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형광색소는 항체와 같은 단백질에 어떻게 접합됩니까?

형광색소는 항체와 같은 단백질에 어떻게 접합됩니까?


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FITC와 같은 형광색소는 어떻게 항체에 결합됩니까? 그들은 공유 결합되어 있습니까? 공유 결합된 경우 낮은 온도(섭씨 -20도 이하)에서 공유 결합이 끊어지고 단백질에서 형광색 표지가 분리됩니까?


형광색소는 항체에 공유 결합되어 안정적으로 표지된 분자를 형성합니다. 이 논문은 초록에서 아주 자세하게 설명합니다.

형광색소는 티올 또는 아민 그룹과의 반응을 통해 항체에 공유 결합될 수 있습니다. 일반적으로 이소티오시아네이트, 숙신이미딜 에스테르 또는 설포닐 클로라이드 반응성 기를 함유하는 형광색소는 항체 분자의 아민에 접합됩니다.

이러한 공유 결합은 실온에서 안정하며 -20°C에서도 유지됩니다. 반복되는 동결-해동 주기가 항체를 손상시킬 가능성이 더 큽니다.


형광단 및 염료

염료 형광은 유세포 분석에서 가장 일반적으로 분석되지만 염색되지 않은 세포의 자가형광 수준에서 귀중한 정보를 결정할 수 있습니다. 세포는 특히 가시 스펙트럼의 더 낮은 파장에서 자연적으로 자가형광이며 산란된 빛은 세포 크기, 입도, 표면 지형 및 핵:세포질 비율에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 백혈구 분석을 통해 다양한 백혈구 유형을 식별할 수 있습니다.

그러나 대부분의 유세포 분석 실험에는 형광색소가 사용됩니다. 이들은 형광 특성을 갖는 알로피코시아닌(APC)과 같은 작은 유기 분자 또는 단백질입니다. 형광색소는 종종 표적 또는 바이오마커를 표시하기 위해 1차 또는 2차 항체에 접합됩니다. 항체 염색의 대안은 GFP, Venus 또는 mRFP와 같은 형광 단백질과 융합된 관심 단백질을 안정적으로 또는 일시적으로 발현하는 세포를 사용하는 것입니다.

형광색소의 선택은 실험 설정에 따라 다릅니다.

스펙트럼 중첩을 최소화하려면 동일한 레이저에 의해 여기되는 경우 여기 스펙트럼이 유사한 형광색소를 사용하지 마십시오.

일부 형광색소는 표지 시약에 상당한 분자량을 추가합니다. 이는 세포막을 투과하여 세포 내 표적을 염색하는 능력을 감소시킬 수 있습니다.

탠덤 염료를 올바르게 취급해야 합니다. 동결-해동 주기와 빛에 노출되지 않도록 하여 디커플링을 최소화하십시오.

형광단 시약을 사용하는 경우 세포를 염색한 다음 분석 전에 세척하여 과량의 결합되지 않은 염료를 제거합니다. 1 번 테이블 다양한 형광단 시약을 사용한 염색 절차에 대한 팁을 보여줍니다. 항체를 이용한 세포내 단백질 분석에는 투과성이 필요합니다.

표 1. 유세포 분석에 일반적으로 사용되는 형광단 시약의 유형.

시약 예시 살아있는 세포 고정 셀 투과성
생존 염료 요오드화 프로피듐 아니요 아니요
아폽토시스 마커 형광 표지된 아넥신 V 아니요 아니요
세포에서 발현되는 형광 단백질 GFP-LC3 필요하지 않음
세포외 단백질에 대한 형광 표지된 항체 E-카데린(그림 2 참조) 필요하지 않음
세포내 단백질에 대한 형광 표지된 항체 라민 A/C(그림 2 참조) 기술적으로 도전적 필수의

그림 2. 유세포 분석은 세포 외 및 세포 내 표적을 모두 분석하는 데 적합합니다.

왼쪽: 1X10^6 HepG2 세포를 2ug E-cadherin 항체(20874-1-AP, red) 및 대조군 항체(blue)로 염색하였다. 3% BSA로 차단된 90% MeOH로 고정(30분). Alexa Fluor™ 488 결합 AffiniPure 염소 항토끼 IgG(H+L) 1:1000 희석.

오른쪽: 1X10^6 HEK-293T 세포를 0.2ug Lamin A/C 항체(10298-1-AP, red) 및 대조군 항체(blue)로 염색하였다. 3% BSA로 차단된 90% MeOH로 고정(30분). Alexa Fluor™ 488 결합 AffiniPure 염소 항토끼 IgG(H+L) 1:1000 희석.


DyLight® 형광색소 접합 이차 항체

DyLight® 형광색소는 높은 형광 강도, 광안정성 및 수용성을 나타내며 pH 4.0 및 pH 9.0에서 형광성을 유지합니다. 또한, DyLight® 형광색소의 수용성으로 인해 접합체의 침전을 일으키지 않고 높은 염료 대 항체 비율을 달성할 수 있습니다.

DyLight® 형광색소는 350nm에서 777nm 범위의 최대 흡수를 가지며 전체 가시광선 스펙트럼을 포함합니다. DyLight® 형광색소의 흡수 및 방출 특성은 모두 일반적인 형광 기기의 여기 및 검출 파장과 호환됩니다.

당사 카탈로그에는 DyLight® 488, DyLight® 550, DyLight® 594 및 DyLight® 650과 결합된 2차 항체가 포함되어 있습니다.

그림 1. DyLight의 방출 스펙트럼®​ 카탈로그에서 사용할 수 있는 형광색소.

항체 접합체 하이라이트

  • 다양한 특성의 넓은 범위
  • 접합체 성능 최적화 - 친화성 정제 또는 사전 흡착 항체
  • 일관되고 안정적 ​​- 4°C에서 1년 동안 안정적, 사용 기간 동안 일관된 성능 제공

장점

  • 밝은 형광 - 강렬한 방출로 높은 감도 제공
  • 좁은 방출 스펙트럼 - 형광색 채널 사이의 무시할 수 있는 블리드스루를 통해 다색 이미징이 용이함
  • 높은 광안정성 - 광표백에 대한 더 나은 저항성
  • pH 4.0-9.0 범위의 완충액에서 완전히 안정
  • 기기 호환성 - DyLight®는 일반적인 레이저 및 필터 설정으로 시각화할 수 있습니다.

DyLight® 염료 속성

DyLight® 형광색소는 형광 현미경 및 유세포 분석에 적합합니다.

형광색소색상Ex/Em스펙트라스펙트럼적으로 동등한 염료
다이라이트® 488
493/518그래프 보기FITC, Cy2®
다이라이트® 550
562/576그래프 보기Cy3®, 트리티씨
다이라이트® 594
593/618그래프 보기텍사스 레드®
다이라이트® 650
652/672그래프 보기Cy5®

표 1. DyLight의 스펙트럼 속성®​ 형광색소.

ε: 최대 흡수에서의 몰 흡광 계수

추가 정보나 도움이 필요하면 과학 지원 팀에 문의하십시오.

다이라이트®​ Thermo Fisher Scientific Inc. 및 그 자회사의 상표입니다. 싸이®​ 및 CyDye® GE Healthcare Limited의 상표입니다.


형광색소는 항체와 같은 단백질에 어떻게 접합됩니까? - 생물학

유세포분석의 원리

유세포 분석은 일반적으로 세포 내 및 표면 분자의 발현을 분석하고, 이질적인 세포 집단에서 다양한 세포 유형을 특성화 및 정의하고, 분리된 하위 집단의 순도를 평가하고, 세포 크기 및 부피를 분석하는 데 사용됩니다.

그림 1과 같이 시료 준비 단계에서 관심 있는 세포는 형광색소로 표시됩니다. 그런 다음 현탁액에 있는 세포는 공동 주입된 시스 흐름에 의해 유체 역학적으로 중앙 집중화된 얇은 흐름에 주입되고 레이저 빔에 부딪힙니다. 광 산란은 전방 및 측면 광 검출기에 의해 감지됩니다. 형광은 이색 거울과 필터가 있는 광학 벤치에서 분류되고 광전자 증배관에 의해 감지되고 증폭됩니다. 그런 다음 신호는 특정 소프트웨어에 의해 분석됩니다.

그림 1 유세포 분석의 원리. (디핀스-버거, 2016)

형광단

형광단은 핵산 또는 단백질의 발현을 감지하는 데 사용되는 형광 마커입니다. 그들은 기능적으로 주어진 파장에서 빛 에너지를 받아들이고 더 긴 파장에서 그것을 다시 방출합니다. 유세포 분석에 큰 잠재력을 가진 형광단에는 두 가지 주요 종류가 있습니다.

fluorescein isothiocyanate(FITC), Allophycocyanin(APC) 및 Phycoerythrin(PE)과 같은 단일 염료는 수년 동안 사용 가능했습니다. 탠덤 염료는 다른 형광단에 공유 결합된 작은 형광단으로 구성됩니다. 첫 번째 염료가 여기되어 최대 여기된 전자 단일항 상태에 도달하면 에너지가 두 번째 염료로 전달됩니다. 이것은 두 번째 형광단을 활성화시켜 형광 방출을 생성합니다.

녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP) 및 mCherry와 같은 형광 단백질은 유세포 분석 및 세포 분류에 널리 사용됩니다. 형광 단백질은 종종 공동 발현되거나 관심 단백질과의 융합으로 발현됩니다.

유세포 분석의 접합 항체: 직접 대 간접 형광단 표지

일반적으로 유세포 분석 실험에서 판독으로 사용되는 형광단은 항체에 공유 결합되어 있습니다. 접합 항체가 세포 기반 분석에 사용될 때 형광단에서 방출되는 빛은 세포 내부 또는 세포에 존재하는 항체의 양을 직접적으로 나타내는 지표 역할을 합니다. 연구원은 단백질에 특이적으로 결합하는 접합체를 사용하여 해당 세포에서 방출되는 형광 수준을 기반으로 모든 세포에서 관심 대상을 직접 정량화할 수 있습니다. 이 과정을 직접 검출 또는 직접 유세포 분석이라고 합니다.

대안적 접근 방식인 간접 유세포 분석은 1차 항체가 생성된 숙주의 면역글로불린(Ig)에 대한 2차 항체를 활용합니다. 이 방법에서 2차 항체는 형광단에 접합되어 1차 항체는 수정되지 않은 상태로 남습니다.

그림 2 직접 및 간접 면역형광.

유세포 분석을 위한 직접 염색 대 간접 염색

  • 동일한 숙주에서 항체의 직접 다중화 가능
  • 더 적은 배양 및 세척 단계로 인한 더 빠른 프로토콜
  • 하나의 분석에서 많은 다른 항체를 사용할 수 있어 많은 수의 종말점을 동시에 판독할 수 있습니다.
  • 이차 항체에서 신호 증폭 없음
  • 2차 증폭으로 인해 더 높은 감도를 제공하므로 소량으로 존재하는 표적의 검출을 개선할 수 있습니다.
  • 직접 접합체를 아직 사용할 수 없는 경우 1차 항체의 초기 검증에 유용합니다.
  • 실험에서 결합할 수 있는 제한된 수의 항체
  • 2단계 염색
  • 2차 항체는 표적 이외의 종과 교차 반응할 수 있습니다.
  • 간접 유세포 분석은 1차 항체의 접합이 특이성과 기능에 영향을 미치는 입체적 변화를 일으킬 수 있는 경우 직접 유세포 분석보다 선호될 수 있습니다.
  • 증가된 신호가 필요한 경우 간접 유세포 분석이 선호될 수도 있습니다. 하나 이상의 2차 항체가 1차 항체에 결합하여 1차 항체에 결합된 각 항원 분자에서 유래된 신호를 증폭할 수 있습니다.

데이터 분석

유세포 분석 데이터 분석은 기본적으로 게이팅 원리를 기반으로 합니다. 게이트 및 영역은 일반적으로 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 및 마커 발현과 같은 공통 특성을 갖는 세포 집단 주위에 배치됩니다. 세포의 크기와 입도는 FSC 및 SSC 특성을 기반으로 식별할 수 있습니다. 세포 집단을 구별하는 것은 한 가지 유형의 세포만 있는 세포주의 경우 비교적 간단할 수 있지만 여러 세포 유형이 있는 샘플의 경우 더 복잡할 수 있습니다.

파편과 죽은 세포는 종종 FSC 수준이 낮고 밀도 플롯의 왼쪽 하단 모서리에서 발견됩니다. 이벤트는 밀도 정보가 표시되지 않는 점 플롯으로 표시되거나 산란 패턴의 상대적 강도를 표시하는 등고선 맵으로 표시될 수도 있습니다. 어떤 디스플레이가 선호되는지는 사용자 선호도에 달려 있지만 때로는 개별 세포 집단이 등고선 다이어그램에서 시각화하는 것이 더 쉽습니다.

Fig.3 FSC와 SSC의 측정.

일반적인 응용 프로그램

유세포 분석의 가장 일반적인 용도는 세포의 마커를 식별하는 것입니다. 면역표현형은 단일 마커로 간단히 세포를 식별하거나 귀환 프로파일, 활성화 상태 및 사이토카인 방출을 모두 한 패널에서 사용하여 보다 복잡한 세포 식별이 가능합니다. 결과적으로, 실험 프로토콜은 종종 표면 및 세포내 염색의 조합입니다.

유세포 분석으로 측정할 수 있는 세포 사멸의 가장 일반적인 특징 중 하나는 건강한 세포의 내막에서 발견되는 인지질인 포스파티딜세린(PS)의 외부화입니다. Annexin V는 phosphatidyl serine에 결합하므로 형광단으로 표지된 annexin V는 apoptosis를 평가할 수 있으며 일반적으로 propidium iodide(PI)와 같은 생존 염료와 함께 사용하여 apoptosis를 괴사 세포와 구별합니다.

세포 사멸의 후기 단계에서 발생하는 DNA 단편화는 또한 sub-G1 분석을 사용하여 유세포 분석에 의해 측정될 수 있습니다. 세포 사멸 동안 생성된 작은 DNA 단편이 세포 밖으로 누출되어 세포 사멸 세포의 총 DNA 함량을 감소시킵니다. PI로 DNA를 염색하면 PI 히스토그램의 sub-G1 피크에서 hypodiploid apoptotic 세포를 계산할 수 있습니다. 게다가, 조기 아폽토시스는 JC-1, 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(TMRE) 및 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM)와 같은 세포의 감소된 미토콘드리아 잠재력을 평가하는 전위 염료에 의해 측정될 수도 있습니다. 이 염료는 세포사멸이 없는 세포의 미토콘드리아에서 응집되어 밝게 형광을 냅니다. 미토콘드리아 막 전위가 붕괴되면 염료가 단량체 형태로 세포질로 분산되어 형광이 감소하거나 색이 변합니다.

세포 증식은 여러 방법을 사용하여 유세포 분석에 의해 측정할 수 있습니다. 한 가지 접근 방식은 Ki67 또는 MCM2와 같은 증식 마커에 대한 항체로 염색하는 것입니다. 게다가, 세포 주기의 S 단계에서 DNA에 통합되는 BrdU로 세포를 배양할 수 있습니다. 통합된 BrdU는 형광 표지된 항-BrdU 항체를 사용하여 검출할 수 있습니다. PI와 같은 DNA 염색과 결합하면 S-단계에서 세포의 상대적 비율을 결정할 수 있습니다.

기타 애플리케이션

  • 단핵구 산화 폭발
  • 호중구 산화 파열
  • 단핵구 식균 작용
  • 호중구 식균 작용
  • 미생물 분석
  • 세포 인신매매
  • 세포 및 항체 또는 보체 매개 세포독성
  • 형태(FSC 또는 SSC) 및/또는 형광 특성을 기준으로 분류

유세포 분석 관련 섹션

Creative Biolabs는 유세포 분석의 초보자에게 매우 귀중한 프레젠테이션을 제공하고 이 강력한 응용 프로그램의 장점에 대해 다른 사람들에게 가르치는 데 관심이 있는 사람들을 위한 사실로 가득 찬 시놉시스 역할을 합니다. 학습을 더 돕기 위해 다음 섹션을 소개했습니다. 프로토콜 및 문제 해결 가이드는 각 실험 방법에 따라 제공됩니다. 자세한 내용은 해당 섹션을 참조하십시오.


효소, 형광색소 등에 대한 접합 항체

접합 항체는 웨스턴 블롯에서 유세포 분석에 이르는 다양한 응용 분야에서 유용한 연구 도구입니다. Novus Biologicals는 HRP와 같은 효소, FITC와 같은 형광색소, 그리고 비오틴 및 시아닌 염료를 비롯한 기타 물질에 결합된 많은 1차 항체를 제공합니다.

항체 연구실은 항상 맞춤형 항체 접합 프로젝트로 분주합니다. 이번 주에 실험실은 비오틴에 대한 LDL 수용체 항체, HRP에 대한 HMGB1 항체, DyLight 488에 대한 액틴 항체, DyLight 549에 대한 CD133 항체를 포함하여 수많은 접합을 수행했습니다.

HRP, 비오틴 및 DyLight 염료에 대한 항체 접합의 차이점에 대해 질문했을 때 Novus 연구소 기술자 중 한 명인 David Kuroki는 차이점 중 하나만 설명했습니다.

"투석은 존재할 수 있는 1차 아민 및 아지드화나트륨을 제거하는 데 사용됩니다. HRP 및 비오틴의 경우 투석 완충액은 PBS, pH 7.4입니다. DyLight 형광체의 경우 투석 완충액은 50mM 붕산나트륨, pH 8.5입니다. 또한 배양 시간의 차이, Biotin의 경우 30분, DyLight fluors의 경우 1시간, HRP의 경우 3시간입니다."

Kuroki는 또한 항체 접합이 특정 접합체에 따라 3~6시간이 걸릴 수 있다고 언급했습니다. 먼저 항체를 기준점에 대해 정량한 다음 적절한 완충액에 투석합니다. 다음으로 필요한 경우 항체를 농축하고 다시 정량하여 회수 효율을 결정합니다. 이러한 단계가 완료되면 실제 활용이 발생합니다.

당사의 1차 항체 페이지를 방문하고 화면 왼쪽 하단에 있는 접합체 필터를 사용하여 당사가 제공하는 접합된 항체를 찾아보십시오. 또한 Lightning-Link 항체 라벨링 키트를 사용하여 단 30초 만에 모든 항체에 쉽게 라벨을 붙일 수 있습니다.


형광색소는 항체와 같은 단백질에 어떻게 접합됩니까? - 생물학

면역조직화학(IHC)

면역조직화학(IHC)은 항원과 항체 사이의 특이적 결합을 활용하여 세포와 조직에서 특정 항원을 탐지하고 국소화하는 강력한 기술이며, 종종 광학현미경으로 가시화됩니다. IHC는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직에서 편리하게 수행할 수 있는 항원 검색 방법과 재현성 있는 대용량 처리를 위한 자동화 방법의 출현으로 해부학적 병리학의 임상 진단에 널리 사용됩니다. 게다가, IHC는 신생물의 분류, 전이성 종양의 기원 위치 결정 및 일상적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에서 눈에 띄지 않는 종양 세포의 작은 병소의 검출을 돕기 위해 자주 사용됩니다. 또한 IHC는 예측 및 예후 정보를 제공하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다.

일반 단계

IHC의 단계는 조직 고정, 임베딩 및 절편, 항원 검색, 투과화, 차단, 항체 배양 및 면역염색으로 요약할 수 있습니다.

    조직 고정, 임베딩 및 단면화

조직 샘플의 고정은 IHC 실험 및 저장 중에 세포 및 조직 형태를 유지하는 데 중요합니다. 절제된 조직의 자가분해 및 괴사를 방지하고 항원성을 보존하며 조직 구성성분의 굴절률을 향상시킵니다. 사용되는 고정액은 표적 항원과 원하는 검출 기술(형광 또는 발색)의 영향을 받습니다. 그런 다음 조직 샘플을 파라핀에 묻거나 동결합니다. 포함은 조직 형태를 보존하고 절단하는 동안 조직을 지지하는 데 중요합니다. 일부 에피토프는 가혹한 고정 또는 임베딩에서 살아남지 못할 수 있습니다. 조직은 일반적으로 추가 연구를 용이하게 하기 위해 얇은 섹션이나 더 작은 조각으로 절단됩니다.

정착액 선택 지침

  • 세포/세포학적 제제: 4% 포름알데히드
  • 조직 섹션: 10% 중성 완충 포르말린(NBF)

샘플 고정 과정은 항원을 가리고 항원-항체 결합을 제한할 수 있는 단백질 가교로 이어질 수 있습니다. 항원 검색을 통해 항체가 조직 내의 표적 단백질에 접근할 수 있습니다. 마스킹된 에피토프는 효소/단백질 분해 항원 검색 또는 열 유도 항원 검색 방법을 사용하여 복구할 수 있습니다. 최적의 항원 검색 기술은 항원, 조직, 고정 방법 및/또는 1차 항체에 따라 다릅니다. 일부 항원은 가열과 효소 소화의 조합이 필요합니다.

  • 효소적 방법에는 proteinase K, trypsin, pepsin과 같은 protease가 사용된다.
  • 열 유도 방법은 열과 버퍼 선택을 사용합니다.
열 유발 항원 검색용 버퍼 효소 항원 검색을 위한 효소 제형
구연산염 완충액 pH 6.0 펩신
EDTA 완충액 pH 8.0 프로테이나제 K
트리스 완충액 pH 10.0 트립신
Tris-EDTA 완충액 pH 9.0

세포내 단백질 및 막관통 단백질의 세포질 에피토프와 같은 표적 항원을 검출하기 위해 항체가 세포 내부에 접근해야 하는 경우 투과화가 필요하다. 용매 또는 세제는 일반적으로 투과성을 위해 사용됩니다.

용제 및 세제 지침

용제 아세톤 아세톤 고정도 투과성
메탄올 메탄올 고정은 투과성을 위해 사용될 수 있지만 항상 효과적인 것은 아닙니다.
세제 트리톤 X-100 또는 NP-40 PBS에서 0.1~0.2%만 10분 동안 사용
트윈 20, 사포닌, 디지토닌 및 류코페르m 10~30분 동안 0.2~0.5% 사용

IHC에는 종종 배경 신호 및 위양성을 줄이기 위한 하나 이상의 차단 단계가 포함됩니다. 이러한 단계에는 단백질 차단, 비오틴 차단, 내인성 효소 차단이 포함됩니다.

혈청 또는 단백질 차단 시약으로 차단하면 조직 또는 Fc 수용체에 대한 항체의 비특이적 결합을 방지할 수 있습니다. 혈청은 비특이적 부위에 결합하는 항체를 포함하기 때문에 일반적인 차단제입니다. 이차 항체의 종과 일치하는 혈청을 사용하는 것이 좋습니다. BSA 또는 카제인과 같은 단백질은 또한 비특이적 항체 결합을 차단하는 데 사용될 수 있으며, 이를 사용하면 시약을 2차 항체의 종과 일치시킬 필요가 없습니다.

비오틴 기반 검출 시스템을 사용하는 경우 내인성 비오틴을 차단하는 것이 좋습니다. 비오틴은 많은 조직, 특히 신장, 간 및 뇌에 존재합니다. 이는 조직을 아비딘으로 사전 배양하여 차단한 다음 비오틴과 함께 배양하여 아비딘 분자의 추가 비오틴 결합 부위를 차단합니다.

발색 검출 방법은 일반적으로 항체 국소화를 시각화하기 위해 2차 항체에 연결된 효소를 사용합니다. 효소가 연구 중인 조직에 자연적으로 존재하는 경우 검출 단계 전에 효소의 활성을 차단해야 합니다. 내인성 과산화효소 활성을 확인하기 위해 1차 항체 배양 전에 DAB 기질과 함께 조직을 배양할 수 있습니다. 조직이 갈색으로 변하면 내인성 과산화효소가 존재하고 차단 단계가 필요합니다. 0.3% 과산화수소에서 10-15분간 배양하면 일반적으로 충분한 차단이 됩니다. 조직은 BCIP/NBT와 함께 배양하여 내인성 알칼리 인산분해효소(AP)에 대해 테스트할 수 있습니다. 파란색이 관찰되면 내인성 AP가 존재하며 차단이 필요합니다. Levamisole은 차단에 사용되며 발색 기질과 함께 추가됩니다. 장의 AP는 1차 항체를 추가하기 전에 약산으로 차단됩니다.

IHC에서 직접 대 간접 감지

직접 검출 방법에서 1차 항체는 라벨에 직접 접합됩니다. 간접 검출을 위해 1차 항체는 1차 항체의 숙주 종에 대해 생성된 표지된 2차 항체에 의해 결합됩니다. 간접적인 방법에는 신호 강도를 증가시키는 증폭 단계가 포함될 수도 있습니다. 직접 또는 간접 검출의 선택은 종종 표적 항원의 발현 수준에 의해 규정됩니다.

그림 1 직접 및 간접 검출 방법의 비교. (부치왈로, 2010)

  • 단계가 더 적기 때문에 전반적으로 더 빠릅니다.
  • 비특이적 신호의 가능성이 적습니다.
  • 여러 2차 항체가 각 1차 항체에 결합하기 때문에 종종 더 강한 신호를 제공합니다.
  • 보조 장치를 교체하여 새로운 실험에 대한 라벨 유형 또는 검출 방법을 쉽게 변경할 수 있습니다.
  • 특히 모든 1차 항체가 동일한 종에서 만들어지는 경우 라벨링 시간과 비용을 절약할 수 있습니다.
  • 더 넓은 범위의 레이블에 대한 액세스를 제공합니다.
  • 1차 항체에 대한 표지의 결합은 표적 단백질에 결합하는 항체의 능력에 영향을 미칠 수 있습니다.
  • 모든 1차 항체에 라벨을 붙이면 시간과 비용이 추가됩니다.
  • 더 많은 비특이적 신호는 2차 항체가 얼룩의 다른 단백질에 결합함으로써 발생할 수 있습니다.
  • 추가 배양 및 세척 단계는 실험에 시간을 추가합니다.

IHC에서 발색 검출 대 형광 검출

  • 더 쉬운 다중화: 발색 염료보다 더 많은 색상과 더 좁은 방출 스펙트럼.
  • 더 나은 타겟 공동 위치: 형광 염료를 사용하면 공동 위치 타겟을 별도로 식별할 수 있습니다.
  • 더 높은 동적 범위: 동일한 슬라이드에서 희귀하고 풍부한 대상을 더 쉽게 시각화할 수 있습니다.
  • 더 적은 단계: 기질 추가를 위한 단계가 없습니다.
  • 낮은 감도: 효소 결합 항체 증폭 가능 ~을 통해 감도를 높이기 위한 간접 감지.
  • 광표백에 취약함: 빛에 노출되면 시간이 지남에 따라 형광 신호가 감소할 수 있습니다.
  • 더 높은 감도: 신호 증폭 ~을 통해 간접 발색 검출은 신호 강도를 증가시킵니다.
  • 더 오래 지속되는 신호: 발색성 얼룩은 형광색보다 광표백에 더 강합니다.
  • 어려운 타겟 동시 위치: 타겟이 동일한 위치에 있을 때 혼합 색상과 단일 색상을 구별하기 어렵습니다.
  • 좁은 동적 범위: 동일한 슬라이드에서 희귀하고 풍부한 대상을 시각화하기 어렵습니다.
  • 어려운 다중화: 형광 염료보다 더 적은 색상과 더 넓은 방출 스펙트럼.

신호 증폭 방법 요약

  • 기존의 간접 감지보다 더 높은 감도.
  • ABC에 비해 더 작은 복합 크기는 더 큰 조직 침투를 촉진합니다.
  • ABC 및 LSAB보다 감도가 높습니다.
  • ABC 및 LSAB보다 단계가 적습니다.

IHC는 여러 매개변수를 고려하고 최적화해야 하는 복잡한 실험입니다. 면역조직화학(IHC) 문제 해결은 일반적인 문제의 가능한 원인과 이를 해결하는 방법을 보여줍니다. 자세한 내용은 다음 해당 섹션을 참조하십시오.


유세포분석용 형광단

모든 형광단이 모든 항체 기반 애플리케이션에 적합한 것은 아닙니다. 예를 들어, PE는 밝더라도 쉽게 표백되므로 형광 이미징에 적합하지 않습니다.

유세포 분석 패널의 크기 증가로 인해 기존 유세포 분석에는 하나의 레이저에서 특정 여기 및 방출 파장을 갖는 밝은 형광단이 필요합니다. 그러나 스펙트럼 유세포 분석에는 패널에서 혼합 해제를 허용하는 고유한 스펙트럼 프로필이 필요합니다. 이러한 형광단은 패널에서 서로 호환되어야 하며 이상적으로는 광안정성이 있어야 하며 고정 시 형광 손실이 없어야 합니다.

새로운 독점 StarBright 염료를 포함하여 유세포 분석 호환 형광단에 대한 자세한 정보는 유세포 분석 형광단 페이지를 방문하십시오.


IVD 항체 개발 플랫폼

Creative Biolabs는 단일클론 및 다중클론 개발의 모든 단계를 포괄하는 완벽한 맞춤형 항체 서비스를 제공합니다. 우리는 다수의 바이오마커 단백질에 대한 항체를 생산하고 검증합니다. 연구 분야에는 암, 세포자멸사, 신경생물학, 면역학, 심혈관 질환 및 전염병이 포함됩니다. 당사는 다음을 포함한 맞춤형 항체 개발 서비스를 제공합니다.

  • 예상되는 친화도 및 특이성을 갖는 항체를 생성하기 위한 적절한 펩티드의 설계, 합성 및 접합.
  • 단일 클론 항체는 특정 숙주 요구 사항을 충족시키기 위해 마우스, 래트, 햄스터 또는 기타 종에서 생성될 수 있습니다.
  • 다클론 항체 서비스를 통해 다양한 숙주 종에서 항체를 생산할 수 있습니다.
  • ELISA 분석에 대해 일치하는 mAb-mAb, mAb-pAb 및 pAb-pAb 항체 쌍.
  • 하이브리도마 및 파지 디스플레이 기술 모두 맞춤형 항체 개발에 사용할 수 있습니다.
  • 전체 길이(종 및 이소타입 전환) 및 부분 길이(scFv, Fab, F(ab) 모두의 재조합 항체2, BsAb).
  • 항체 가변 영역 클로닝 및 시퀀싱, 항체 인간화 및 항체 최적화.
  • 기존 및 맞춤형 친화도 방법을 모두 사용하여 완전한 펩타이드 및 항체 정제 서비스를 제공합니다.

Creative Biolabs의 과학자들은 항체/단백질 접합의 전문가입니다. 당사 항체의 다른 접합체를 찾거나 자체 항체의 맞춤형 접합이 필요한 경우, 당사는 비교할 수 없는 빠른 처리 시간으로 경제적이고 고품질의 맞춤형 항체 접합 서비스를 제공할 수 있습니다. 당사의 항체/단백질/펩티드 접합 서비스의 특징은 다음과 같습니다.

  • 합텐, 운반체, 표지 및 효과기 효소에 대한 펩티드, 항체 또는 기타 단백질의 맞춤형 접합.
  • 단백질-단백질 접합체, 입자 접합체, 비오틴, 형광색소 및 특수 라벨과 같은 다양한 접합체 및 라벨 선택.
  • 여기에는 최종 제품의 라벨링, 정제 및 특성화가 포함됩니다.
  • 라벨링 가능성 및 반응 설계에 대한 포괄적인 조언.

고품질 면역분석의 선도적인 개발자로서, 크리에이티브 바이오랩 분석 및 면역 진단 키트 개발을 위한 항체 사용에 대한 다년간의 경험이 있습니다. 우리는 ELISA, 측면 흐름, 라텍스 비드, 웨스턴 블롯, 면역 조직 화학 및 유세포 분석 형식으로 진단 분석을 생성할 수 있습니다. 단백질 화학, 면역학 및 분자 생물학에 대한 전문 지식이 결합된 당사의 과학 팀은 설계에서 검증에 이르기까지 개발 프로세스의 모든 단계에서 귀하를 도울 수 있습니다.

Creative Biolabs에서 IVD 면역 분석 개발을 위한 일반적인 워크플로는 프로젝트 범위 지정, 분석 개발, 생산 및 제조의 세 단계로 나눌 수 있습니다.

IVD 항체 개발 서비스의 특징

  • 숙련된 기술 및 고객 지원 팀과 최첨단 시설이 뒷받침하는 품질.
  • 수많은 IVD 관련 프로젝트를 완료한 IVD 항체 및 키트 개발 전문 기업입니다.
  • 빠른 처리 시간과 경쟁력 있는 가격.
  • 모든 바이오마커에 대한 맞춤형 분석을 빠르고 경제적으로 제공하고 새로운 IVD 제품을 시장에 출시하십시오.

이러한 서비스에 대한 자세한 내용은 주저하지 말고 당사에 문의하십시오.


    1차 항체는 어떤 종에서 개발되었습니까?
    2차 항체는 1차 항체의 종에 대한 것입니다. 따라서 1차 항체의 숙주 종과 다른 종에서 자란 2차 항체가 필요합니다. 예를 들어 마우스에서 1차 항체가 생성된 경우 염소, 토끼 등에서 생성된 항-마우스 2차 항체가 필요합니다.

1차 항체의 클래스(아이소타입) 및/또는 하위 클래스는 무엇입니까?
이 질문은 단일 클론 항체로 작업할 때 주로 중요합니다. 그러나 다클론 항체는 일반적으로 IgG 부류의 면역글로불린입니다. 이러한 이유로 2차 항체는 주로 항-IgG 항체가 될 것입니다.

단클론항체는 생쥐에서 가장 흔하게 발생하며 때때로 쥐, 햄스터 또는 토끼에서 발생합니다. 예를 들어, 1차 단일클론 항체가 마우스 IgM인 경우 마우스 IgM과 반응하는 2차 항체(항-마우스 IgM)가 필요할 것입니다.

1차 모노클로날이 마우스 IgG 서브클래스 중 하나인 경우 거의 모든 항-마우스 IgG 2차 항체가 이에 결합해야 합니다. 1차 항체의 서브클래스가 알려지지 않은 경우 항-마우스 IgG F(ab) 2차 항체는 대부분의 마우스 면역글로불린 서브클래스를 인식하기 때문에 사용할 수 있습니다.

인간 및 마우스 IgG(들)의 많은 클래스 및 하위 클래스가 있습니다. 보조를 선택하는 것은 어려울 수 있습니다. 그러나 이러한 IgG(들) 중 하나의 공통 요소는 경쇄(카파 및 람다)입니다. 즉, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE는 모두 카파 또는 람다 경쇄를 가지고 있습니다. 그러나 중쇄는 클래스에 따라 다릅니다.

면역글로불린 클래스 및 하위 클래스 요약:
면역글로불린 클래스: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
인간 면역글로불린 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2
마우스 면역글로불린 서브클래스: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
경쇄: 카파, 람다
중쇄: IgG(감마), IgM(mu), IgA(알파), IgD(델타), IgE(엡실론)

항체 반응성에 대한 추가 정보:
다가: 모든 클래스와 반응
항-Fc 및 중쇄 특이적: 중쇄에만 반응하므로 클래스에 따라 다릅니다.
Anti-Fab 및 전체 분자 특이적: 중쇄 및 경쇄와 반응합니다. 경쇄 반응성으로 인해 모든 클래스와 반응할 수 있습니다.
경쇄(카파, 람다) 특이적: 모든 클래스가 동일한 카파 또는 람다 경쇄를 사용하므로 모든 클래스와 반응합니다.

나는 친화성 정제 항체 또는 IgG 분획을 사용합니까?
대부분의 사람들은 가장 적은 양의 비특이적 결합을 제공하기 때문에 친화성 분리된 이차 항체를 선호합니다. 그러나 특정 경우, 즉 관심 항원이 드물거나 소량 존재하는 경우 IgG 분획을 고려할 수 있습니다. 이러한 상황에서는 높은 친화도 항체가 필요합니다. 예를 들어, 친화력 분리 동안 매우 높은 친화도 항체 중 일부는 친화성 매트릭스에 너무 단단히 결합하여 용출될 수 없기 때문에 제거될 수 있습니다.

어떤 종류의 레이블을 선택합니까?
레이블은 응용 프로그램에 따라 매우 다릅니다. For immunoblotting and ELISA, enzyme-labeled secondary antibodies are the most popular. Peroxidase is economical and a more stable enzyme, in general, than alkaline phosphatase. It has also become very popular for use in chemiluminescent detection systems. Alkaline phosphatase, on the other hand, is considered more sensitive than peroxidase particularly when colorimetric detection is used.

For cell or tissue staining, alkaline phosphatase, peroxidase, or secondary antibodies conjugated to a fluorochrome may be used. Common fluorochromes are FITC, phycoerythrin, CF™ Dyes, Atto Dyes, and Quantum Red. Associated applications are immunocytochemistry/immunofluorescence, flow cytometry, or immunohistochemistry.

To generate increased amplification, a two-step biotin/avidin system may be used. Biotin binds with very high affinity to avidin, resulting in an essentially irreversible interaction. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin, ExtrAvidin, or streptavidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.

When should I use a pre-adsorbed secondary antibody?
Using pre-adsorbed antibodies will reduce non-specific background when working with tissues and cells. The process involves passing the secondary antibody over immobilized serum proteins from potentially cross reactive species. Therefore, if you are working with human tissues, choose a secondary antibody that has been adsorbed with human serum or human IgG.

When is a F(ab) or F(ab')2 fragment antibody necessary?
If working with tissues or cells that have Fc receptors, choose a F(ab) or F(ab')2 fragment when possible to eliminate non-specific binding. In more detail, F(ab')2 antibody fragments are used in assay systems where the presence of the Fc region may cause problems. Samples such as lymph nodes, spleen, and peripheral blood preparations contain cells with Fc receptors (macrophages, B lymphocytes, and natural killer cells), which could bind the Fc region of intact antibodies, causing high background staining. Use of F(ab')2 fragments ensures that any antibody binding observed is not due to Fc receptors.


Be prepared to validate on your own

Even the best characterized antibody that is beloved by the scientific literature and has enriched many a publication isn’t guaranteed to perform in your settings and your hands flawlessly. And you would limit your resources severely if you only consider antibodies validated exactly for your needs. You should always plan to validate an antibody on your own to some extent. Include the appropriate controls in your experiment to analyze the specificity of an antibody in your precise circumstances. A useful guide for very thorough antibody validation has been compiled by Bordeaux and colleagues. An increasing number of journals not only requires detailed information on the antibodies used in a study (such as name, clone, supplier, catalogue and even lot number), but is also encouraging proof of validation. It is in the interest of us all that scientific data generated with the help of antibodies is reliable and reproducible, but ultimately it is the researcher’s responsibility to use proven experimental tools.



코멘트:

  1. Bhreac

    오늘 저는 토론에 참여하도록 특별히 등록했습니다.

  2. Mejinn

    이 질문에 대해 상담 할 수 있습니다. 우리는 함께 결정을 찾을 수 있습니다.

  3. Gow

    그녀가 그것을 말하게하십시오 - 잘못된 길.

  4. Jennalyn

    내 생각에 당신은 옳지 않습니다. 입력하겠습니다. 오후에 저에게 편지를 보내 드리겠습니다.

  5. Hellekin

    정확하게 말씀해주셨어요 :)



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