터링합니다. OD 600이 0.35-0.4에 도달하면 배양액을 얼음 위에 식힙니다. 최고의 형질전환 효율이 필요하지 않은 경우 OD 600을 모니터링하지 않고 접종 후 100-120분 후에 세포를 수확하기만 하면 됩니다.

4. 배양액을 멸균된 원심분리 튜브에 옮기고 4 ℃에서 6,000 rpm으로 8분간 원심분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는을 폐기합니다.

5. 20ml의 얼음처럼 차가운 50mM CaCl 2 에 세포를 재현탁합니다. 20분 동안 얼음에 resupended 세포를 품어. 4단계에서와 같이 원심분리하여 세포를 수집합니다.

6. 세포를 2.5ml의 얼음처럼 차가운 50mM CaCl 2 에 재현탁하거나, 컴피턴트 세포를 냉동 스톡으로 장기간 보관하는 경우 10% 글리세롤을 포함하는 얼음처럼 차가운 50mM CaCl 2 2.5ml에 세포를 재현탁합니다. .

7. 형질전환을 위해 100-200 마이크로리터의 컴피턴트 세포를 사용하거나 컴피턴트 세포를 100-200 마이크로리터의 분취량으로 분배하고 나중에 사용하기 위해 액체 질소에서 동결합니다.

이 방법은 쉽게 확장 및 축소할 수 있습니다. 변신하고 싶을 때 대장균 신속하게 균주를 변형시킨 후 LB 3ml에 하룻밤 배양액 0.05ml를 접종하고 37℃에서 100-120분 동안 흔든 후 얼음처럼 차가운 칼슘 용액으로 세포를 세척한다. 100-150 마이크로리터의 칼슘 용액에 재현탁된 세포를 형질전환에 사용합니다.

1. 유능한 세포가 냉동 보관된 경우 얼음 위에서 해동합니다. 100 마이크로리터의 적격 세포에 적절한 양의 TE에 있는 플라스미드 용액을 추가합니다. 플라스미드 용액은 5마이크로리터 미만이어야 합니다.

2. 세포를 30분 동안 얼음 위에 두십시오.

3. Quickly transfer the tube to 42 C water bath. Incubate for 1 minute, then transfer onto ice.

4. Add 1 ml of LB. Incubate at 37 C for 30 minutes. Spread the cells on agar plate(s) containing appropriate antibiotics.


OPINION article

Azka Asif 1 , Hareem Mohsin 1 , Rabia Tanvir 2 and Yasir Rehman 1 *
  • 1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of the Punjab, Lahore, Pakistan
  • 2 University Diagnostic Lab, Department of Microbiology, University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore, Pakistan

Bacterial transformation is a crucial part of cloning process and has been widely used in many studies (Swords, 2003 Gigova et al., 2006). The mechanism is marked by two phases, the first phase involves the uptake of the DNA across the cellular envelope and the second phase involves the setting up of the DNA in the cell as a stable genetic material (Hanahan, 1983). The procedure of transformation is of physicochemical nature rather than strictly being a chemical or a physical procedure, since the cells are manipulated with cations (or a combination of cations) and temperature imbalances to render them competent to uptake foreign DNA. It is a common understanding that the chemical manipulation is linked to the induction of competency while the physical manipulation is linked to the uptake of foreign DNA. The two methods act together to bring about the act of 𠇊rtificial DNA internalization.”

Over time various methods have been used to make cells competent such as by using dimethyl sulfoxide (DMSO), divalent cations, or polyehtylene glycol (PEG) (Klebe et al., 1983 Chan et al., 2013). Other than these chemical methods, electroporation has also been tested and used to induce competency (Dower et al., 1988 Yoshida and Sato, 2009 Liu et al., 2013). The use of divalent cations has been the most effective chemical treatment to bring about transformation (Day, 2004). Among various cations, divalent calcium cation (Ca 2+ ) has proven to be the most effective one (Weston et al., 1981) both alone (Dagert and Ehrlich, 1979) and in various combinations. A combination of divalent and monovalent ions, such as calcium and magnesium (Taketo, 1974 Wensink et al., 1974), calcium and manganese (Enea et al., 1975), calcium, rubidium, and dimethyl sulfoxide (Kushner, 1978) and other alkali metals with a prolonged incubation at 0ଌ (Taketo, 1972 Dagert and Ehrlich, 1979) has also been reported to be effective (Roychoudhury et al., 2009). Generally, all divalent cations enhance the transformation process. Hanahan (1983) found that the presence of magnesium in bacterial culture media increases the transformation efficiency by 15- to 20-folds as compared to the cells grown in the absence of magnesium. He also observed that the addition of magnesium in the media 30 min before the time of collection of cells also enhances the transformation up to 繠%. However, addition of magnesium as the cells are harvested and incubated on ice enhances transformation up to 繀%. The addition of calcium or manganese ions has also shown almost the same stimulatory effect as that of the magnesium ions (Hanahan, 1983). However, incubation time with calcium chloride or any other divalent cation for that matter, should be optimized. It was observed that a period of 24 h incubation in cold calcium chloride makes the bacterial cells 20� times more competent and 4𠄶 times more efficient for transformation as compared to the cells that are obtained immediately after CaCl2 treatment (Blattner et al., 1977 Dagert and Ehrlich, 1979). Curtiss et al. (1977) experimented on 대장균 strain X1776 and observed the effect of various set of conditions on the efficiency of transformation. He treated the bacterial culture with a combination of manganese, calcium, rubidium, and potassium ions along with DMSO and sucrose at 0ଌ followed by a heat pulse at 42ଌ. However, these conditions did not give successful results when other strains of 대장균 were used (Hanahan, 1983). Meselson and Yuan (1968) found these conditions promising for successful transformation in case of a strain of 대장균 MM294 than the standard �lcium chloride” protocol. Bolivar et al. (1977) reported 10 6 transformants when the cells were treated with calcium alone while Kushner (1978) reported to obtain 10 7 transformants after treating the cells with rubidium along with calcium chloride. Norgard et al. (1978) was also able to obtain 10 7 transformants with the method followed by Kushner (1978) in case of K-12 strain X1776 of 대장균. However, transformants yield varied from specie to specie and strain to strain (Mercer and Loutit, 1979). It was reported by Sjöström et al. (1972) that the optimum concentration of calcium chloride for the uptake of DNA by 에스. 아우레우스 is 0.1 M CaCl2. The repulsion between foreign DNA and the bacterial cell, owing to negative charges on them both, are overcome by these divalent cations. This is applicable for linear DNA fragments as well as circular DNA molecules such as plasmids (Mandel and Higa, 1970 Tsen et al., 2002). It is thought that the divalent cations bind both to the cell and the DNA, thus neutralizing the charge altogether. The calcium bound to the DNA further helps the DNA to adsorb to the competent cell (Panja et al., 2008b). Moreover, DNA binding proteins present in the cell membrane could also aid in this interaction. The anchorage of the DNA to the membrane eliminates the risk of detachment or expulsion of DNA (Clark et al., 2002). Further, the low temperatures used in transformation protocols congeals the lipid moiety and consequently restricts the fluidity of the cell membrane which strengthens calcium-cell surface interaction. In this way calcium ions, bound with cell surface as well as the foreign DNA, brings the DNA to the cell. Clark et al. (2002) showed that the relative association of divalent cations (e.g., Ca 2+ ) is more with the cell membrane as compared to its association with foreign DNA, whereas certain trivalent cations (e.g., spermidine) interact more readily with the DNA (Li et al., 2004). It was also reported in this study that Ca 2+ has more pronounced role to play in development of competency as compared to spermidine or trivalent cations (Clark et al., 2002). Membranes absorb calcium very readily and once inside the cell the calcium ions are neutralized by membrane phosphates present on the cytosolic side (Melcrová et al., 2016). The binding of calcium ions to the membrane also cause changes in the membrane permeability (Li et al., 2004).

Treatment with divalents or trivalents on ice is followed by treatment with elevated temperature as a heat-shock, which produces a temperature imbalance. Molecules with increased Brownian motion outside the cell are likely to push the DNA molecule inside the cell. However, it is unclear if this kinetic force is sufficient enough to push the adsorbed DNA molecules inside. Panja et al. (2008a) studied the efficacy of cooling and heating cycles by increasing the number of cycles until maximum transformation efficiency was achieved. It was inferred that lowering of temperature actually contributes to protein loss, while heating contributes to lipid loss, and thus together these cycles increase transformation efficiency (Panja et al., 2008a) as it enlarges the pore size on the cell surface. Moreover, due to loss of lipids and proteins, the membrane is depolarized, further reducing the repulsion between the DNA molecule and the membrane. Moreover, cell density can also affect the efficiency of transformation and it has been reported that maximum competency is observed at cell density ranging from 10 7 to 10 8 cells ml in the log phase (Taketo, 1974 Norgard et al., 1978).

However, the question remains whether the pores (through which foreign DNA enters a cell) are formed by the calcium treatment or are they naturally present. There exist natural channels, often called Bayer's bridges, in the membrane that can serve as potential pathway for DNA uptake (Dreiseikelmann, 1994 Sperandeo et al., 2007 Srivastava, 2013). Hanahan (1983) stated that the competent cells have many sites or channels and all these sites and channels have an independent chance of taking part in the uptake of DNA moving toward the process of transformation. All the cells, whether competent or not, compete for the uptake of plasmid but if only competent cells are used for the transformation, the efficiency will be increased up to 50-folds as discussed by Hanahan (1983). The DNA uptake factor is the sum of all the probabilities of DNA uptake through each channel. It was reported that the chances of transformation are not increased by increasing the concentration of DNA but by the increase in the number of channels through which the uptake of DNA takes place (Hanahan, 1983 Nikaido and Vaara, 1985). Moreover, calcium has a dual role in this process it not only neutralizes the charge but also weakens the cell membrane to produce invaginations (Stein, 1990 Thomas and Rice, 2014).

While it was known that the divalent cations help neutralize the charge, the complex ions can also serve to produce static force of attraction within the DNA molecule. This leads to the folding of DNA into a compact ball-like structure that facilitates its entry into the cell (Clark et al., 2002). A supercoiled ball like structure of the plasmid will have more chances of entering the competent cell for transformation than the extended open circular form of the plasmid. However, if the size of the DNA approaches the size of the pore, the probability of the transformation decreases sharply. When using spermidine or other trivalents, the size of the ball-like structure of DNA might exceed the size of pores in the cell membrane, which can be only solved by altering the physical parameters used in the protocol, primarily the heating and cooling cycles. Whether using divalents or trivalents, their concentrations need to be optimized such that all the phosphates of the DNA are not rendered inaccessible, because some parts of the DNA have to adsorb onto the cell surface and for that free phosphates are required, as inferred by Panja et al. (2008b).

The transformation efficiency is greatly affected by the type of the host cell, as they have different cell surface structures, especially in relation to O-polysaccharides that protrude from the surface of the cell. These surface structures interact with the divalent cations and the DNA, thus making the cell competent for transformation. 다른 계통 대장균, as discussed above, have been reported to show variance in transformation efficiency, owing to the differences in chemical properties of their cellular envelope (Taketo, 1972). A very dense O-polysaccharide will become a deterrent for the DNA to pass through. However, it has also been claimed that extensive removal of LPS by excessive ethanol-pretreatment reduces transformation efficiency (Roychoudhury et al., 2009). This can be explained by the aforementioned hypothesis that the DNA first attaches to some external component of the cell membrane, which then assists its movement inside the cell. Along with the density, the composition of the O-polysaccahride also plays a role in the reception of the incoming DNA molecule (Lacks, 1977). Moreover, calcium ions also interacts with the membrane and at 100 mM CaCl2 concentration, almost all calcium is absorbed by the cell membrane's phosphatidylcholine and phosphatidylserine (Melcrová et al., 2016). Therefore, the membrane properties play a major role in DNA adsorption.

The evidences clearly indicate that the physical and chemical treatments used during transformation, i.e., the temperature imbalances and CaCl2 treatment, help deal with the barriers to DNA uptake, such as charge repulsions and pore sizes (Figure 1). Magnesium and calcium combinations are seldom used in transformation protocols, the importance of which should be considered. A combination of divalent and trivalent cations with prolonged incubation times can be suggested to improve the transformation efficiency as in addition to the charge stabilization, trivalent cations can compact DNA, further aiding its internalization. Bacterial cells could also be grown in presence of CaCl2 and MgCl2 before inducing competency. Heating and cooling cycles used just once in transformation protocols could also be increased to three times for higher transformation efficiencies. These conditions need to be adjusted and optimized for different bacterial species and strains, owing to the differences in their surface properties. However, there is a need for concrete evidences based on experiments designed exclusively to elaborate this phenomenon.

그림 1. shows the barriers /limitations in uptake of DNA by a bacterial cell, which are the repulsion caused by negative charges on the cell membrane and DNA and the porosity of the membrane. These are manipulated by chemical treatment, such as calcium ions which neutralize negative charges. Physical parameters can be applied to improve porosity and permeability.


Transformation of Escherichia coli Made Competent by Calcium Chloride Protocol

The protocol described here represents a standard protocol. However, other protocols can be used that will increase transformation efficiency.

LB broth (Lysogeny broth, also called Luria-Bertani broth)

Adjust pH to 7.5 with NaOH and autoclave for 20 minutes.

LB plates, add 15 g of agar to LB broth before autoclaving.

For LB plates with antibiotic, add the appropriate amount of the selective antibiotic to sterile LB-agar media that has been precooled to 48 o C (see molecular biology textbook (1, 14) for stock and working concentration of a specific antibiotic).

SOC (Super Optimal Catabolite repression) 중간

1. Add the following to 900 ml of distilled H2영형

  • 20 g of Bacto tryptone
  • 5 g of Bacto yeast extract
  • 2 ml of 5M NaCl
  • 2.5 ml of 1M KCl
  • 10 ml of 1M MgCl2
  • 10 ml of 1M MgSO4
  • 20 ml of 1M glucose

2. Adjust to 1 liter with distilled H2영형.

3. Sterilize by autoclaving.

Chemicals and biological supplies required:

LB plates containing selective antibiotic

Filter-sterilized antibiotic solution (see molecular biology textbook (1, 14) for stock and working concentration of a specific antibiotic)

대장균 K12 derivatives (TB1, JM109) or other commercially available strains (Carolina Biological, New England Biolab, Fisher Scientific, etc.)

Plasmid vector or other DNA (pUC 19, pBR322, pBLU, other cloning vectors) (Carolina Biological Supply Company, Bio-Rad Laboratories, New
England Biolabs)

1x Tris-EDTA (TE) buffer pH 8.0 (10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA pH 8.0)

Sterile 60 mM cold CaCl2 solution (60 mM CaCl2, 15% glycerol, 10 mM piperazine-N,N’-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid) (PIPES), pH 7)

Styrofoam bucket with crushed ice

Equipment required:

  • 37°C incubator
  • Water bath shaker set at 37°C
  • 42°C water bath (using a thermometer ensure the temperature is exactly 42°C for the 2 minutes of heat shock)
  • Centrifuge
  • Roller drum in a 37°C incubator

1. Inoculate 5 ml of LB media with 대장균 and grow overnight at 37 o C in a roller drum.

2. Inoculate 1 ml of overnight culture into a sterile Erlenmeyer flask containing 100 ml of LB broth.

3. Shake culture in a 37 o C water bath until cell density reaches mid-log growth phase (about 5 x 10 7 cells/ml). This should take 2 to 4 hours. The growth rate of the culture is determined by removing a 1-ml aliquot at various times and reading the optical density at 550 nm wavelength using a spectrophotometer. The relationship between optical density and cell number will vary depending on the bacterial strain. For a strain such as MM294 (rec + ), 1 OD550 = 0.2 (5 x 10 7 cells/ml) for a strain such as HB101 (rec-), 1 OD550 = 0.5 (5 x 10 7 cells/ml).

4 .Chill the culture on ice for 10 minutes.

5. Spin the cell suspension at 4,000 g in a centrifuge for 5 minutes at 4 o C.

6. Discard the supernatant.

7. Resuspend the cells in half the volume (50 ml) of the original culture with ice-cold sterile 60 mM CaCl2.

8. Place the cell suspension in an ice bath for 30 minutes.

9. Centrifuge the suspension at 4,000 g for 5 minutes at 4 o C.

10. Discard the supernatant.

11. Gently resuspend the cells in 5 ml of sterile ice-cold CaCl2 using precooled pipettes. Cells will remain competent for up to 24 hours at 4 o C. Transformation efficiency increases four- to six-fold during this time. For long-term storage, dispense 250-ml aliquots into prechilled, sterile microfuge tubes and store at -70 o C until needed. Depending on the strain used, some 대장균cells will remain competent to take up DNA for as long as 6 months. A competency test (see below) should be performed each time an aliquot is removed from storage and used for transformation. The most recent number of transformants is then compared to the number obtained during the initial preparation.

12. Add 10 to 40 ng (10 to 25 ml volume) of DNA to 250 ml of competent cells in step 11. Concentrated stock DNA can be diluted using sterile 1x TE buffer. A higher volume or concentration of DNA will cause a decrease in transformation efficiency.

Besides the DNA tube, additional tubes should be set up as listed below:

(A) A control tube in which DNA is not added to the 250 ml of competent cells. The DNA volume should be substituted by an equal volume of sterile 1x TE buffer. The control tube will be treated the same as the DNA tube for the remainder of the experiment.

(B) If competent cells have been stored at -70 o C, a test should be performed to ensure that the cells still remain competent to take up DNA. The thawed cells are incubated with 10 ng of a control plasmid such as pBR322. The number of transformants per microgram of DNA will be calculated and should typically yield from 10 6 to 10 8 colonies/mg DNA for 대장균 MC1061 and DH1 cells.

14. Transfer the reaction to a 42 o C water bath for exactly 2 minutes.

15. Incubate on ice for 5 minutes.

16. Add 1.0 ml of SOC medium to each tube and incubate at 37 o C for 1 hour in a roller drum (250 rpm) to allow cells to recover and express the antibiotic resistance marker.

17. Spread the appropriate quantity of cells (50 to 100 ml) on selective media. Store the remaining cells at 4 o C.

19. Count the number of colonies.

20. Calculate transformation efficiency and frequency. Transformed 대장균 typically yields about 10 6 to 10 8 colonies/mg of DNA.

CFU/ml (colony forming unit per ml) = Number of colonies
Volume x Dilution factor


Calcium Chloride Made 대장균 Competent for Uptake of Extraneous DNA Through Overproduction of OmpC Protein

In the standard method of transformation of 대장균 with extraneous DNA, cells are made competent for DNA uptake by incubating in ice-cold 100 mM CaCl2. Analysis of the whole protein profile of CaCl2-treated 대장균 cells by the techniques of one- and two-dimensional gel electrophoresis, MALDI-MS and immunoprecipitation revealed overproduction of outer membrane proteins OmpC, OmpA and heat-shock protein GroEL. In parity, transformation efficiency of E. coli ompC mutant by plasmid pUC19 DNA was found to be about 40 % lower than that of the wild type strain. 더욱이 에서 대장균 cells containing 으르렁-bearing plasmid, induction of GroEL caused simultaneous overproduction of OmpC. On the other hand, less OmpC was synthesized in E. coli groEL mutant compared to its wild type counterpart, by CaCl2-shock. From these results it can be suggested that in the process of CaCl2-mediated generation of competence, the heat-shock chaperone GroEL has specific role in DNA entry into the cell, possibly through the overproduced OmpC and OmpA porins.

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How do you make a bacterial cell competent?

Competent cells ~이다 bacterial cells that can accept extra-chromosomal DNA or plasmids (naked DNA) from the environment. The generation of competent cells may occur by two methods: natural 능력 and artificial 능력.

Secondly, how do competent cells work? Competent Cells. 그런 세포는 말했다 에게 be "competent." Cells are 만들어진 competent by a process that uses calcium chloride and heat shock. 세포 저것 ~이다 undergoing very rapid growth ~이다 만들어진 competent more easily than cells in other stages of growth. The growth rate of a bacterial culture is not constant.

Likewise, how do cells become competent in nature?

Naturally competent bacteria actively pull DNA fragments from their environment into their cells. These fragments provide nucleotides, but high similarity with the chromosome also allows them to change the cell's genotype by homologous recombination, a process called 자연스러운 transformation (Fig.

How does calcium chloride make bacteria competent?

Calcium chloride 변환. It increases the ability of a prokaryotic cell to incorporate plasmid DNA allowing them to be genetically transformed. The addition of calcium chloride to a cell suspension promotes the binding of plasmid DNA to lipopolysaccharides (LPS).


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코멘트:

  1. Clyford

    소중한 정보

  2. Fagan

    또 다른 변형이 가능합니다

  3. Wadanhyll

    포럼에 특별히 등록되어 지원해 주셔서 감사합니다.

  4. Terrelle

    사랑스러운 주제

  5. Keane

    훌륭한 아이디어, 당신의 의견에 동의합니다.



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