정보

상보적 DNA 합성

상보적 DNA 합성


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

역전사효소가 티민을 인식하여 cDNA의 상보적 가닥을 합성합니까?


상보적 DNA 합성 - 생물학

역전사효소에 의한 mRNA로부터 상보적 DNA(cDNA) 합성

mRNA는 관심 유기체에서 분리됩니다. 짧은 TTTT 프라이머는 메시지의 3' 말단에서 합성되고 mRNA 주형에서 단일 가닥 DNA 분자를 합성함으로써 중심 교리를 "역전"시키는 효소 역전사효소에 의해 확장됩니다. 따라서 DNA 가닥은 mRNA에 "상보적"입니다. ssDNA의 3' 말단은 다시 접혀 단일 가닥 "헤어핀 루프"와 짧은 이중 가닥 영역을 형성할 수 있습니다. mRNA가 NaOH로 용해되면 새로운 DNA 가닥 합성을 위한 프라이머로 이중 가닥 영역을 사용하는 DNAPol I이 추가됩니다. 루프의 단일 가닥 부분은 S1 뉴클레아제로 절단되며, 그 결과 mRNA의 이중 가닥 cDNA 사본이 생성됩니다. 이 cDNA에는 mRNA 템플릿에서 스플라이싱된 인트론이 아닌 유전자의 엑손 부분만 포함됩니다.


내인성의 세포질 합성 알루 역전사를 통한 상보적 DNA 및 연령 관련 황반변성에 미치는 영향

알루 역요소는 산재된 긴 핵 요소-1(L1) 역전사효소(RT) 및 엔도뉴클레아제 활성을 하이재킹하여 역전위를 통해 전파됩니다. 역전사 알루 상보적 DNA(cDNA)로의 RNA는 게놈 통합 부위의 핵에서만 독점적으로 발생하는 것으로 추정됩니다. 이든 알루 cDNA는 게놈 통합과 독립적으로 합성됩니다. 알루 RNA는 치료 불가능한 연령 관련 황반 변성 유형인 지리적 위축에서 망막 색소 상피(RPE) 사망을 촉진합니다. 우리는 그것을보고 알루 RNA 유발 RPE 변성은 세포질 L1 역전사를 통해 매개됩니다. 알루 cDNA는 역전이와 무관합니다. 알루 RNA는 L1 억제 동물 또는 인간 세포에서 cDNA 생성 또는 RPE 변성을 유도하지 않았습니다. 알루 역전사는 자가 프라이밍을 통해 세포질에서 시작될 수 있습니다. 알루 RNA. 4개의 건강 보험 데이터베이스에서 뉴클레오사이드 RT 억제제의 사용은 위축성 황반변성의 발병 위험 감소와 관련이 있었으며(통합 조정 위험 비율, 0.616 95% 신뢰 구간, 0.493-0.770), 이에 따라 이 억제제를 식별했습니다. 알루 복제 주기 단락은 실명의 주요 원인에 대한 잠재적인 치료법입니다.

키워드: Alu 건강 보험 데이터베이스 황반변성 망막 레트로트랜스포존.


DNA 분자는 뉴클레오티드의 두 개의 상보적 사슬로 구성됩니다

DNA 분자는 4가지 유형의 뉴클레오티드 서브유닛으로 구성된 2개의 긴 폴리뉴클레오티드 사슬로 구성됩니다. 이러한 각 체인은 다음과 같이 알려져 있습니다. DNA 사슬, 또는 DNA 가닥. 수소 결합 뉴클레오타이드의 염기 부분 사이는 두 사슬을 함께 유지합니다(그림 4-3). 2장(패널 2-6, pp. 120-121)에서 보았듯이 뉴클레오티드는 하나 이상의 인산염 그룹과 질소 함유 염기가 부착된 5탄당으로 구성됩니다. DNA에 있는 뉴클레오티드의 경우, 당은 단일 인산염 그룹에 부착된 데옥시리보스이며(따라서 데옥시리보핵산이라는 이름) 염기는 다음 중 하나일 수 있습니다. 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 또는 티민(T). 뉴클레오타이드는 당과 인산염을 통해 사슬로 함께 공유 연결되어 있어 당-인산-당-인산이 교대하는 “백본”를 형성합니다(그림 4-3 참조). 네 가지 유형의 소단위 각각에서 염기만이 다르기 때문에 DNA의 각 폴리뉴클레오티드 사슬은 네 가지 유형의 구슬(4개의 염기 A, C, G, T)로 묶인 목걸이(백본)와 유사합니다. 이러한 동일한 기호(A, C, G 및 T)는 일반적으로 4개의 다른 뉴클레오티드, 즉 결합된 당 및 인산염 그룹이 있는 염기를 나타내는 데도 사용됩니다.

그림 4-3

DNA와 그 빌딩 블록. DNA는 염기(A, C, G 및 T)가 연장되는 당-인산염 백본을 사용하여 폴리뉴클레오티드 사슬(DNA 가닥)에 공유적으로 연결된 4가지 유형의 뉴클레오티드로 구성됩니다. DNA 분자는 두 개(이상)로 구성됩니다.

뉴클레오티드 소단위가 함께 정렬되는 방식은 DNA 가닥에 화학적 극성을 부여합니다. 각 설탕을 한쪽에는 돌출된 손잡이(5′ 인산염)가 있고 다른 한쪽에는 구멍(3′ 수산기)이 있는 블록으로 생각하면(그림 4-3 참조) 구멍이 있는 연동 손잡이는 모든 하위 장치가 같은 방향으로 정렬됩니다. 게다가, 사슬의 두 말단은 그 말단에 구멍(3′ 하이드록실)이 있고 다른 하나는 손잡이(5′ 인산염)가 있기 때문에 쉽게 구별할 수 있습니다. DNA 사슬의 이 극성은 한쪽 끝을 3 그리고 다른 하나는 5.

DNA의 3차원 구조—이중 나선2개의 폴리뉴클레오티드 사슬의 화학적 및 구조적 특징에서 비롯됩니다. 이 두 사슬은 서로 다른 가닥의 염기 사이에 수소 결합에 의해 함께 유지되기 때문에 모든 염기는 이중 나선 내부에 있고 당-인산염 백본은 외부에 있습니다(그림 4-3 참조). 각각의 경우에, 부피가 더 큰 2고리 염기(퓨린은 패널 2-6, pp. 120� 참조)가 단일 고리 염기(피리미딘)와 쌍을 이루고 A는 항상 T와 쌍을 이루고 G는 C와 쌍을 이룹니다(그림 4 -4). 이것 상보적 염기쌍 이중 나선 내부에서 염기쌍이 에너지적으로 가장 유리한 배열로 채워질 수 있도록 합니다. 이 배열에서 각 염기쌍은 너비가 비슷하므로 DNA 분자를 따라 당-인산염 백본을 같은 거리만큼 떨어져 유지합니다. 염기쌍 패킹의 효율성을 최대화하기 위해 2개의 당-인산 백본이 서로를 감아 이중 나선을 형성하고 10개의 염기쌍마다 한 바퀴씩 완전히 회전합니다(그림 4-5).

그림 4-4

DNA 이중 나선의 상보적 염기쌍. 염기의 모양과 화학 구조는 A와 T 사이, 그리고 G와 C 사이에서만 수소 결합이 효율적으로 형성되도록 하며, 여기서 원자는 수소 결합을 형성할 수 있습니다(패널 2-3, pp. 114� 참조). )

그림 4-5

DNA 이중 나선. (A) DNA 이중 나선의 1.5턴의 공간 채우기 모델. DNA의 각 회전은 10.4개의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성되며 인접한 뉴클레오타이드 쌍 사이의 중심 간 거리는 3.4nm입니다. 주위에 두 가닥의 코일링 (더. )

각 염기쌍의 구성원은 나선의 두 가닥이 역평행인 경우, 즉 한 가닥의 극성이 다른 가닥의 극성과 반대 방향인 경우에만 이중 나선 내에서 함께 맞을 수 있습니다(그림 4-3 및 4-4). 이러한 염기쌍 요건의 결과는 DNA 분자의 각 가닥이 파트너 가닥의 뉴클레오티드 서열과 정확히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다는 것입니다.


분자 어셈블리: 효소 DNA 합성으로 합성 생물학 재작성

이 콘텐츠는 효소 DNA 합성 기술로 DNA 합성을 근본적으로 변화시켜 산업 합성 생물학, 개인 맞춤형 치료제, 정밀 진단, 데이터 저장, 나노 기술 등의 새로운 제품을 가능하게 하는 것을 목표로 하는 샌디에이고 기반 회사인 Molecular Assemblies에 의해 가능하게 되었습니다. 분자 어셈블리의 기술에 대해 자세히 알아보기

게놈 시대는 우리가 생명책을 읽을 수 있다는 것을 보여주었고, 그로 인해 우리도 그 책에 글을 쓰게 되었습니다. 그러나 DNA 시퀀싱의 속도(우리가 "읽는" 방법)는 기하급수적으로 가속화되었지만 DNA를 화학적으로 합성하는 능력(우리가 "쓰는" 방법)은 훨씬 덜 빠르게 향상되었습니다. 30여 년 전에 도입된 이후로 핵심 기술은 거의 정체되었습니다. 결과적으로, DNA 합성은 합성 올리고뉴클레오티드에 대한 수요의 폭발적인 증가 또는 연구원의 상상력과 보조를 맞추지 못했습니다.

다행스럽게도 최근에 개발된(그리고 여전히 개발 중인) 방법이 이 분야에 혁명을 일으킬 태세입니다. 생물학적 촉매의 힘과 다양성을 활용하는 효소적 DNA 합성은 우리가 만드는 서열의 길이와 충실도를 몇 배나 증가시켜 생명책에 우리 자신의 항목을 만드는 능력을 질적으로 향상시킬 잠재력이 있습니다. 지금은 짧은 단어 몇 개만 쓸 수 있지만 곧 문장, 페이지 또는 전체 장을 조합할 수 있습니다.

이 새로운 기술의 핵심 동인은 2013년에 설립된 샌디에이고 생명공학 회사인 Molecular Assemblies입니다. 저는 25년 동안 새로운 기술 구축에 주력한 업계 베테랑인 사장 겸 CEO인 Michael Kamdar와 CSO Bill Efcavitch와 이야기를 나눴습니다. 처음부터 DNA 합성의 상업화에서. 그들은 회사의 접근 방식, 극적으로 개선된 DNA 합성의 적용 및 미래에 대한 비전을 설명했습니다.

"2013년에," 동료가 나에게 우리가 1983년에 상용화한 것과 동일한 기술을 합성 산업이 사용하고 있다고 지적했습니다."라고 Efcavitch는 회상합니다. 소형화, 병렬화, 처리량 면에서 진전이 있었지만 화학적 성질은 동일하게 유지되었습니다. "그는 '세계가 DNA 합성을 위한 새로운 화학을 가질 때라고 생각하지 않습니까?'라고 말했습니다. 나는 항상 효소 합성을 위한 횃불을 가지고 다녔고 우리가 더 낮은 비용으로 더 긴 DNA를 만들 수 있다고 믿었습니다."

Kamdar는 또한 이 분야에서 새로운 접근 방식의 가능성을 보았습니다. "저에게 영감을 준 것은 이 기술의 광범위한 적용이었습니다."라고 그는 실험실과 클리닉뿐만 아니라 데이터 저장 및 나노구조와 같은 급성장하는 맥락에서 효소 합성의 가치를 언급하며 이 모든 것에 대해 아래에서 논의할 것입니다. "응용 측면에서 가능성의 수는 저에게 정말 흥미진진합니다."

DNA 합성에 대한 새로운 효소적 접근은 합성 생물학의 다음 돌파구가 될 수 있습니다. 출처: 신바이오베타.

우리가 몇 년 동안 있었던 곳

Molecular Assemblies의 접근 방식에 대해 자세히 알아보기 전에 대체하고자 하는 기술인 2018년 DNA 합성의 최신 상태를 간략히 살펴보겠습니다. 실제로는 과거의 최신 기술과 거의 동일합니다. 30년: 포스포라미다이트 화학.

길이가 N인 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하기 위해 궁극적으로 사슬에서 N번째 염기가 될 뉴클레오티드(예: G)가 고체 기질에 결합됩니다. 그런 다음 기질은 위치 N-1(A라고 가정해 봅시다)을 차지할 종류의 자유 뉴클레오티드 단량체의 과량에 잠겨 있습니다. A는 축합 반응을 통해 G에 결합되어 AG를 생성합니다. 중요하게도, 반응 용기의 각 A는 디옥시리보스 기의 3' 위치에 있는 차단기로 변형되어 다른 A가 동일한 반응을 통해 사슬에 결합하고 그 후에 오는 것을 방지합니다. 광고 무한 , ...AAAAAAAAAG를 생성하고 실험을 망쳤습니다.

커플링 반응 후 잉여의 유리 뉴클레오티드가 세척되고 백본의 포스파이트가 포스페이트로 산화되고 차단기가 화학적으로 제거되고 신생아 AG는 또 다른 확장 라운드를 위해 준비됩니다. 이 주기는 사슬이 완성될 때까지 반복되며, 이 시점에서 올리고는 고체 기질에서 분리되고 정제되고 의도된 목적에 사용됩니다.

그 목적은 여러 가지 중 하나일 수 있습니다. 대부분의 상업적으로 합성된 올리고뉴클레오티드는 PCR 또는 시퀀싱을 위한 프라이머로 사용되지만 일부는 마이크로어레이 기술에 사용되며 다른 일부(일반적으로 고도로 정제되고 엄격한 품질 관리)는 임상 진단에 사용됩니다. 전반적으로 DNA 합성은 13억 달러 규모의 산업입니다.

포스포라미다이트 기술은 이러한 목적에 충분히 잘 작동하지만 훨씬 더 개선되지 않는 고유한 한계가 있습니다. 첫째, 원시 합성 오류율이 0.2%만큼 높기 때문에 실제로 도달할 수 있는 길이가 제한됩니다. 특정 길이에 도달하면 모든 개별 올리고에 오류가 포함된다는 것이 사실상 보장됩니다. 사용자가 PCR의 경우와 같이 불순한 혼합물에 대해 괜찮다면 괜찮지만 분자의 단일 뉴클레오티드 차이가 기능과 무기능의 차이를 의미할 수 있는 합성 생물학과 같은 현대적 맥락에서는 그렇지 않습니다.

둘째, 새로운 응용 분야(합성 생물학, 유전자 편집, DNA 치료제 및 DNA 나노기술)에는 더 긴 서열이 필요합니다. 사실, 우리는 포스포라미다이트 화학을 사용하여 긴 올리고를 만들 수 있지만 그 과정은 힘든 것입니다. 더 짧은 조각을 합성하고, 함께 꿰매어 더 긴 가닥을 만들고, 상보적인 가닥을 채우고, 다양한 종류의 오류 수정을 수행해야 합니다. 문제를 복잡하게 하는 것은 반복 영역을 포함하는 시퀀스의 조립에 이 방법을 사용하는 것이 특히 어렵습니다. 종합적으로, 이러한 문제는 긴 시퀀스를 만드는 데 필요한 비용과 시간을 증가시킵니다.

Efcavitch는 "개별 올리고 합성의 가격은 수년에 걸쳐 하락했지만 장기 구성의 경우에는 그대로 유지됩니다."라고 설명합니다. "합성이 끝난 후에도 할 일이 많기 때문입니다." 대조적으로, “효소 합성을 사용하면 재료의 '터치'를 더 적게 수행해야 합니다. 제거할 수 있는 모든 다운스트림 단계는 시간과 비용을 줄여줍니다.”

마지막으로, 그러나 중요한 것은 포스포라미다이트 합성 화학은 수성 용매보다 유기 용매를 사용한다는 것입니다. 이러한 물질은 다운스트림 생물학적 응용 프로그램과 양립할 수 없기 때문에 화학적으로 합성된 올리고는 사용 전에 광범위하게 정제해야 합니다. 더욱이, 합성 반응 자체가 심각한 독성 폐기물 흐름을 생성합니다.

SynBioBeta SF 2017 패널은 최근 몇 년 동안 기술을 비약적으로 발전시킨 DNA 합성의 발전을 강조했습니다. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. 올해의 SynBioBeta 2018은 이 주제에 대한 세션, 패널 및 워크샵을 제공합니다. 여기에서 등록하십시오.

우리가 향하는 곳

화학 합성의 문제와 한계를 극복하기 위해 분자 어셈블리는 자연이 DNA를 만드는 방식인 효소 촉매 작용으로 돌아갔습니다. 하지만 반전이 있습니다( 그것은 나선 농담이다 ). DNA 중합효소가 다음에 삽입할 뉴클레오티드 염기를 알 수 있도록 A와 T 및 C와 G의 짝짓기에 대해 학교에서 배운 것을 기억하십니까? 당신을 위해 좋은 A+. 이제 잠시 모든 것을 잊어버리십시오.

분자 어셈블리의 합성 화학은 다소 다른 효소인 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)를 사용합니다. "기존" DNA 중합효소와 달리 TdT는 주형을 사용하지 않으므로 삽입하는 뉴클레오티드에 대해 불가지론적입니다. A, C, G 또는 T? 예, 부탁합니다!

TdT는 면역 수용체를 암호화하는 유전자의 모듈 접합부 사이에 뉴클레오타이드를 추가하여 B 및 T 세포를 성숙시키는 자연적인 기능을 수행합니다. 이 의도적인 돌연변이(여기서는 A, 저기서 CG)는 항체와 T 세포 수용체 풀의 다양성을 증가시켜 우리 몸이 다양한 외래 병원체에 대한 표적 방어를 할 수 있도록 돕습니다.

면역 세포에서 TdT는 엄격하게 통제됩니다. 대조적으로, 자체 장치(예: 풍부한 자유 단량체로 둘러싸인 시험관)에 남겨두면 수천 개의 뉴클레오티드 길이의 단일 중합체를 합성할 수 있습니다.

합성을 하고 싶다면 특정한 그러나 우리가 원하는 것은 그것이 아닙니다. 따라서 효소의 풍부함은 우리가 원하는 뉴클레오티드를 올바른 순서로 추가하도록 길들여야 합니다.

이를 위해 빌딩 블록(deoxynucleotide triphosphates, dNTPs)을 한 번에 한 종류씩 소개합니다. "A"를 추가하려면 TdT가 올바른 염기만 추가할 수 있도록 반응 튜브에 As를 채우고 다른 것은 넣지 않습니다. 효소가 도망가서 수많은 A를 통합하는 것을 방지하기 위해 새로운 뉴클레오티드는 사슬 연장을 방지하는 터미네이터로 수정됩니다. 화학적 합성과 마찬가지로 일단 커플링이 발생하면 유리 dNTP가 세척되고 터미네이터가 제거되며 시스템은 다음 라운드의 단일 뉴클레오티드 추가를 위해 준비됩니다. 씻고, 헹구고, 반복하십시오.

낙관적인 전망이 사실이라면 새로운 기술은 길이와 충실도가 10~50배 증가하여 1000개 이상의 뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있습니다. 더욱이, 효소 합성은 대체하려는 기술보다 빠르고 저렴하게 작업을 수행할 수 있습니다.

현재 대부분의 실험실은 부분적으로 독성 폐기물 흐름 때문에 올리고 합성을 아웃소싱합니다. 다양한 회사에서 주문형 합성을 제공하지만 생산 및 배송에는 24-48시간이 걸리며 때로는 도착 시 추가 처리 및 정제가 필요합니다. 합성 후 조립 및 처리를 거쳐야 하는 긴 올리고의 경우 대기 시간이 훨씬 더 길어 최대 2주까지 소요되며 시퀀스당 수백 달러의 비용이 듭니다. 이러한 지연과 비용이 합산되어 팀이 주어진 기간(또는 주어진 예산) 내에 테스트할 수 있는 올리고의 수를 제한하여 궁극적으로 실험 속도를 늦춥니다.

대조적으로, 효소적 방법은 합성 후 조립이 필요하지 않으며 화학 물질은 유기물이 아닌 수성이므로 독성 폐기물을 제거하고 특정 종류의 정제가 필요하지 않습니다. 이러한 기능을 사용하면 비용과 시간 모두를 절약할 수 있습니다. DNA 합성을 개별 실험실의 벤치탑으로 다시 가져올 수도 있습니다.

Efcavitch는 "플랫폼 개발의 중요성을 간과하는 것이 아니라 긴 합성을 달성할 수 있는 최적화된 화학 물질을 갖게 되면 자동화는 간단한 엔지니어링이 됩니다."라고 말합니다. "화학이 수성이기 때문에 좋아하는 기성품 피펫팅 로봇이 DNA 합성기가 될 수 있습니다."

따라서 우리는 평범한 박테리아 미니프렙 키트보다 덜 유해한 폐기물을 생성하는 DNA 합성 장치가 모든 실험실 구석에 놓여 있는 미래를 상상할 수 있습니다. 이러한 장비는 주문형 유전자 합성을 제공하여 개념에서 실험까지의 시간을 단축하고 연구 진행을 가속화하는 "DNA 프린터"와 유사합니다.

그 지점에 도달하기 위해 회사는 몇 가지 잘 정의된 기술적 장애물을 극복하기 위해 노력하고 있습니다. 가장 중요한 것은 TdT를 더 잘 제어할 수 있는 방법을 찾는 것과 관련이 있습니다. 이는 때때로 너무... 열정적입니다. Efcavitch는 "긴 분자를 얻기 위한 두 가지 수율 결정 단계가 있습니다. 첫째, 모든 합성 라운드에서 통합이 >99.9%여야 합니다. 둘째, 단일 첨가율이 99.9% 이상이어야 합니다. 현재 길이가 N인 올리고의 경우 N+1을 매우 효율적으로 얻지만 여전히 N+2의 흔적을 얻고 있습니다.” 잠재적인 솔루션에는 반응 조건 최적화, dNTP에 대한 차단 기술 재구성 및 효소 자체의 단백질 엔지니어링이 포함됩니다.

한편, Molecular Assemblies는 이러한 문제를 극복할 수 있다고 확신합니다. "우리는 SynBioBeta 2017에서 개념 증명 데이터를 보여주었습니다."라고 Kamdar는 말합니다. “우리는 효소 합성에 대한 우리의 접근 방식이 실제로 효과가 있다는 것을 알고 있습니다. 또한 우리의 노력을 뒷받침하는 7개의 특허를 미국과 EU에서 보유하고 있습니다.”

Bill Efcavitch는 SB7.0: The Seventh International Meeting on Synthetic Biology에서 연설했습니다. 여기에서 동영상을 시청하세요.

생명책에 쓰기: 생물학 및 생물의학에서의 응용

효소적 DNA 합성은 분명히 우리 능력의 비약적 도약을 나타냅니다. 하지만 긴 올리고를 안정적으로 만들 수 있게 되면 어떻게 해야 할까요?

"성배는 1000~1500개의 뉴클레오티드로 구성된 유전자 길이의 단편입니다."라고 Efcavitch는 말합니다. "그게 사람들의 시선을 끈다."

효소 합성은 언젠가 연구자들이 단일 반응으로 유전자 크기의 DNA 조각을 만들어 비용을 제어하면서 신속한 프로토타이핑을 가능하게 할 수 있습니다. 이것은 연구자들이 새로운 생화학적 네트워크 생성을 목표로 단백질 코딩 DNA(본질적으로 새로운 유전자 생성)와 조절 서열(프로모터)을 혼합하고 일치시켜야 하는 대사 공학에서 특히 유용할 것입니다. 농업 유전 공학은 또한 긴 조각을 위한 비옥한 땅이 될 것입니다.

또 다른 주요 응용 분야는 유전자 편집입니다. 혁신적인 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하면 (대부분) 표적 외 돌연변이를 동반하지 않고 살아있는 세포의 게놈에 정확한 염기 변화를 도입할 수 있습니다. 시스템은 DNA 이중 나선의 절단을 지시하는 데 합리적으로 우수하지만 DNA 파손의 세포 복구는 원치 않는 결과를 초래할 수 있습니다. 충실도가 높은 메커니즘을 모집하기 위해 편집 대상 영역의 양쪽에 80-100개 뉴클레오티드의 "스플린트" 영역이 있어 기증자 올리고의 전체 길이를 상당히 길게 만드는 데 도움이 됩니다.

정밀 의학 및 표적 치료제는 또한 고수율, 고충실도 DNA 서열을 만드는 능력으로부터 혜택을 받을 것이며, 이를 통해 생물의학 연구자들은 대규모 세포 샘플에서 높은 재현성 결과를 얻을 수 있습니다. 전반적으로, 효소적 DNA 합성이 시험관에서 생식질, 클리닉에 이르기까지 광범위한 분야에서 작업을 촉진할 것이 분명합니다.

생물학 너머: 데이터 저장 및 나노구조

이 작품의 앞부분에서 "생명의 책" 은유는...음...은유적이었습니다. 그러나 언젠가 우리는 DNA로 실제 책을 쓸 수 있습니다.

어떤 책? 아마도 그들 모두. DNA는 극도로 정보 밀도가 높은 물질입니다. 1그램은 이론적으로 DVD 5천만 장에 해당하는 양을 저장할 수 있으며(기억나십니까?) 그 물질은 올바른 조건에서 수세기 동안 안정적입니다. 또한 핵산 데이터 저장에는 에너지 집약적 데이터 센터가 필요하지 않습니다. "DNA에는 전기가 필요하지 않습니다."라고 Kamdar는 말합니다.

최근의 DNA 저장 원리 증명(예: 박테리아 게놈에서 애니메이션 GIF의 저장 및 검색)에도 불구하고 정보 단위당 합성 비용은 여전히 ​​수용할 수 없을 정도로 높습니다. DNA를 경제적으로 실행 가능한 저장 매체로 만들려면 비용을 줄여야 합니다. 또한 짧은 올리고를 사용하는 데이터 저장은 주소 지정 및 중복에 많은 기반이 필요하므로 관심 데이터를 저장하는 데 사용할 수 있는 시퀀스의 비율이 감소합니다. 효소 합성은 합성 비용을 줄이고 개별 시퀀스의 길이를 늘리며(각 시퀀스가 ​​데이터 저장 자체에 비례적으로 더 많이 사용되도록 하며) 데이터 쓰기 시스템을 단순화함으로써 이러한 모든 문제를 해결할 수 있습니다.

Kamdar는 DNA 데이터 저장만을 위한 잠재적 시장이 기존의 전체 DNA 합성 산업보다 훨씬 더 클 것으로 보고 있습니다. 실제로 이 기술에 대한 관심이 뜨겁고 미국 정부는 현재 엑사바이트 규모의 DNA 저장 용량 개발을 목표로 연구 보조금을 제공하고 있습니다.

정보를 저장하는 것(오늘, 내일의 단백질 코딩 시퀀스, "반지의 제왕" 영화 세 편 모두의 확장 버전) 외에도 DNA는 분자의 구조를 결정하는 자연적인 염기쌍 기능을 가지고 있습니다. 우리는 DNA를 단조로운 선형 이중 나선으로 생각하는 경향이 있지만 루프 및 머리핀과 같은 흥미로운 2차 구조를 가진 더 짧은 영역을 형성할 수도 있습니다. 시퀀스가 영리하게 설계되면 이러한 작은 구성 요소가 더 큰 구조 요소로 조립될 수 있으며, 이는 차례로 특정 속성을 가진 정밀한 나노 구조로 결합될 수 있습니다. 이 직접 접힘은 때때로 "DNA 종이접기"라고 합니다. 이러한 접근 방식은 나노 물질의 자가 조립을 유도하고, 알고리즘 컴퓨팅을 위한 스위치를 개발하거나, 심지어 암세포에 약물을 전달하는 종이접기 나노봇을 만드는 데 사용될 수 있습니다.

DNA 컴퓨팅과 DNA 종이접기 모두 기존의 화학적 수단을 사용하여 현재 합성할 수 있는 것보다 더 긴 올리고가 필요합니다. 더욱이, 정보 또는 구조적 제약으로 인해 올리고가 반복적인 시퀀스를 포함해야 할 수 있으므로 겹치는 짧은 올리고를 함께 연결하여 구성하기 어렵거나 불가능합니다. 따라서 오늘날 가능한 것 이상으로 길이와 충실도를 높임으로써 효소 합성은 우리가 "생물학"이라고 생각하는 것과는 거리가 먼 산업 응용 분야에서 생명의 기본 분자를 사용하는 능력에 혁명을 일으킬 수 있습니다.

분자 어셈블리의 과학자.

내게 충분한 시간의 올리고를 주면 세상을 움직일거야

우리가 대화를 마치면서 Mike와 Bill은 오늘날 우리가 상상할 수 있는 효소적 DNA 합성의 응용이 혁명의 첫 번째 울림에 불과하다는 점을 분명히 했습니다. Kamdar는 “반도체가 처음 발명되었을 때는 특정한 용도가 있다고 생각했지만 지금은 모든 곳에서 활용되고 있습니다. 우리는 효소적 DNA 합성이 우리의 미래를 위한 새로운 기술과 돌파구의 문을 열 것이라고 믿습니다!”

이러한 응용 프로그램의 대부분은 기술의 개척자에게는 상상할 수 없었을 것이며 길고 저렴하며 충실도가 높은 올리고의 경우에도 마찬가지일 것입니다. 틀림없이 긴 단일 가닥 올리고에 대한 삽질 준비가 된 응용 프로그램이 더 이상 없는 한 가지 이유는 혁신가가 이를 만지작거리고 새로운 사용 방법을 고안할 수 있는 비용으로 아직 사용할 수 없었기 때문입니다.

"만약 우리가 이 문제를 해결할 수 있다면 사람들은 그것을 사용하는 방법을 생각할 것입니다."라고 Efcavitch는 계속합니다. "그것은 우리가 하는 일의 큰 부분입니다. 우리가 사람들에게 200, 500, 심지어 1000-mer를 줄 수 있다면 그들은 신청서를 제시할 것입니다."

웃으며 그는 씁쓸하게 덧붙입니다.

Michael Kamdar는 10월 3일 수요일 "Future of DNA Synthesis" 세션에서 SynBioBeta 2018에 출연할 예정입니다. 분자 어셈블리의 기술에 대해 자세히 알아보기 그리고 지금 SynBioBeta 2018에 등록하십시오 .

크리스 파틸

Chris Patil은 샌프란시스코에 거주하는 작가이자 과학 편집자입니다. 이전에 그는 UC-샌프란시스코, 로렌스 버클리 국립 연구소, 벅 노화 연구소 및 MIT에서 생물 노인학 연구원으로 일했습니다. 그는 @DoNotGoGently로 노화, 생물학 및 미래에 대해 트윗합니다.


추상적 인

알루 역요소는 산재된 긴 핵 요소-1(L1) 역전사효소(RT) 및 엔도뉴클레아제 활성을 하이재킹하여 역전위를 통해 전파됩니다. 역전사 알루 상보적 DNA(cDNA)로의 RNA는 게놈 통합 부위의 핵에서만 독점적으로 발생하는 것으로 추정됩니다. 이든 알루 cDNA는 게놈 통합과 독립적으로 합성됩니다. 알루 RNA는 치료 불가능한 연령 관련 황반 변성 유형인 지리적 위축에서 망막 색소 상피(RPE) 사망을 촉진합니다. 우리는 그것을보고 알루 RNA 유발 RPE 변성은 세포질 L1 역전사를 통해 매개됩니다. 알루 cDNA는 역전이와 무관합니다. 알루 RNA는 L1 억제 동물 또는 인간 세포에서 cDNA 생성 또는 RPE 변성을 유도하지 않았습니다. 알루 역전사는 자가 프라이밍을 통해 세포질에서 시작될 수 있습니다. 알루 RNA. 4개의 건강 보험 데이터베이스에서 뉴클레오사이드 RT 억제제의 사용은 위축성 황반 변성 발병 위험 감소와 관련이 있었으며(통합 조정 위험 비율, 0.616 95% 신뢰 구간, 0.493–0.770), 따라서 이 억제제를 식별했습니다. 알루 복제 주기 단락은 실명의 주요 원인에 대한 잠재적인 치료법입니다.


이중 DNA의 복제는 성장하는 포크에서 많은 단백질의 조립을 요구합니다

듀플렉스 DNA는 2개의 얽힌 가닥으로 구성되어 있기 때문에 각 가닥의 염기쌍 복사는 원래 듀플렉스의 풀림을 필요로 하며, 이는 헬리카제라고 하는 특정 “unwinding 단백질”에 의해 수행됩니다. 앞서 언급한 바와 같이 이중 DNA의 국부적인 풀림은 비틀림 응력을 생성하여 초코일의 형성을 유발하고, 이는 토포이소머라제에 의해 제거됩니다. 이 모든 단백질의 작용은 DNA 중합효소가 뉴클레오타이드 첨가를 수행하는 성장 포크(growing fork)라고 하는 이동하는 고도로 전문화된 DNA 영역을 생성합니다. DNA 중합효소가 듀플렉스 DNA를 따라 이동하고 복사하기 위해서는 헬리카아제가 듀플렉스를 순차적으로 풀어야 하고 토포이소머라제는 형성되는 슈퍼코일을 제거해야 합니다.

DNA 복제는 헬리카제 활성이 있고 부모 DNA의 짧은 부분을 푸는 단백질에 의해 성장하는 분기점의 생성으로 시작됩니다. 전문화된 RNA 중합효소는 풀린 주형 가닥에 상보적인 짧은 RNA 프라이머를 형성합니다. 상보적인 DNA 가닥에 여전히 결합되어 있는 이러한 각 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 연장되어 새로운 딸 가닥을 형성합니다. DNA 성장 포크의 작동에서 한 가지 마지막 주요 합병증은 부모 이중체의 두 가닥이 역평행이지만 5′ → 3′ 방향으로만 성장하는 새 가닥에 뉴클레오티드를 추가할 수 있다는 것입니다. 그림 4-16과 같이 하나의 RNA 프라이머로부터 5′ → 3′ 방향으로 연속적으로 리딩 스트랜드라고 불리는 하나의 딸가닥의 합성이 진행되며, 성장하는 포크의 움직임과 같은 방향. 지연 가닥이라고 하는 다른 딸 가닥의 성장도 5′ → 3′ 방향으로 발생해야 하므로 템플릿 가닥의 복사는 어떻게든 다음 방향으로 발생해야 합니다. 반대 성장하는 포크의 움직임에서 방향. 세포는 풀림에 의해 가닥이 더 많이 노출됨에 따라 두 번째 모 가닥에서 1000개 염기마다 추가로 짧은 RNA 프라이머를 생성하여 이 위업을 달성합니다. 주형 가닥에 염기쌍을 이루는 이러한 프라이머 각각은 5′ → 3′ 방향으로 연장되어 발견자 Reiji Okazaki의 이름을 따서 Okazaki 단편이라고 하는 불연속 세그먼트를 형성합니다. 각 오카자키 단편의 RNA 프라이머가 제거되고 이웃 오카자키 단편으로부터 DNA 사슬 성장으로 대체되어 최종적으로 '효소'라고 불립니다. DNA 리가제 인접한 조각을 결합합니다. 적어도 30개의 단백질이 DNA 성장 포크의 형성과 작동에 참여합니다. 이 DNA 복제 기계는 12장에서 자세히 설명합니다.

그림 4-16

성장하는 포크에서 DNA 복제의 개략도. 뉴클레오티드는 5′ → 3′ 방향(화살촉으로 표시)으로 각 딸 가닥에 DNA 중합효소에 의해 추가됩니다. 리딩 스트랜드의 합성은 (more. )부터 연속적으로 발생합니다.


CDNA 합성

cDNA 합성은 역전사에 의한 RNA 주형으로부터 상보적 DNA(cDNA)의 생성을 설명합니다. 역전사효소(RT)는 RNA 주형과 RNA에 상보적인 프라이머를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA의 합성을 지시하며, 이는 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 주형으로 직접 사용할 수 있습니다. 역전사 및 PCR(RT-PCR)의 이러한 조합을 통해 샘플에서 낮은 존재비의 RNA를 검출하고 해당 cDNA를 생산할 수 있어 복제량이 적은 유전자의 클로닝을 촉진할 수 있습니다. 또는 첫 번째 가닥 cDNA는 DNA 중합효소 I 및 DNA 리가아제를 사용하여 이중 가닥으로 만들 수 있습니다. 이러한 반응 생성물은 증폭 없이 직접 클로닝에 사용할 수 있습니다. 이 경우 RT에서 또는 외부에서 공급된 RNase H 활성이 필요합니다.

많은 RT는 상용 공급업체에서 구할 수 있습니다. 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소 및 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MuLV, MMLV) 역전사효소는 분자 생물학 워크플로에서 일반적으로 사용되는 RT입니다. M-MuLV 역전사효소에는 3´&rarr 5´ exonuclease 활성이 없습니다. ProtoScript® II 역전사효소는 RNase H 활성이 감소하고 열안정성이 증가된 재조합 M-MuLV 역전사효소입니다. It can be used to synthesize first strand cDNA at higher temperatures than the wild-type M-MuLV. The enzyme is active up to 50°C, providing higher specificity, higher yield of cDNA and more full-length cDNA product, up to 12 kb in length. WarmStart RTx Reverse Transcriptase is a unique, in silico designed RNA-directed DNA polymerase coupled with a reversibly-bound aptamer that inhibits enzyme activity below 40°C. This enzyme can synthesize a complementary DNA strand initiating from a primer using RNA (cDNA synthesis) or single-stranded DNA as a template. RTx is a robust enzyme for RNA detection in amplification reactions and is particularly well suited for use in LAMP (loop-mediated isothermal amplification). The Template Switching RT Enzyme Mix features an RT that adds a few non-templated nucleotides after it reaches the 5&prime end of the RNA template, enabling efficient template switching activity in a RT reaction. The Luna Reverse Transcriptase featured in Luna RT-qPCR/qPCR products possesses higher thermostability than many other RTs, allowing an optimal reaction temperature of 55°C.

유형 선택:

이 제품은 New England Biolabs, Inc(NEB)가 소유하거나 관리하는 하나 이상의 특허, 상표 및/또는 저작권의 보호를 받습니다.

NEB가 다양한 응용 프로그램에 대한 제품을 개발하고 검증하는 동안 이 제품을 사용하는 동안 구매자는 특정 응용 프로그램에 대한 추가 제3자 지적 재산권을 획득해야 할 수 있습니다.

상업적 권리에 대한 자세한 내용은 NEB의 글로벌 비즈니스 개발 팀([email protected])에 문의하십시오.

이 제품은 연구 목적으로만 사용됩니다. 이 제품은 인간이나 동물에 대한 치료 또는 진단 목적으로 사용하도록 고안되지 않았습니다.


DNA Replication in Prokaryotes

Prokaryotic DNA is replicated by DNA polymerase III in the 5′ to 3′ direction at a rate of 1000 nucleotides per second.

학습 목표

Explain the functions of the enzymes involved in prokaryotic DNA replication

주요 내용

키 포인트

  • Helicase separates the DNA to form a replication fork at the origin of replication where DNA replication begins.
  • Replication forks extend bi-directionally as replication continues.
  • Okazaki fragments are formed on the lagging strand, while the leading strand is replicated continuously.
  • DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments.
  • Primase synthesizes an RNA primer with a free 3′-OH, which DNA polymerase III uses to synthesize the daughter strands.

핵심 용어

  • DNA 복제: a biological process occuring in all living organisms that is the basis for biological inheritance
  • 헬리케이스: an enzyme that unwinds the DNA helix ahead of the replication machinery
  • 복제의 기원: a particular sequence in a genome at which replication is initiated

DNA Replication in Prokaryotes

DNA replication employs a large number of proteins and enzymes, each of which plays a critical role during the process. One of the key players is the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides one by one to the growing DNA chain that are complementary to the template strand. The addition of nucleotides requires energy this energy is obtained from the nucleotides that have three phosphates attached to them, similar to ATP which has three phosphate groups attached. When the bond between the phosphates is broken, the energy released is used to form the phosphodiester bond between the incoming nucleotide and the growing chain. 원핵생물에서는 DNA pol I, DNA pol II 및 DNA pol III의 세 가지 주요 유형의 중합효소가 알려져 있습니다. DNA pol III is the enzyme required for DNA synthesis DNA pol I and DNA pol II are primarily required for repair.

There are specific nucleotide sequences called origins of replication where replication begins. 에 대장균, which has a single origin of replication on its one chromosome (as do most prokaryotes), it is approximately 245 base pairs long and is rich in AT sequences. 복제의 기원은 이 부위에 결합하는 특정 단백질에 의해 인식됩니다. An enzyme called helicase unwinds the DNA by breaking the hydrogen bonds between the nitrogenous base pairs. 이 과정에는 ATP 가수분해가 필요합니다. As the DNA opens up, Y-shaped structures called replication forks are formed. Two replication forks at the origin of replication are extended bi-directionally as replication proceeds. Single-strand binding proteins coat the strands of DNA near the replication fork to prevent the single-stranded DNA from winding back into a double helix. DNA polymerase is able to add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction (a new DNA strand can be extended only in this direction). It also requires a free 3′-OH group to which it can add nucleotides by forming a phosphodiester bond between the 3′-OH end and the 5′ phosphate of the next nucleotide. This means that it cannot add nucleotides if a free 3′-OH group is not available. Another enzyme, RNA primase, synthesizes an RNA primer that is about five to ten nucleotides long and complementary to the DNA, priming DNA synthesis. A primer provides the free 3′-OH end to start replication. DNA polymerase then extends this RNA primer, adding nucleotides one by one that are complementary to the template strand.

DNA Replication in Prokaryotes: A replication fork is formed when helicase separates the DNA strands at the origin of replication. DNA는 복제 분기보다 더 높게 꼬이는 경향이 있습니다. Topoisomerase breaks and reforms DNA’s phosphate backbone ahead of the replication fork, thereby relieving the pressure that results from this supercoiling. 단일 가닥 결합 단백질은 단일 가닥 DNA에 결합하여 나선이 다시 형성되는 것을 방지합니다. Primase는 RNA 프라이머를 합성합니다. DNA 중합효소 III는 이 프라이머를 사용하여 딸 DNA 가닥을 합성합니다. 선행 가닥에서 DNA가 연속적으로 합성되는 반면, 후행 가닥에서 DNA는 오카자키 단편이라는 짧은 스트레치로 합성됩니다. DNA 중합효소 I은 RNA 프라이머를 DNA로 대체합니다. DNA 리가아제는 오카자키 단편 사이의 틈을 막아 단편을 단일 DNA 분자로 결합합니다.

복제 포크는 초당 1000개 뉴클레오티드의 속도로 이동합니다. DNA polymerase can only extend in the 5′ to 3′ direction, which poses a slight problem at the replication fork. As we know, the DNA double helix is anti-parallel that is, one strand is in the 5′ to 3′ direction and the other is oriented in the 3′ to 5′ direction. One strand (the leading strand), complementary to the 3′ to 5′ parental DNA strand, is synthesized continuously towards the replication fork because the polymerase can add nucleotides in this direction. The other strand (the lagging strand), complementary to the 5′ to 3′ parental DNA, is extended away from the replication fork in small fragments known as Okazaki fragments, each requiring a primer to start the synthesis. Okazaki fragments are named after the Japanese scientist who first discovered them.

The leading strand can be extended by one primer alone, whereas the lagging strand needs a new primer for each of the short Okazaki fragments. The overall direction of the lagging strand will be 3′ to 5′, while that of the leading strand will be 5′ to 3′. The sliding clamp (a ring-shaped protein that binds to the DNA) holds the DNA polymerase in place as it continues to add nucleotides. Topoisomerase는 DNA가 열리기 때문에 DNA 나선에 일시적인 흠집을 일으킨 다음 다시 봉함으로써 복제 포크보다 앞서서 DNA 이중 나선이 과도하게 감기는 것을 방지합니다. 합성이 진행됨에 따라 RNA 프라이머는 DNA로 대체됩니다. The primers are removed by the exonuclease activity of DNA pol I, while the gaps are filled in by deoxyribonucleotides. The nicks that remain between the newly-synthesized DNA (that replaced the RNA primer) and the previously-synthesized DNA are sealed by the enzyme DNA ligase that catalyzes the formation of phosphodiester linkage between the 3′-OH end of one nucleotide and the 5′ phosphate end of the other fragment.

The table summarizes the enzymes involved in prokaryotic DNA replication and the functions of each.

원핵생물 DNA 복제: 효소와 그 기능: The enzymes involved in prokaryotic DNA replication and their functions are summarized on this table.


섹션 요약

DNA replicates by a 반 보수적인 method in which each of the two parental DNA strands act as a template for new DNA to be synthesized. After replication, each DNA has one parental or “old” strand, and one daughter or “new” strand.

Replication in eukaryotes starts at multiple origins of replication, while replication in prokaryotes starts from a single origin of replication. The DNA is opened with enzymes, resulting in the formation of the replication fork. Primase synthesizes an RNA primer to initiate synthesis by DNA polymerase, which can add nucleotides in only one direction. One strand is synthesized continuously in the direction of the replication fork this is called the leading strand. The other strand is synthesized in a direction away from the replication fork, in short stretches of DNA known as Okazaki fragments. This strand is known as the lagging strand. Once replication is completed, the RNA primers are replaced by DNA nucleotides and the DNA is sealed with DNA ligase.

The ends of eukaryotic chromosomes pose a problem, as polymerase is unable to extend them without a primer. Telomerase, an enzyme with an inbuilt RNA template, extends the ends by copying the RNA template and extending one end of the chromosome. DNA polymerase can then extend the DNA using the primer. In this way, the ends of the chromosomes are protected. Cells have mechanisms for repairing DNA when it becomes damaged or errors are made in replication. These mechanisms include mismatch repair to replace nucleotides that are paired with a non-complementary base and nucleotide excision repair, which removes bases that are damaged such as thymine dimers.

수업 과정

용어 사전

DNA ligase: the enzyme that catalyzes the joining of DNA fragments together

DNA polymerase: an enzyme that synthesizes a new strand of DNA complementary to a template strand

helicase: an enzyme that helps to open up the DNA helix during DNA replication by breaking the hydrogen bonds

lagging strand: during replication of the 3′ to 5′ strand, the strand that is replicated in short fragments and away from the replication fork

leading strand: the strand that is synthesized continuously in the 5′ to 3′ direction that is synthesized in the direction of the replication fork

불일치 수리: a form of DNA repair in which non-complementary nucleotides are recognized, excised, and replaced with correct nucleotides

돌연변이: a permanent variation in the nucleotide sequence of a genome

뉴클레오티드 절단 수리: a form of DNA repair in which the DNA molecule is unwound and separated in the region of the nucleotide damage, the damaged nucleotides are removed and replaced with new nucleotides using the complementary strand, and the DNA strand is resealed and allowed to rejoin its complement

Okazaki fragments: the DNA fragments that are synthesized in short stretches on the lagging strand
primer: a short stretch of RNA nucleotides that is required to initiate replication and allow DNA polymerase to bind and begin replication

replication fork: the Y-shaped structure formed during the initiation of replication

semiconservative replication: the method used to replicate DNA in which the double-stranded molecule is separated and each strand acts as a template for a new strand to be synthesized, so the resulting DNA molecules are composed of one new strand of nucleotides and one old strand of nucleotides

telomerase: an enzyme that contains a catalytic part and an inbuilt RNA template it functions to maintain telomeres at chromosome ends

telomere: the DNA at the end of linear chromosomes



코멘트:

  1. Black

    내 생각에 당신은 실수하고 있습니다. 논의할 것을 제안합니다. PM에 이메일을 보내주시면 상담해 드리겠습니다.

  2. Arakasa

    나는 가입한다. 그것은 나와 함께였습니다.

  3. Fontaine

    나는 당신과 완전히 동의합니다. 나는 오래 전에이 의견에 왔습니다.

  4. Nagor

    축하합니다. 당신은 훌륭한 생각으로 방문했습니다

  5. Inglebert

    확실히. 나는 위의 모든 것에 가입합니다. 우리는이 주제에 대해 이야기 할 수 있습니다. 여기 또는 오후에.



메시지 쓰기